1. IntroductionLipases, or triacylg

1. Introduction
Lipases, or triacylglycerol acyl ester hydrolases (EC 3.1.1.3), are enzymes possessing an intrinsic capacity to catalyze the cleavage of carboxyl ester bonds in tri-, di-, and monoacylglycerols (the major constituents of animal, plant, and microbial fats and oils) [1]. Generally, lipase can catalyze a wide range of reactions, such as hydrolysis, transesterification, alcoholysis, acidolysis and esterification [2], [3], [4] and [5]. More than 50 lipases have been identified and they have tremendous application potential in food industry, medicine, hygiene, chemistry, chemical engineering, environmental protection and energy development [6], [7], [8], [9] and [10]. For lipases practical applications in industrial, their catalytic activity must be understood. Thus, establishing convenient and accurate methods for measuring lipase activity is of vital importance.

The catalysis systems of lipase may be divided into two categories: aqueous-based mediums and organic mediums [11], [12] and [13]. Commonly, lipase is a water-soluble enzyme, with good solubility and stability in the aqueous phase. However, the substrates of lipase are often insoluble in water. Thus, substrates should first be dissolved in organic solvents and subsequently mixed with buffer. According to previous reports, the substrate mixtures prepared by this method are always two-phase systems, and additives are included in order to improve the uniformity and stability of these metastable mixtures [14] and [15]. However, many studies have reported that surfactants influence lipase activity, with various activation or inhibition effects [16], [17] and [18]. In organic mediums, lipases are usually directly added to an organic solvent that also contains dissolved substrate [19]. This method is advantageous because the substrate is soluble and the mixture is stable. Unfortunately, protein molecules have both denature feature and conformational flexibility, which lead to their activity reduce in the presence of organic solvents [20] and [21]. Based on the discussion above, it is necessary to design a suitable method for the measurement of lipase activity.

Our study focused on the design of an aqueous-based substrate solution without additives for the determination of lipase catalytic properties. We test several solvents and ethanol was chosen as an appropriate solvent to dissolve p-NPP for the following reasons: first, it is miscible with water at any volume fraction. Second, p-NPP dissolves well in ethanol [14]. Finally, ethanol is a relative high polarity organic solvent and has less influence on lipase conformation compared with 2-propanol, which is a solvent of the substrate in previously reported methods [22]. In this work, a uniform solution was prepared by mixing a p-NPP ethanol solution with a certain volume of buffer at 65 °C. Then, this solution was equilibrated at a certain temperature and subsequently used for the measurement of enzymatic activity. Moreover, lipase from Candida rugosa was used to investigate the hydrolysis of p-NPP in this particular aqueous-based solution. After the enzyme-catalytic reaction, the amount of liberated product in the uniform solution was directly measured with an ultraviolet–visible (UV) spectrophotometer. Factors that affect enzyme activity, such as the volume proportion of water/ethanol, reaction time, p-NPP and lipase concentrations, temperature, pH and agitation rate were all investigated in this work. In addition, we also determined the catalytic parameters in this aqueous-based solution.

2. Materials and methods
2.1. Materials

Lipase powder from C. rugosa (1150 units/mg solid), Bradford reagent, bovine serum albumin (BSA, molecular mass: 67,000 Da) and p-NPP were obtained from Sigma–Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) and used as received. KH2PO4, Na2HPO4, NaCl and KCl were obtained from Chemsynlab Pharmaceutical Science & Technology (Beijing, China). All other chemicals were of analytical grade and used without further purification. The water used in all experiments was deionized and ultrafiltered in order to obtain a resistance of 18 MΩ cm with a TKA MicroPure water system. The phosphate buffer solution (PBS, 0.05 M) was prepared with NaCl (8.5 mg/mL), Na2HPO4 (2.2 mg/mL) and NaH2PO4 (0.4 mg/mL), and NaOH/HCl was used to adjust the pH.

2.2. Preparation of the homogeneous aqueous-based solution

Following standard protocols, p-NPP was dissolved in ethanol in a 50-mL Erlenmeyer flask and heated to 65 °C to form the p-NPP solution at the concentrations of 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.5, 2.0 mg/mL. Then, PBS (0.05 M) of 65 °C was cautiously and dropwise added. The resulting mixture was in a metastable state and the soluble p-NPP molecular may aggregate with the storage time and the change of temperature. The prepared mixture should be used timely in order to avoid the phase separation. Dynamic light scattering (DLS) was used to characterize the substrate states in this media stored at room temperature at several different equilibration times.

2.3. Analysis of lipase secondary structure via Circular Dichroism (CD) spectroscopy

Circular Dichroism (CD) spectroscopy was used for the examination of lipase structures in different solutions, which were recorded on a spectropolarimeter (MOS-450 AF/AF-CD, Bio-Logic, France) using a 0.2 cm quartz cuvette. For those three lipase different solution, lipase powder (3 mg/mL) was diluted in PBS (pH 7.0, 0.05 M), ethanol/PBS (pH 7.0, 0.05 M) (v:v, 1:1) and 2-propanol/PBS (pH 7.0, 0.05 M) (v:v, 1:1), respectively. Then, those solutions were centrifuged at 400 rpm for 5 min to remove insoluble impurities. The cell holder compartment was maintained in a nitrogen atmosphere at room temperature. At least five spectra were measured and the average was recorded.

2.4. Lipase activity measurement with a UV-spectrophotometer

An aqueous enzyme solution (PBS, 0.05 M, pH 7.0) of lipase (3 mg/mL) was centrifuged at 400 rpm for 5 min to remove any insoluble impurities. The protein concentration in the solution was determined using Coomassie Brilliant Blue reagent, following Bradford's method [23]. BSA was used as a standard to construct a calibration curve. The prepared homogeneous solution was pre-equilibrated at a determined temperature for a certain time. The catalytic reaction was initiated by adding an enzyme solution. Sodium carbonate solution (0.5 M) of the same volume was added to terminate the reaction (the pH value for this solution was 11.8) and enhance the detection sensitivity after the catalytic reacted for a certain time. Finally, the lipase catalytic activity was calculated from the absorbance of this mixture at an appropriate dilution in phosphate buffer against the blank without enzyme using a UV spectrophotometer (UV-1610, Shimadzu. Japan) at 410 nm. This was measured as one enzyme unit was the amount of protein liberating 1.0 μmol p-NP/min under these conditions. Each treatment was measured in at least three parallel experiments and the average was recorded.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

1. บทนำLipases, triacylglycerol acyl เอส hydrolases (EC 3.1.1.3), จะมีการผลิต intrinsic เพื่อสถาบันความแตกแยกของพันธบัตรเอส carboxyl ตรี- ดี- และ monoacylglycerols (constituents สำคัญสัตว์ พืช จุลินทรีย์ไขมัน และน้ำมัน) เอนไซม์ [1] ทั่วไป เอนไซม์ไลเปสสามารถสถาบันหลากหลายปฏิกิริยา ไฮโตรไลซ์ เพิ่ม alcoholysis, acidolysis และ esterification [2], [3], [4] [5] Lipases มากกว่า 50 ได้รับการระบุ และพวกเขามีมหาศาลแอพลิเคชันที่มีศักยภาพในอุตสาหกรรมอาหาร ยา สุขอนามัย เคมี วิศวกรรมเคมี อนุรักษ์สิ่งแวดล้อม และการพัฒนาพลังงาน [6], [7], [8], [9] [10] และ สำหรับ lipases ประยุกต์ใช้งานจริงในอุตสาหกรรม ต้องความเข้าใจกิจกรรมของตัวเร่งปฏิกิริยา ดังนั้น กำหนดวิธีการสะดวก และแม่นยำในการวัดกิจกรรมของเอนไซม์ไลเปสเป็นของหัวใจระบบการเร่งปฏิกิริยาของเอนไซม์ไลเปสอาจแบ่งออกเป็นสองประเภท: mediums อควีตามและอินทรีย์ mediums [11], [12] [13] และได้ ทั่วไป เอนไซม์ไลเปสเป็นเอนไซม์ที่ละลายใน ละลายดีและความมั่นคงในระยะอควี อย่างไรก็ตาม พื้นผิวของเอนไซม์ไลเปสมักละลายในน้ำ ดังนั้น พื้นผิวก่อนควรละลายในอินทรีย์ และในเวลาต่อมาผสมกับบัฟเฟอร์ ตามรายงานก่อนหน้านี้ น้ำยาผสมพื้นผิวที่เตรียม โดยวิธีนี้มัก two-phase ระบบ และสารที่มีอยู่เพื่อปรับปรุงความรื่นรมย์และความเสถียรของส่วนผสมเหล่านี้ metastable [14] [15] อย่างไรก็ตาม ในการศึกษาได้รายงานการว่า surfactants มีอิทธิพลต่อเอนไซม์ไลเปส กับกิจกรรมต่าง ๆ การเปิดใช้งานหรือยับยั้งผล [16], [17] [18] และ ในอินทรีย์ mediums, lipases โดยตรงมักจะบวกให้เป็นตัวทำละลายอินทรีย์ที่ประกอบด้วยพื้นผิวละลาย [19] วิธีการนี้มีประโยชน์เนื่องจากพื้นผิวไม่ละลายน้ำ และส่วนผสมไม่มีเสถียรภาพ อับ โมเลกุลโปรตีนมีทั้ง denature คุณลักษณะและความยืดหยุ่น conformational ที่รอคอยกับกิจกรรมของพวกเขาลดในต่อหน้าของหรือสารทำละลายอินทรีย์ [20] และ [21] ตามคำอธิบายด้านบน จำเป็นต้องออกแบบวิธีที่เหมาะสมสำหรับการวัดกิจกรรมของเอนไซม์ไลเปสเราเน้นการออกแบบโซลูชันอควีตามพื้นผิวไม่มีสารเติมแต่งสำหรับการกำหนดคุณสมบัติของตัวเร่งปฏิกิริยาเอนไซม์ไลเปส เราทดสอบหลายหรือสารทำละลาย และเอทานอลได้รับเลือกเป็นตัวทำละลายเหมาะสมให้ละลาย p NPP เหตุผลต่อไปนี้: ครั้งแรก มันเป็น miscible น้ำที่ปริมาณเศษใด ๆ สอง p NPP ละลายในเอทานอล [14] สุดท้าย เอทานอลเป็นตัวทำละลายอินทรีย์ขั้วสัมพัทธ์สูง และมีเอนไซม์ไลเปส conformation อิทธิพลน้อยกว่าเมื่อเทียบกับ 2-อย่างไร propanol ซึ่งเป็นตัวทำละลายของพื้นผิวในวิธีรายงานไปก่อนหน้านี้ [22] ในงานนี้ ปัญหาเครื่องแบบถูกเตรียม โดยผสมปัญหาเอทานอล p NPP ด้วยปริมาณของบัฟเฟอร์ที่ 65 องศาเซลเซียส แล้ว โซลูชันนี้ถูก equilibrated ที่อุณหภูมิหนึ่ง และต่อมาใช้สำหรับการวัดกิจกรรมของเอนไซม์ในระบบ นอกจากนี้ เอนไซม์ไลเปสจาก Candida งูเหนือถูกใช้เพื่อตรวจสอบไฮโตรไลซ์ของ p-NPP ในนี้เฉพาะอควีโซลูชั่น หลังปฏิกิริยาตัวเร่งปฏิกิริยาเอนไซม์ จำนวนผลิตภัณฑ์ liberated ในโซลูชันรูปถูกตรงวัด ด้วยเครื่องทดสอบกรดด่างการ (UV) รังสีอัลตราไวโอเลต – มองเห็น ปัจจัยที่มีผลต่อเอนไซม์ เช่นสัดส่วนปริมาณของน้ำ/เอทานอล เวลาตอบสนอง ความเข้มข้นของ p-NPP และเอนไซม์ไลเปส อุณหภูมิ pH และอาการกังวลต่ออัตรา ทั้งหมดถูกตรวจสอบในงานนี้ นอกจากนั้น เรายังถูกกำหนดพารามิเตอร์ตัวเร่งปฏิกิริยาในโซลูชันนี้ใช้อควี2. วัสดุและวิธีการ2.1. วัสดุผงเอนไซม์ไลเปสจาก C. งูเหนือ (1150 หน่วย/มิลลิกรัมแข็ง), รีเอเจนต์แบรดฟอร์ด วัว serum albumin (บีเอสเอ มวลโมเลกุล: 67,000 Da) และ p-NPP ได้รับจาก บริษัทเคมี Aldrich – ซิก (St. Louis, MO สหรัฐอเมริกา) และใช้เป็นที่รับ KH2PO4, Na2HPO4, NaCl และ KCl ได้รับมาจาก Chemsynlab ยาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี (ปักกิ่ง จีน) สารเคมีอื่น ๆ ได้เกรดวิเคราะห์ และใช้โดยไม่ต้องฟอกเพิ่มเติม น้ำที่ใช้ในการทดลองทั้งหมดถูก deionized และ ultrafiltered เพื่อให้ได้ความต้านทานของ 18 MΩ ซม.ด้วยระบบน้ำ TKA MicroPure การแก้ปัญหาบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS, 0.05 M) ถูกเตรียม NaCl (8.5 mg/mL), Na2HPO4 (2.2 mg/mL) และ NaH2PO4 (0.4 mg/mL), และใช้ NaOH/HCl เพื่อปรับ pH2.2 การเตรียมเหมือนอควีโซลูชั่นต่อไปนี้โพรโทคอลมาตรฐาน p NPP ละลายในเอทานอลในการ 50 mL Erlenmeyer หนาว และอุณหภูมิ 65 ° C เพื่อสร้างโซลูชัน p NPP ที่ความเข้มข้น 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.5, 2.0 mg/mL , PBS (0.05 M) 65 องศาเซลเซียสเดิน และ dropwise เพิ่มด้วย ส่วนผสมผลลัพธ์อยู่ใน metastable และการละลาย p-NPP โมเลกุลอาจรวมกับการเปลี่ยนแปลงของอุณหภูมิและเวลาเก็บ ส่วนผสมที่เตรียมไว้ควรจะใช้ทันเวลาเพื่อหลีกเลี่ยงการแยกเฟส แบบไดนามิกแสง scattering (DLS) ถูกใช้เพื่ออเมริกาพื้นผิวในสื่อนี้เก็บไว้ที่อุณหภูมิห้องในเวลา equilibration ต่าง ๆ หลายแห่ง2.3 การวิเคราะห์โครงสร้างรองของเอนไซม์ไลเปสผ่านกกลม Dichroism (ซีดี)วงกลมก Dichroism (ซีดี) ใช้สำหรับตรวจสอบโครงสร้างของเอนไซม์ไลเปสในการแก้ไขปัญหาที่แตกต่างกัน ซึ่งถูกบันทึกไว้ใน spectropolarimeter (MOS-450 AF AF-ซี ไบโอตรรกะ ฝรั่งเศส) ใช้ cuvette ควอตซ์เป็น 0.2 cm ที่ 3 เอนไซม์ไลเปสอื่นโซลูชัน ผงเอนไซม์ไลเปส (3 mg/mL) ถูกผสมใน PBS (pH 7.0, 0.05 M), เอทานอล (pH 7.0, 0.05 M) PBS (v: v, 1:1) 2-อย่างไร propanol/PBS (pH 7.0, 0.05 M) และ (v: v, 1:1), ตามลำดับ แล้ว โซลูชั่นเหล่านั้นได้ centrifuged ที่ 400 rpm สำหรับ 5 นาทีเพื่อเอาสิ่งสกปรกที่ไม่ละลายน้ำ ช่องใส่เซลล์ถูกรักษาในบรรยากาศไนโตรเจนที่อุณหภูมิห้อง น้อยห้าแรมสเป็คตราถูกวัด และบันทึกค่าเฉลี่ย2.4 ประเมินกิจกรรมเอนไซม์ไลเปส ด้วยการ UV-เครื่องทดสอบกรดด่างในโซลูชันอควีเอนไซม์ (PBS, 0.05 M, pH 7.0) ของเอนไซม์ไลเปส (3 mg/mL) ถูก centrifuged ที่ 400 rpm สำหรับ 5 นาทีเพื่อเอาสิ่งสกปรกใด ๆ ขึ้น ความเข้มข้นของโปรตีนในการแก้ปัญหาที่ถูกกำหนดโดยใช้รีเอเจนต์ Coomassie Brilliant Blue ตามวิธีของแบรดฟอร์ด [23] บีเอสเอถูกใช้เป็นมาตรฐานในการสร้างเส้นโค้งเทียบ เตรียมแก้ปัญหาเหมือนได้ equilibrated ก่อนที่อุณหภูมิที่กำหนดเป็นระยะเวลาหนึ่ง เริ่มปฏิกิริยาตัวเร่งปฏิกิริยา ด้วยการเพิ่มเอนไซม์ในโซลูชัน โซเดียมคาร์บอเนตโซลูชั่น (0.5 M) ของไดรฟ์ข้อมูลเดียวกันถูกเพิ่มเข้าไปยุติปฏิกิริยา (ค่า pH สำหรับโซลูชันนี้เป็น 11.8) และเพิ่มความไวในการตรวจสอบหลังจากที่ตัวเร่งปฏิกิริยาปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นเป็นระยะเวลาหนึ่ง สุดท้าย กิจกรรมตัวเร่งปฏิกิริยาของเอนไซม์ไลเปสคำนวณ absorbance ของผสมนี้ในการเจือจางที่เหมาะสมในฟอสเฟตบัฟเฟอร์กับว่างเปล่า โดยไม่มีเอนไซม์ใช้เครื่องทดสอบกรดด่างเป็นรังสียูวี (UV-1610, Shimadzu ญี่ปุ่น) ที่ 410 nm นี้ถูกวัดเป็นหน่วยเอนไซม์ จำนวนโปรตีนที่ปลด 1.0 μmol p-NP/นาที ภายใต้เงื่อนไขเหล่านี้ ทรีตเมนท์ถูกวัดในทดลองน้อย 3 ขนาน และบันทึกค่าเฉลี่ย

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

1.
บทนำไลเปสหรือเอสเตอร์triacylglycerol hydrolases acyl (EC 3.1.1.3) เป็นเอนไซม์ที่มีกำลังการผลิตที่แท้จริงเพื่อกระตุ้นความแตกแยกของพันธบัตรเอสเตอร์ carboxyl ในไตร, ดิและ monoacylglycerols (องค์ประกอบที่สำคัญของสัตว์พืชและ จุลินทรีย์ไขมันและน้ำมัน) [1] โดยทั่วไปสามารถกระตุ้นเอนไซม์ไลเปสที่หลากหลายในการเกิดปฏิกิริยาเช่นการย่อยสลาย, transesterification, alcoholysis, acidolysis และ esterification [2], [3] [4] และ [5] มากกว่า 50 ไลเปสได้รับการระบุและพวกเขามีศักยภาพในการประยุกต์ใช้อย่างมากในอุตสาหกรรมอาหาร, ยา, สุขอนามัย, เคมี, วิศวกรรมเคมี, การคุ้มครองสิ่งแวดล้อมและการพัฒนาพลังงาน [6] [7] [8] [9] และ [10] . สำหรับไลเปสการใช้งานจริงในอุตสาหกรรมการเร่งปฏิกิริยาของพวกเขาจะต้องเข้าใจ . ดังนั้นการสร้างวิธีการที่สะดวกและถูกต้องสำหรับการวัดกิจกรรมเอนไซม์ไลเปสมีความสำคัญสำคัญระบบการเร่งปฏิกิริยาของเอนไซม์ไลเปสอาจแบ่งออกเป็นสองประเภท: สื่อน้ำที่ใช้และสื่ออินทรีย์ [11] [12] และ [13] ปกติเอนไซม์ไลเปสเป็นเอนไซม์ที่ละลายน้ำได้มีการละลายที่ดีและมั่นคงในเฟสน้ำ แต่พื้นผิวของเอนไซม์ไลเปสมักจะไม่ละลายในน้ำ ดังนั้นพื้นผิวควรจะละลายในตัวทำละลายอินทรีย์และต่อมาผสมกับบัฟเฟอร์ ตามที่รายงานก่อนหน้าผสมสารตั้งต้นที่จัดทำโดยวิธีนี้มักจะมีระบบสองเฟสและสารเติมแต่งจะรวมอยู่ในเพื่อที่จะปรับปรุงความสม่ำเสมอและความมั่นคงของผสม metastable เหล่านี้ [14] และ [15] อย่างไรก็ตามการศึกษาจำนวนมากได้รายงานว่าลดแรงตึงผิวกิจกรรมเอนไซม์ไลเปสมีอิทธิพลต่อการเปิดใช้งานต่างๆหรือการยับยั้ง [16] [17] และ [18] ในสื่ออินทรีย์ไลเปสมักจะเพิ่มโดยตรงกับตัวทำละลายอินทรีย์ที่ยังมีพื้นผิวละลาย [19] วิธีนี้เป็นวิธีที่ได้เปรียบเพราะพื้นผิวละลายและส่วนผสมที่มีเสถียรภาพ แต่น่าเสียดายที่โมเลกุลของโปรตีนที่มีทั้งคุณลักษณะที่ทำให้ผิดลักษณะเดิมและมีความยืดหยุ่นโครงสร้างซึ่งนำไปสู่การลดกิจกรรมของพวกเขาในการปรากฏตัวของตัวทำละลายอินทรีย์ [20] และ [21] ขึ้นอยู่กับการสนทนาข้างต้นก็เป็นสิ่งจำเป็นในการออกแบบวิธีการที่เหมาะสมสำหรับการตรวจวัดของกิจกรรมไลเปส. การศึกษาของเรามุ่งเน้นไปที่การออกแบบวิธีการแก้ปัญหาน้ำสารตั้งต้นที่ใช้โดยไม่ต้องเติมสำหรับการกำหนดคุณสมบัติของตัวเร่งปฏิกิริยาไลเปส เราจะทดสอบตัวทำละลายหลายแห่งและเอทานอลได้รับเลือกเป็นตัวทำละลายที่เหมาะสมที่จะละลายพีเอ็นพีพีด้วยเหตุผลต่อไปนี้: แรกเป็นละลายด้วยน้ำปริมาณในส่วนใด ๆ ประการที่สอง, p-NPP ละลายได้ดีในเอทานอล [14] สุดท้ายเอทานอลเป็นขั้วสูงญาติตัวทำละลายอินทรีย์และมีอิทธิพลน้อยลงในโครงสร้างเอนไซม์ไลเปสเมื่อเทียบกับ 2 โพรพานซึ่งเป็นตัวทำละลายของสารตั้งต้นในวิธีการรายงานก่อนหน้านี้ [22] ในงานนี้เป็นทางออกที่เครื่องแบบถูกจัดทำขึ้นโดยการผสมการแก้ปัญหาเอทานอลพีเอ็นพีพีที่มีปริมาณบางอย่างของบัฟเฟอร์ที่ 65 ° C จากนั้นการแก้ปัญหานี้ได้รับการ equilibrated ที่อุณหภูมิบางอย่างและนำมาใช้สำหรับการตรวจวัดของกิจกรรมเอนไซม์ นอกจากนี้เอนไซม์ไลเปสจาก Candida rugosa ถูกใช้ในการตรวจสอบการย่อยของพีเอ็นพีพีในการแก้ปัญหาน้ำตามนี้โดยเฉพาะ หลังจากปฏิกิริยาเอนไซม์ที่เร่งปฏิกิริยาจำนวนของผลิตภัณฑ์ที่มีอิสรเสรีในการแก้ปัญหาเครื่องแบบวัดโดยตรงกับรังสีอัลตราไวโอเลตมองเห็น (UV) spectrophotometer ปัจจัยที่มีผลต่อการทำงานของเอนไซม์เช่นสัดส่วนปริมาณน้ำ / เอทานอลเวลาปฏิกิริยา, p-NPP และความเข้มข้นของเอนไซม์ไลเปส, อุณหภูมิและพีเอชอัตราการกวนถูกตรวจสอบทั้งหมดในงานนี้ นอกจากนี้เรายังกำหนดค่าพารามิเตอร์ตัวเร่งปฏิกิริยาในการแก้ปัญหาน้ำตามนี้. 2 วัสดุและวิธีการ2.1 วัสดุผงเอนไซม์ไลเปสจากซี rugosa (1,150 หน่วย / mg แข็ง), น้ำยาแบรดฟอเซรั่มอัลบูมิวัว (BSA มวลโมเลกุล: 67,000 ดา) และพีเอ็นพีพีที่ได้รับจาก Sigma-Aldrich เคมี จำกัด (เซนต์หลุยส์, สหรัฐอเมริกา) และใช้เป็นที่ได้รับ KH2PO4, Na2HPO4, โซเดียมคลอไรด์และโพแทสเซียมคลอไรด์ที่ได้รับจาก Chemsynlab เภสัชกรรมวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี (Beijing, China) สารเคมีอื่น ๆ ทั้งหมดเป็นของเกรดวิเคราะห์และใช้โดยไม่บริสุทธิ์ต่อไป น้ำที่ใช้ในการทดลองทั้งหมด deionized ultrafiltered และเพื่อให้ได้ความต้านทาน 18 MΩซม. ที่มีระบบน้ำ TKA MicroPure สารละลายบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (พีบีเอส, 0.05 M) ถูกจัดทำขึ้นด้วยโซเดียมคลอไรด์ (8.5 มิลลิกรัม / มิลลิลิตร), Na2HPO4 (2.2 มิลลิกรัม / มิลลิลิตร) และ NaH2PO4 (0.4 มิลลิกรัม / มิลลิลิตร) และ NaOH / HCl ถูกใช้ในการปรับค่า pH. 2.2 การเตรียมความพร้อมของการแก้ปัญหาน้ำที่ใช้เป็นเนื้อเดียวกันดังต่อไปนี้โปรโตคอลมาตรฐาน, p-NPP ถูกละลายในเอทานอลในขวด Erlenmeyer 50 มิลลิลิตรและให้ความร้อนถึง 65 ° C ถึงรูปแบบการแก้ปัญหาพีเอ็นพีพีที่ความเข้มข้น 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 , 1.0, 1.5, 2.0 มิลลิกรัม / มิลลิลิตร จากนั้นพีบีเอส (0.05 M) จาก 65 องศาเซลเซียสเป็นความระมัดระวังและเพิ่ม dropwise ผสมทำให้อยู่ในสภาพ metastable และละลายน้ำโมเลกุลพีเอ็นพีพีอาจรวมกับเวลาการเก็บรักษาและการเปลี่ยนแปลงของอุณหภูมิ ส่วนผสมที่เตรียมไว้ควรจะใช้ในเวลาที่เหมาะสมเพื่อหลีกเลี่ยงการแยกเฟส กระเจิงแสงแบบไดนามิก (DLS) ได้ถูกใช้ในลักษณะรัฐสารตั้งต้นในสื่อนี้เก็บไว้ที่อุณหภูมิห้องในช่วงเวลาที่แตกต่างกันหลายสมดุล. 2.3 การวิเคราะห์ของเอนไซม์ไลเปสโครงสร้างทุติยภูมิผ่านเวียน dichroism (CD) สเปคโทรเวียน dichroism (CD) สเปกโทรสโกที่ใช้สำหรับการตรวจสอบโครงสร้างของเอนไซม์ไลเปสในการแก้ปัญหาที่แตกต่างกันซึ่งได้รับการบันทึกไว้ใน spectropolarimeter (MOS-450 AF / AF-CD, ไบโอลอจิก ฝรั่งเศส) โดยใช้ 0.2 ซม cuvette ควอทซ์ สำหรับผู้ที่สามเอนไซม์ไลเปสวิธีการแก้ปัญหาที่แตกต่างกัน, ผงเอนไซม์ไลเปส (3 มิลลิกรัม / มิลลิลิตร) ถูกเจือจางในพีบีเอส (pH 7.0, 0.05 M), เอทานอล / พีบีเอส (pH 7.0, 0.05 M) (V: V, 1: 1) และ 2 โพรพาน / พีบีเอส (pH 7.0, 0.05 M) (V: V, 1: 1) ตามลำดับ จากนั้นการแก้ปัญหาที่ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 400 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 5 นาทีเพื่อขจัดสิ่งสกปรกที่ไม่ละลายน้ำ ช่องมือถือผู้ถือถูกเก็บรักษาไว้ในชั้นบรรยากาศไนโตรเจนที่อุณหภูมิห้อง อย่างน้อยห้าสเปกตรัมถูกวัดและค่าเฉลี่ยได้รับการบันทึก. 2.4 การวัดกิจกรรมเอนไซม์ไลเปสที่มี UV-spectrophotometer วิธีการแก้ปัญหาน้ำเอนไซม์ (พีบีเอส, 0.05 m, pH 7.0) ของเอนไซม์ไลเปส (3 มิลลิกรัม / มิลลิลิตร) ได้รับการหมุนเหวี่ยงที่ 400 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 5 นาทีเพื่อขจัดสิ่งสกปรกที่ไม่ละลายน้ำใด ๆ ความเข้มข้นของโปรตีนในการแก้ปัญหาที่ได้รับการพิจารณาโดยใช้น้ำยาสีฟ้าสดใส Coomassie ตามวิธีการของแบรดฟอ [23] บีเอสเอที่ใช้เป็นมาตรฐานในการสร้างเส้นโค้งการสอบเทียบ วิธีการแก้ปัญหาที่เป็นเนื้อเดียวกันได้รับการเตรียมความพร้อมก่อน equilibrated ที่อุณหภูมิที่กำหนดเป็นเวลาที่แน่นอน ปฏิกิริยาที่เร่งปฏิกิริยาได้ริเริ่มวิธีการแก้ปัญหาโดยการเพิ่มเอนไซม์ สารละลายโซเดียมคาร์บอเนต (0.5 M) ของปริมาณเดียวกันถูกเพิ่มเข้ามาในการยุติปฏิกิริยา (ค่า pH สำหรับการแก้ปัญหานี้คือ 11.8) และเพิ่มความไวในการตรวจสอบหลังจากที่เร่งปฏิกิริยาปฏิกิริยาสำหรับเวลาที่แน่นอน สุดท้ายเร่งปฏิกิริยาไลเปสที่คำนวณได้จากการดูดกลืนแสงของส่วนผสมนี้ในการลดสัดส่วนที่เหมาะสมกับฟอสเฟตบัฟเฟอร์ว่างเปล่าโดยไม่ต้องใช้เอนไซม์ spectrophotometer ยูวี (UV-1610, Shimadzu. ญี่ปุ่น) ที่ 410 นาโนเมตร วัดนี้เป็นหนึ่งในหน่วยเอนไซม์เป็นปริมาณของโปรตีนปลดปล่อย 1.0 ไมโครโมลพีเอ็นพี / นาทีภายใต้เงื่อนไขเหล่านี้ การรักษาแต่ละวัดในอย่างน้อยสามการทดลองแบบขนานและค่าเฉลี่ยที่ถูกบันทึกไว้

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

1 . เทคนิคเบื้องต้น
หรือ triacylglycerol เอซิลเอสเทอร์ไฮโดรเลส ( EC 3.1.1.3 ) เป็นเอนไซม์ที่ครอบครองภายในความจุเร่งความแตกแยกของหมู่คาร์บอกซิลเอสเทอร์พันธบัตรในไตร - ได - และ monoacylglycerols ( องค์ประกอบหลักของพืช สัตว์ จุลินทรีย์ และไขมันและน้ำมัน ) [ 1 ] โดยทั่วไป เอนไซม์สามารถเร่งปฏิกิริยาที่หลากหลาย เช่น การกระบวนการทรานส์เอสเทอริฟิเคชั่นแกล้วกล้า , , ,แอซิโดไลซิส และเอสเทอริฟิเคชัน [ 2 ] , [ 3 ] , [ 4 ] และ [ 5 ] มากกว่า 50 ไลเปสได้รับการระบุและพวกเขามีศักยภาพการใช้มากในอุตสาหกรรมอาหาร , ยา , สุขภาพ , เคมี , วิศวกรรมเคมี , การคุ้มครองสิ่งแวดล้อม และการพัฒนาพลังงาน [ 6 ] [ 7 ] , [ 8 ] , [ 9 ] และ [ 10 ] สำหรับเทคนิคประโยชน์ทางอุตสาหกรรม ฤทธิ์ของพวกเขาคงจะเข้าใจ ดังนั้นการจัดตั้งสะดวกและถูกต้อง วิธีการวัดกิจกรรมของเอนไซม์ที่สำคัญ .

ระบบเอนไซม์เร่งปฏิกิริยาอาจจะแบ่งออกเป็นสองประเภท : น้ำที่ใช้สื่อและสื่ออินทรีย์ [ 11 ] , [ 12 ] และ [ 13 ] ปกติ , เอ็นไซม์เป็นเอนไซม์ละลายน้ำกับการละลายและเสถียรภาพในเฟสน้ำ . อย่างไรก็ตาม สารอาหารเอนไซม์มักไม่ละลายในน้ำดังนั้น พื้นผิว ควรละลายในตัวทำละลายอินทรีย์และต่อมารวมกับบัฟเฟอร์ ตามรายงานก่อนหน้านี้ พื้นผิวผสมเตรียมโดยวิธีนี้มักจะมีการรวมระบบและสารเติมแต่งเพื่อปรับปรุงความสม่ำเสมอและความมั่นคงของส่วนผสม [ เมตาสเตเบิล 14 ] และ [ 15 ] อย่างไรก็ตามการศึกษาจำนวนมากได้รายงานว่า การทำกิจกรรมต่าง ๆที่มีไลเปส กระตุ้นหรือยับยั้งผล [ 16 ] [ 17 ] และ [ 18 ] ในสื่อที่อินทรีย์ เขามักจะเติมโดยตรงเป็นตัวทำละลายอินทรีย์ที่ประกอบด้วยสารละลาย [ 19 ] วิธีนี้จะได้ประโยชน์ เพราะสารอาหารจะละลายและผสมเป็นมั่นคง ขออภัยโมเลกุลของโปรตีนมีทั้งนมคุณลักษณะและโครงสร้างความยืดหยุ่นซึ่งนำไปสู่การลดกิจกรรมของพวกเขาในการแสดงตนของตัวทำละลายอินทรีย์ [ 20 ] และ [ 21 ] จากการสนทนาข้างต้น จะต้องออกแบบวิธีการที่เหมาะสมในการวัดกิจกรรมของไลเปส .

การศึกษาของเรามุ่งเน้นในการออกแบบของการใช้โซลูชั่นที่มีพื้นผิว ไม่มีสารเจือปน สำหรับการหาสมบัติในการเร่งปฏิกิริยาเอนไซม์ . เราทดสอบหลายและเอทานอลเป็นตัวทำละลายที่เลือกเป็นตัวทำละลายที่เหมาะสมเพื่อละลาย p-npp ด้วยเหตุผลต่อไปนี้ : แรก มันได้กับน้ำที่ปริมาณ . ประการที่สอง p-npp ละลายได้ดีในแอลกอฮอล์ [ 14 ] ในที่สุดเอทานอลเป็นตัวทำละลายอินทรีย์ที่มีขั้วสูงญาติและอิทธิพลน้อยลงเมื่อเทียบกับในโครงสร้างเอนไซม์โพรพานอลซึ่งเป็นตัวทำละลายของพื้นผิวในก่อนหน้านี้รายงานวิธีการ [ 22 ] ในงานนี้ โซลูชั่น เครื่องแบบถูกเตรียมโดยผสมกับเอทานอล p-npp โซลูชั่นบางปริมาณของบัฟเฟอร์ที่ 65 องศา C แล้ววิธีการแก้ปัญหานี้ equilibrated ที่อุณหภูมิหนึ่งและต่อมาใช้สำหรับการวัดกิจกรรมของเอนไซม์ . นอกจากนี้เอนไซม์ไลเปสจาก Candida ที่พัฒนามาใช้เพื่อศึกษาการย่อยสลายของ p-npp ในนี้โดยเฉพาะโดยใช้โซลูชั่น พบว่าเอนไซม์เร่งปฏิกิริยาปริมาณการปลดปล่อยผลิตภัณฑ์โซลูชั่นเครื่องแบบเป็นวัดโดยตรงด้วยรังสีอัลตราไวโอเลต ( UV ) และมองเห็นวัสดุ ปัจจัยที่มีผลต่อกิจกรรมของเอนไซม์ เช่น ปริมาณสัดส่วนของน้ำเอทานอล , เวลาปฏิกิริยา เอนไซม์ p-npp ความเข้มข้น อุณหภูมิ ค่า pH และอัตราการกวนทั้งหมดได้ในงานนี้ นอกจากนี้เรายังกำหนดพารามิเตอร์การในน้ำสารละลายตาม

2 วัสดุและวิธีการ
2.1 . เอนไซม์ไลเปสจาก C .

ผงวัสดุพัฒนา ( 1150 หน่วย / มิลลิกรัมของแข็ง ) , Bradford เก็บสารอัลบูมิน ( บีเอสเอ มวลโมเลกุล 67000 ดา ) และ p-npp ได้จากซิกม่า – อัลดริชเคมี . ( St . Louis , MO , USA ) และใช้เป็น ที่ได้รับ kh2po4 na2hpo4 , ,และเกลือโพแทสเซียมได้จาก chemsynlab วิทยาศาสตร์เภสัชกรรม&เทคโนโลยี ( ปักกิ่ง , จีน ) สารเคมีอื่น ๆทั้งหมดถูกวิเคราะห์ชั้นและใช้โดยไม่บริสุทธิ์เพิ่มเติม น้ำที่ใช้ในการทดลองคือคล้ายเนื้อเยื่อประสาน และ ultrafiltered เพื่อให้ได้ความต้านทาน 18 ซม. Ω M กับ TKA micropure น้ำระบบ ฟอสเฟตบัพเฟอร์ โซลูชั่น ( PBS , 0.05 M ) เตรียมเกลือ ( 85 mg / ml ) na2hpo4 ( 2.2 มิลลิกรัม / มิลลิลิตร ) และ nah2po4 ( 0.4 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร ) และโซเดียมไฮดรอกไซด์ / HCl ใช้ปรับ pH

2.2 . การเตรียมน้ำเป็นเนื้อเดียวกัน ใช้โซลูชั่น

ดังต่อไปนี้โปรโตคอลมาตรฐาน p-npp ละลายได้ในเอทานอลใน 50 ml ขวดเออร์เลนเมเยอร์และความร้อน 65 ° C ในรูปแบบ p-npp สารละลายความเข้มข้น 0.2 , 0.4 , 0.6 , 0.8 , 1.0 , 1.5 , 2.0 มก. / มล. จากนั้น PBS ( 005 m ) 65 ° C ก็ระวัง และเพิ่ม dropwise . ผลลัพธ์ผสมอยู่ในสถานะเมตาสเตเบิล และละลาย p-npp โมเลกุลอาจรวมกับระยะเวลาในการเก็บรักษาและการเปลี่ยนแปลงของอุณหภูมิ ส่วนผสมที่เตรียมไว้ ควรใช้ทันเวลาเพื่อหลีกเลี่ยงการแยกเฟส .