Freeze Drying Process - Shelf Lyophilizer
Turn on the lyophilizer and start the condenser. If there is an external condenser using a dry ice/ethanol mixture then prepare this as well. The shelf can be set to 4°C.
Center the vials on the shelf. This placement is important so that the stoppering plate can evenly press on the stoppers following freeze drying.
Using either manual or programmed controls, freeze the samples down to -40°C. This step should take approximately 30-60 minutes and is very dependent upon the instrument. If the rate of freezing can be controlled, then a drop of 1°C per minute is a practical rate. Once the samples reach temperature, they should be visibly frozen (clear liquid turn opaque and skim milk appears solid).
Allow the sample to sit at -40°C for 1 hr to ensure complete freezing. Vials at the center of a cluster may freeze more slowly than those on the outside.
Turn on the vacuum pump. Within 10-20 minutes, the vacuum should be under 200 millitorr (mtorr). Depending on the instrument, pressure may be reported in mtorr, mbar, Pascal, or "inches Hg" on a vacuum gauge. For reference, 100 mtorr = 0.133 mbar = 13.3 Pascal = 29.9" Hg = 0.000132 atm = 99.99% vacuum.
Once the vacuum is below 200 mtorr, increase the temperature of the shelf for primary drying, the phase associated with water sublimation. The temperature of the shelf is dependent upon the lyophilization medium. For sucrose, keep the shelf temperature at -25°C. For Reagent 18 or Microbial Freeze Drying Buffer, the shelf can be as high as -15°C. In any case, the greater the difference in temperature between the shelf and the condenser/ice trap, the more efficient the primary drying process will be.
If melting of the samples occurs, then it might be necessary to empirically determine a shelf temperature. A practical means to do this involves placing a sample of the lyoprotective medium on a shelf and incrementally lowering the temperature every 15 minutes. At some point the sample freezes. Under vacuum with a cold trap, your sample will be safe and will remain frozen. This is a practical method and is certainly not necessarily the most efficient primary drying temperature, but it should work well enough.
Primary drying is the longest phase of the freeze drying process. The idea is to keep the sample colder than condenser (or ice trap) but still sufficiently warm so that water sublimes rapidly. The temperature of the shelf can be raised to above the melting temperature as long as the sublimation process removes the heat flowing into the sample sufficiently fast to prevent melting and sample collapse (where the matrix literally caves in). The time for primary drying will also depend upon the volume of the sample. For bacteria, samples rarely need to be large and typically are 0.25 to 0.5 ml. A limited number of samples (10-20) in a shelf dryer can be completed in just a couple of hours. A fully loaded dryer with several hundred samples will take longer. Safely, a primary drying period which is overnight should work, but test this first before you attempt to freeze dry large numbers of vials. As a standard guide, freeze dry overnight.
Samples still contain moisture following primary drying. The amount is debatable, but it somewhere between 2 and 4%. This moisture level needs to be reduced and that is done by pumping heat into the sample during the secondary drying phase. This phase is relatively short, lasting 1 to 2 hours, but important for long-term viability. However, over drying of the bacteria can be detrimental as well. Once again, based on the idiosyncrasies of your lyophilizer and samples, the ideal time for secondary drying needs to be determined experimentally. Generally, raise the shelf temperature to 20°C and dry for 2 hours.
With the vacuum in place, stopper the vials using the stoppering plate/mechanism. Release the vacuum, remove the vials, and further secure the rubber bungs/stoppers with foil crimp seals. It is best to store the vials at 4°C in the dark.
Test the freeze dried bacteria for viability as compared to the original culture (see link). Additionally, monitor the stability/viability of the freeze dried cultures by testing at 30, 90, 180 and 365 days. A good protocol will yield nearly 100% viable cells. Anything above 50% is considered acceptable by many labs. Skim milk will yield 10-20%. However, % viable after freeze drying is not as important as the number viable following storage. If viability starts to decline rapidly by a log or more per month, then modification of the protocol is probably necessary. Note that some strains are simply very difficult to freeze dry and no matter what, these may die off quickly following lyophilization.
หยุดกระบวนการอบแห้ง - หิ้ง lyophilizer
เปิด lyophilizer และเริ่มต้นคอนเดนเซอร์ ถ้ามีคอนเดนเซอร์ภายนอกโดยใช้ส่วนผสมน้ำแข็ง / เอทานอลที่แห้งแล้วเตรียมนี้เป็นอย่างดี หิ้งสามารถตั้งค่าให้ 4 ° c.
ศูนย์ขวดบนหิ้ง ตำแหน่งนี้เป็นสิ่งสำคัญที่แผ่น stoppering อย่างสม่ำเสมอสามารถกดบน Stoppers ต่อไปนี้การอบแห้งแช่แข็ง.
โดยใช้การควบคุมทั้งด้วยตนเองหรือโปรแกรมแช่แข็งตัวอย่างลงไปที่ -40 องศาเซลเซียส ขั้นตอนนี้ควรใช้เวลาประมาณ 30-60 นาทีและมากขึ้นอยู่กับเครื่องมือ ถ้าอัตราของการแช่แข็งสามารถควบคุมได้แล้วลดลง 1 องศาเซลเซียสต่อนาทีเป็นอัตราที่ปฏิบัติ เมื่อกลุ่มตัวอย่างถึงอุณหภูมิพวกเขาควรจะแช่แข็งอย่างเห็นได้ชัด (เปิดของเหลวใสขุ่นและนมพร่องมันเนยแข็งปรากฏ).
ให้ตัวอย่างที่จะนั่งอยู่ที่ -40 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 ชั่วโมงเพื่อให้แน่ใจว่าการแช่แข็งที่สมบูรณ์ ขวดที่เป็นศูนย์กลางของกลุ่มอาจหยุดได้ช้ากว่าผู้ที่อยู่ข้างนอก
เปิดปั๊มสูญญากาศ ภายใน 10-20 นาที, สูญญากาศที่ควรจะเป็นภายใต้ 200 millitorr (mtorr) ขึ้นอยู่กับตราสารที่ความดันอาจมีการรายงานใน mtorr, เอ็มบาร์, ปาสกาลหรือ "hg นิ้ว" บนมาตรวัดสูญญากาศ สำหรับการอ้างอิง 100 mtorr = 0133 เอ็มบาร์ = 13.3 ปาสกาล = 29.9 "hg = 0.000132 เอทีเอ็ม = 99.99% สูญญากาศ.
เมื่อสูญญากาศต่ำกว่า 200 mtorr เพิ่มอุณหภูมิของการเก็บรักษาหลักสำหรับการอบแห้งขั้นตอนที่เกี่ยวข้องกับการระเหิดน้ำ. อุณหภูมิของการเก็บรักษาเป็น ขึ้นอยู่กับขนาดกลาง lyophilization. เพื่อซูโครสรักษาอุณหภูมิการเก็บรักษาที่ -25 ° c. การกระทำ 18 หรือบัฟเฟอร์การอบแห้งแช่แข็งของจุลินทรีย์ชั้นสามารถจะสูงถึง -15 องศาเซลเซียส ในกรณีใด ๆ มากขึ้นความแตกต่างของอุณหภูมิระหว่างการเก็บรักษาและดักคอนเดนเซอร์ / น้ำแข็งมีประสิทธิภาพมากขึ้นกระบวนการอบแห้งหลักจะเป็น
ถ้าละลายของตัวอย่างที่เกิดขึ้นแล้วมันอาจจะจำเป็นที่จะต้องสังเกตุตรวจสอบอุณหภูมิการเก็บรักษาหมายถึงการปฏิบัติที่จะทำนี้เกี่ยวข้องกับการวางตัวอย่างของกลาง lyoprotective บนหิ้งและลดอุณหภูมิเพิ่มขึ้นทุก 15 นาที ในบางจุดค้างตัวอย่าง ภายใต้สูญญากาศกับดักเย็นตัวอย่างของคุณจะปลอดภัยและจะยังคงแช่แข็ง นี้เป็นวิธีการปฏิบัติและเป็นที่แน่นอนไม่จำเป็นต้องมีประสิทธิภาพมากที่สุดที่อุณหภูมิการอบแห้งหลักแต่มันควรจะทำงานได้ดีพอ
อบแห้งหลักคือขั้นตอนที่ยาวที่สุดของกระบวนการอบแห้งแช่แข็ง ความคิดที่จะเก็บตัวอย่างเย็นกว่าคอนเดนเซอร์ (หรือกับดักน้ำแข็ง) แต่ยังคงอบอุ่นพอเพื่อให้ระเหิดน้ำอย่างรวดเร็วอุณหภูมิของชั้นวางของที่สามารถยกขึ้นไปเหนืออุณหภูมิหลอมละลายตราบใดที่กระบวนการระเหิดเอาความร้อนที่ไหลเข้ามาในตัวอย่างรวดเร็วเพียงพอเพื่อป้องกันการละลายและการล่มสลายของกลุ่มตัวอย่าง (เมทริกซ์ที่แท้จริงในถ้ำ) เวลาในการอบแห้งเป็นหลักนอกจากนี้ยังจะขึ้นอยู่กับปริมาณของตัวอย่าง สำหรับแบคทีเรียตัวอย่างไม่ค่อยจำเป็นต้องมีขนาดใหญ่และมักจะเป็น 0.25-05 ml จำกัด จำนวนของตัวอย่าง (10-20) ในการเก็บรักษาเครื่องเป่าสามารถจะแล้วเสร็จในเวลาเพียงไม่กี่ชั่วโมง เครื่องเป่าแปล้หลายร้อยตัวอย่างจะใช้เวลานาน ได้อย่างปลอดภัยในช่วงเวลาการอบแห้งซึ่งเป็นหลักควรจะทำงานในชั่วข้ามคืน แต่การทดสอบครั้งแรกนี้ก่อนที่คุณพยายามที่จะแช่แข็งจำนวนมากแห้งของขวด เป็นคู่มือมาตรฐานแช่แข็งแห้งข้ามคืน.
กลุ่มตัวอย่างยังคงมีความชื้นต่อไปนี้การอบแห้งเป็นหลัก จำนวนเงินที่เป็นที่ถกเถียงกัน แต่มันอยู่ที่ไหนสักแห่งระหว่าง 2 และ 4% ระดับความชื้นนี้จะต้องลดลงและที่จะกระทำโดยการสูบน้ำร้อนเป็นตัวอย่างในระหว่างขั้นตอนการอบแห้งรอง ขั้นตอนนี้จะค่อนข้างสั้น, นาน 1 ถึง 2 ชั่วโมง แต่สิ่งที่สำคัญสำหรับชีวิตในระยะยาว แต่ผ่านการอบแห้งของแบคทีเรียที่สามารถเป็นอันตรายเช่นกันอีกครั้งขึ้นอยู่กับนิสัยของ lyophilizer และตัวอย่างของคุณเวลาที่เหมาะสำหรับการอบแห้งที่สองจะต้องมีการพิจารณาการทดลอง โดยทั่วไปเพิ่มอุณหภูมิการเก็บรักษาถึง 20 องศาเซลเซียสและแห้ง 2 ชั่วโมง
ด้วยสูญญากาศในสถานที่ปิดขวดโดยใช้แผ่น stoppering / กลไก สูญญากาศปล่อยให้เอาขวด,และต่อไปรักษาความปลอดภัย bungs ยาง / Stoppers ด้วยฟอยล์จีบซีล มันเป็นสิ่งที่ดีที่สุดเพื่อเก็บขวดที่ 4 องศาเซลเซียสในที่มืด.
ทดสอบแบคทีเรียแช่แข็งแห้งเพื่อความมีชีวิตเมื่อเทียบกับวัฒนธรรมเดิม (จะเห็นลิงค์) นอกจากนี้ยังตรวจสอบความมั่นคง / มีศักยภาพในการแช่แข็งแห้งวัฒนธรรมโดยการทดสอบที่ 30, 90, 180 และ 365 วัน โปรโตคอลที่ดีจะให้เซลล์ทำงานได้เกือบ 100%อะไรสูงกว่า 50% ถือว่าได้รับการยอมรับโดยห้องปฏิบัติการจำนวนมาก นมพร่องมันเนยจะให้ 10-20% แต่% ทำงานได้หลังจากการอบแห้งแช่แข็งไม่ได้ที่สำคัญเป็นจำนวนการจัดเก็บต่อไปนี้ทำงานได้ ถ้าชีวิตจะเริ่มต้นที่จะลดลงอย่างรวดเร็วจากการบันทึกหรือมากกว่าต่อเดือนแล้วการปรับเปลี่ยนของโปรโตคอลน่าจะเป็นสิ่งที่จำเป็น ทราบว่าบางสายพันธุ์เป็นเพียงเรื่องยากมากที่จะแช่แข็งแห้งและไม่ว่าสิ่งที่เหล่านี้อาจตายออกได้อย่างรวดเร็วต่อไปนี้ lyophilization
การแปล กรุณารอสักครู่..