Aesculin wird in der Mikrobiologie zur Identifizierung bestimmter Bakterien, insbesondere von Enterokokken, verwendet. Enterokokken haben die Eigenschaft, Aesculin zu Glucose und Aesculetin zu hydrolysieren. In Gegenwart von Eisen(III)-Ionen bildet das Aesculetin einen olivgrünen bis schwarzen Komplex. Dieser Nachweis wird als Äskulinspaltung oder Esculinhydrolyse bezeichnet.