2.1. DNA SamplesThe positive contro

2.1. DNA Samples

The positive controls used in the SYBR Green multiplex real-time PCR were genomic DNA from the standard strain of E. histolytica HM1-IMSS and E. dispar P2 (a strain isolated from patient samples in Piauí, Brazil). The DNA was measured in a Qubit fluorometer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), and 2-fold dilutions in water were prepared for testing using the SYBR Green real-time PCR protocol. For E. hartmanni, however, a cloning procedure was necessary to obtain a positive control because a protozoan culture of E. hartmanni was not available. For this process, positive DNA samples characterized in a previous study were used [20]. The specific E. hartmanni sequence was amplified with primers EhartF and EhartR2; this fragment was then cloned using the pCR 2.1-TOPO vector as described in the protocol with the pCR 2.1-TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen). The extraction and purification of plasmid DNA containing the cloned fragment were performed using the Illustra PlasmidPrep Mini Spin Kit (GE Healthcare UK Limited, Buckinghamshire, UK), according to the manufacturer’s instructions. This cloned plasmid DNA was measured in a Qubit fluorometer (Invitrogen) and 10-fold dilutions in water were prepared for testing with the SYBR Green real-time PCR protocol. In both protocols, DNA solutions from other intestinal parasites (two of each) were tested for a specificity assessment: E. moshkovskii, Cryptosporidium hominis, Giardia lamblia, and Schistosoma mansoni.

2.2. Clinical Samples

Stool samples from 2263 patients who were treated at Hospital Universitário Antônio Pedro (HUAP), Niterói, Rio de Janeiro, Brazil, between August 2008 and June 2009 were submitted to a microscopic examination in order to detect the presence of parasites. The procedure was conducted at the HUAP’s parasitology laboratory. Moreover, a group of 292 stool samples from individual residents of Sumidouro, Rio de Janeiro, Brazil, a rural area, was also subjected to the same examination. Those samples identified as positive for the E. histolytica/E. dispar complex were selected to evaluate this SYBR Green real-time PCR system. Additional stool samples from 50 individuals with negative direct parasitological examinations were included as negative controls. This study was reviewed and approved by the Human Investigation Committee of the Universidade Federal Fluminense with protocol number 020/07.

2.3. Microscopic Examination

The microscopic examination was conducted by HUAP’s parasitology laboratory staff. Prior to morphologic analysis, this service concentrated the stools using a spontaneous sedimentation method [21]. Then the sediments were analyzed in wet mounts stained with Lugol’s iodine solution. For the microscopic examination, the laboratory staff used a Nikon Eclipse E20 optical microscope (Nikon). After the analysis, the sediments were stored at −20°C for DNA extraction.

2.4. DNA Extraction

DNA templates were extracted using the Fast Prep DNA Kit and the FastPrep FP120 Disrupter (MP Biomedicals, Solon, OH, USA). Further Purification was performed using the QIAquick PCR purification Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA), and the purified DNA was stored at −20°C. Both methods were performed according to the manufacturer’s instructions.

2.5. Conventional PCR Amplification

A multiplex PCR reaction was performed according to a protocol previously described by Santos et al. [22], with some modifications. The specific primers for E. histolytica and E. dispar were previously defined by Núñez et al. [23], E. histolytica (EHP1—5′CGATTTTCCCAGTAGAAATTA3′ and EHP2—5′CAAAATGGTCGTCTAGGC3′) and E. dispar (EDP1—5′ATGGTGAGGTTGTAGCAGAGA3′ and EDP2—5′CGATATTGACCTAGTACT3′). These primer sets were used to amplify specific sequences of 132 bp for E. histolytica and 96 bp for E. dispar. Each reaction was performed in a volume of 50 μL using PCR Supermix (Invitrogen), 20 pmol of each primer, 0.1% bovine serum albumin (BSA Sigma Chem. Co., USA), and 2 μL of the DNA sample. The PCR reaction was carried out using a Veriti 96 Well Thermal Cycler (Applied Biosystems, CA, USA), and the amplification parameters were as follows: 3 minutes at 94°C; 30 cycles of 30 seconds at 94°C, 30 seconds at 55°C, and 30 seconds at 72°C; and finally 7 minutes at 72°C. The amplified product was visualized with ethidium bromide staining after electrophoresis on a 2.0% agarose gel.

2.6. Multiplex SYBR Green Real-Time PCR Standardization

This PCR reaction was standardized for the simultaneous detection and identification of E. histolytica and E. dispar. The specific primers used for the detection of E. histolytica and E. dispar were the same oligonucleotide sequences employed for conventional multiplex PCR. Initially, a single format was designed in order to amplify E. histolytica and E. dispar separately. This format allowed us to know the specific melting temperature () of the sequence amplified from each species and the feasibility of standardizing a multiplex reaction with these primers. The simplex PCR cycling parameters consisted of 2 minutes at 50°C, 2 minutes at 95°C and 35 cycles of 15 seconds at 95°C and 33 seconds at 55°C, using Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG (Invitrogen) and the same PCR reagents and conditions. A dissociation stage was then performed; the parameters consisted of 15 seconds at 95°C, 1 minute at 60°C, 15 seconds at 95°C, and 15 seconds at 60°C. Finally, the multiplex format was standardized in a final volume of 25 μL. Four different amounts of primers were tested: 1.25, 2.5, 3.75, and 5 pmol. Two amounts of ROX Reference Dye (Invitrogen) were also tested in the standardization process: 0.25 pmol and 1.25 pmol. All reactions were carried out in an ABI 7500 System thermocycler (Applied Biosystems) and the PCR cycling parameters were the same as described for the single format, with an additional comparison between two annealing temperatures: 55°C and 60°C. The amplified products were visualized with ethidium bromide staining after electrophoresis on a 2.0% agarose gel for confirmation.

2.7. Standardization of SYBR Green Real-Time PCR for Identification of E. hartmanni

DNA sequence alignment was performed using CLC Sequence Viewer software (CLC bio). The sequences aligned were rRNA genes of the highly homologous species E. histolytica, E. dispar, E. moshkovskii, and E. hartmanni. Specific regions in the E. hartmanni sequence (GenBank access: AF149907) were identified. A forward primer EhartF (5′-CGTTCAAGACATGAGTGTGA-3′) and two reverse primers (EhartR1—5′-CCGTAGATCTCCTATTCACTTT-3′); EhartR2 (5′-ACAACACATTCATGTCGCA-3′) were designed.

To verify the identity of the target sequence of the primers, a conventional PCR was performed in a volume of 50 μL, using PCR Supermix (Invitrogen), 20 pmol of each primer, 0.1% bovine serum albumin (BSA Sigma Chem. Co), and 2 μL of DNA sample. The PCR reaction was carried out using a Veriti 96-Well Thermal Cycler (Applied Biosystems), and the amplification parameters were as follows: 3 minutes at 94°C; 40 cycles of 30 seconds at 94°C, 30 seconds at 55°C, and 30 seconds at 72°C; and finally 7 minutes at 72°C. The amplified product was visualized by ethidium bromide staining after electrophoresis on a 2.0% agarose gel and sent to the sequencing platform of the Genomic Unit at the Laboratory of Cell Physiology Darcy Fontoura (Federal University of Rio de Janeiro, Brazil). After confirming the identity of the amplified product on the GenBank database, the standardization process of the real-time PCR began. The PCR reaction using primers EhartF and EhartR2 was performed in a reaction volume of 25 μL, using Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG (Invitrogen). Analyses concerning the amounts of primers and ROX Reference Dye were conducted just as described in the previous section for the multiplex protocol. Also, the reactions were carried out in the same thermocycler. The PCR cycling parameters consisted of 2 minutes at 50°C, 2 minutes at 95°C and 35 cycles of 15 seconds at 95°C and 33 seconds at 60°C. A dissociation stage was then performed; the parameters consisted of 15 seconds at 95°C, 1 minute at 60°C, 15 seconds at 95°C, and 15 seconds at 60°C. The amplified products were visualized with ethidium bromide staining after electrophoresis on a 2.0% agarose gel for confirmation.

2.8. Stool Sample Evaluation

For a preliminary evaluation of the real-time PCR protocols during the standardization process, a selection of Entamoeba positive samples was run. Thus, only samples exhibiting structures of the E. histolytica/E. dispar complex under microscopic examination were analyzed by multiplex conventional PCR and multiplex real-time PCR for the accurate identification of E. histolytica and E. dispar. Those samples with negative results obtained by both methods were submitted for further investigation with real-time PCR for the identification of E. hartmanni.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.1. ดีเอ็นเอตัวอย่างควบคุมบวกใช้ SYBR Green multiplex แบบ real-time PCR ได้ DNA genomic จากพันธุ์มาตรฐานของ E. histolytica dispar HM1 IMSS และ E. p 2 (ต้องใช้แยกต่างหากจากตัวอย่างผู้ป่วย Piauí บราซิล) ดีเอ็นเอถูกวัดใน fluorometer Qubit (Invitrogen คาร์ลส CA, USA), และ dilutions 2-fold ในน้ำเตรียมไว้สำหรับทดสอบโดยใช้ PCR รโทคอแบบเรียลไทม์ SYBR Green สำหรับ E. hartmanni ไร ขั้นตอนการ cloning ได้จำเป็นต้องขอรับตัวควบคุมบวกเนื่องจากวัฒนธรรมของ E. hartmanni protozoan ไม่มี กระบวนการนี้ ตัวอย่างดีเอ็นเอบวกที่ลักษณะในการศึกษาก่อนหน้านี้ได้ใช้ [20] ลำดับเฉพาะ E. hartmanni ถูกขยาย ด้วยไพรเมอร์ EhartF และ EhartR2 ส่วนนี้ถูกแล้วโคลนโดยใช้เวกเตอร์ 2.1 เดิน pCR ในโพรโทคอลกับ pCR 2.1-เดินชุดโคลน TA (Invitrogen) การสกัดและทำให้บริสุทธิ์ของ plasmid DNA ประกอบด้วยส่วนโคลนถูกทำโดยใช้การ Illustra PlasmidPrep มินิหมุนชุด (GE สุขภาพ UK จำกัด บักกิงแฮมเชอร์ อังกฤษ), ตามคำแนะนำของผู้ผลิต โคลน plasmid DNA นี้มีวัดใน fluorometer Qubit (Invitrogen) และ dilutions 10-fold ในน้ำเตรียมไว้สำหรับทดสอบกับ PCR SYBR Green แบบเรียลไทม์โพรโท ในทั้งสองโปรโตคอล โซลูชั่นของดีเอ็นเอจากปรสิตลำไส้อื่น ๆ (สองละ) ถูกทดสอบสำหรับการประเมิน specificity: E. moshkovskii เพิ่ม hominis, lamblia ไกรด์เดีย Schistosoma mansoni และ2.2 ตัวอย่างทางคลินิกตัวอย่างอุจจาระจาก 2263 ผู้ ป่วยได้รับการรักษาที่โรงพยาบาล Universitário Antônio Pedro (HUAP), Niterói ริโอเดอจาเนโร บราซิล ระหว่างเดือน 2551 สิงหาคมและ 2552 มิถุนายนได้ส่งไปตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์เพื่อตรวจหาปรสิต ขั้นตอนที่ดำเนินการที่ห้องปฏิบัติการปรสิตวิทยาของ HUAP นอกจากนี้ กลุ่มตัวอย่างอุจจาระ 292 จากชาว Sumidouro ริโอเดอจาเนโร บราซิล ชนบท แต่ละถูกยังอยู่ภายใต้การสอบเดียวกัน ตัวอย่างที่เป็นค่าบวกสำหรับ histolytica/E. dispar E. ซับซ้อนได้เลือกประเมิน SYBR Green แบบ real-time PCR ระบบนี้ ตัวอย่างเก้าอี้เพิ่มเติมจากบุคคลที่ 50 มีค่าลบโดยตรง parasitological สอบเป็นตัวควบคุมค่าลบได้ ศึกษาทบทวน และอนุมัติ โดยคณะกรรมการตรวจสอบคนของ Fluminense กลาง Universidade กับโพรโทคอลหมายเลข 020/072.3. กล้องจุลทรรศน์ตรวจเจ้าหน้าที่ห้องปฏิบัติการปรสิตวิทยาของ HUAP ได้ดำเนินการตรวจสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์ ก่อนการวิเคราะห์ morphologic บริการนี้เข้มข้นอุจจาระโดยใช้วิธีตกตะกอนอยู่ [21] ตะกอนแล้ว ถูกวิเคราะห์ใน mounts เปียกสี ด้วยโซลูชันของ Lugol ไอโอดีน ตรวจสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์ เจ้าหน้าที่ห้องปฏิบัติการใช้ E20 คราสนิกล้องจุลทรรศน์แสง (Nikon) หลังจากวิเคราะห์ ตะกอนถูกเก็บไว้ที่ −20 ° C สำหรับสกัดดีเอ็นเอ2.4. DNA สกัดแม่แบบดีเอ็นเอที่สกัดโดยใช้รวดเร็วเป็นการเตรียมดีเอ็นเอชุดและ Disrupter FP120 FastPrep (MP Biomedicals, Solon, OH สหรัฐอเมริกา) ทำการฟอกใช้ฟอก QIAquick PCR Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA), และดีเอ็นเอบริสุทธิ์ถูกเก็บไว้ที่ −20 องศาเซลเซียส ทั้งสองวิธีได้ปฏิบัติตามคำแนะนำของผู้ผลิต2.5. PCR ทั่วไปขยายปฏิกิริยา PCR multiplex ที่ดำเนินตามโพรโทคอที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ โดย Santos et al. [22], มีการปรับเปลี่ยนบางอย่าง ไพรเมอร์เฉพาะสำหรับ E. histolytica E. dispar ถูกกำหนดไว้ก่อนหน้านี้โดย Núñez et al. [23], E. histolytica (EHP1 — 5′CGATTTTCCCAGTAGAAATTA3′ และ EHP2 – 5′CAAAATGGTCGTCTAGGC3′) และ E. dispar (EDP1 — 5′ATGGTGAGGTTGTAGCAGAGA3′ และ EDP2 – 5′CGATATTGACCTAGTACT3′) ชุดรองพื้นเหล่านี้ใช้ขยายลำดับเฉพาะของ 132 bp E. histolytica และ 96 bp สำหรับ E. dispar ทำปฏิกิริยาแต่ละปริมาณ 50 μL ใช้ Supermix PCR (Invitrogen), pmol 20 แต่ละพื้น 0.1% วัว serum albumin (บีเอสเอซิก Chem. Co. สหรัฐอเมริกา), และ μL 2 ของตัวอย่างดีเอ็นเอ ปฏิกิริยา PCR ถูกดำเนินการโดยใช้การ Veriti 96 ด้วย Thermal Cycler (ใช้ Biosystems, CA, USA), และพารามิเตอร์การขยายเป็นดังนี้: 3 นาทีที่ 94° C รอบ 30 วินาที 30 ที่ 94° C, 30 วินาทีที่ 55° C และวินาทีที่ 72° C และในที่สุด 7 นาทีที่ 72 องศาเซลเซียส ผลิตภัณฑ์เอาต์มี visualized กับโบรไมด์ ethidium ย้อมสีหลังจากเจ electrophoresis ใน agarose 2.0%2.6. Multiplex SYBR Green Real-Time PCR Standardizationปฏิกิริยา PCR นี้เป็นมาตรฐานสำหรับการตรวจหาพร้อมกับรหัสของ E. histolytica E. dispar ไพรเมอร์เฉพาะที่ใช้สำหรับการตรวจหาของ E. histolytica E. dispar ลำดับ oligonucleotide เดียวที่ลูกจ้างการ multiplex PCR แบบเดิมได้ เริ่มต้น รูปเดียวถูกออกแบบมาเพื่อขยาย E. histolytica และ E. dispar แยกต่างหาก รูปแบบนี้ทำให้เราทราบการละลายอุณหภูมิ()ลำดับที่ขยายจากแต่ละพันธุ์และความเป็นไปได้ของการ standardizing ปฏิกิริยาต่าง ๆ ๅกับไพรเมอร์เหล่านี้ พารามิเตอร์การขี่จักรยาน PCR simplex โดยประกอบด้วย 2 นาทีที่ 50° C, 2 นาทีที่ 95° C และรอบ 35 ของวินาที ที่ 95° C และวินาทีที่ 55° C ใช้แพลทินัม SYBR Green qPCR SuperMix UDG (Invitrogen) และ reagents PCR เดียวกัน และเงื่อนไข แล้วทำขั้น dissociation พารามิเตอร์ประกอบด้วยวินาทีที่ 95° C, 1 นาทีที่ 60° C, 15 วินาทีที่ 95° C และวินาทีที่ 60 องศาเซลเซียส สุดท้าย รูปแบบ multiplex เป็นมาตรฐานในปริมาตรสุดท้ายของ 25 μL ทดสอบจำนวนแตกต่างกันสี่ไพรเมอร์: 1.25, 2.5, 3.75 และ 5 pmol ยังทดสอบจำนวนสองย้อม ROX อ้างอิง (Invitrogen) ในกระบวนการมาตรฐาน: 0.25 pmol และ 1.25 pmol ปฏิกิริยาทั้งหมดได้ดำเนินการระบบ 7500 ABI thermocycler (Biosystems ใช้) และพารามิเตอร์ขี่ PCR ได้เหมือนกับที่อธิบายไว้ในรูปแบบเดียว ด้วยการเปรียบเทียบเพิ่มเติมระหว่างอุณหภูมิหลอมสอง: 55° C และ 60 องศาเซลเซียส ผลิตภัณฑ์เอาต์มี visualized กับโบรไมด์ ethidium ย้อมสีหลังจากเจ electrophoresis ใน agarose 2.0% สำหรับยืนยัน2.7. มาตรฐาน SYBR Green Real-Time PCR สำหรับรหัส E. hartmanniจัดลำดับของดีเอ็นเอที่ดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์แสดงลำดับ CLC (CLC ชีวภาพ) การจัดลำดับยีนใน rRNA homologous สูงชนิด E. histolytica, E. dispar, E. moshkovskii และ E. hartmanni ได้ ภูมิภาคที่เฉพาะเจาะจงในลำดับ E. hartmanni (GenBank เข้า: AF149907) ระบุ สีรองพื้นไปข้างหน้า EhartF (5′ CGTTCAAGACATGAGTGTGA 3′) และไพรเมอร์กลับสอง (EhartR1 – 5′-CCGTAGATCTCCTATTCACTTT-3′); EhartR2 (5′ ACAACACATTCATGTCGCA 3′) ถูกออกแบบการตรวจสอบข้อมูลประจำตัวของลำดับเป้าหมายของไพรเมอร์ที่ ทำ PCR ธรรมดาปริมาณของ 50 μL ใช้ Supermix PCR (Invitrogen), pmol 20 แต่ละพื้น 0.1% วัว serum albumin (บีเอสเอซิก Chem. Co), และ μL 2 ของตัวอย่างดีเอ็นเอ ปฏิกิริยา PCR ถูกดำเนินการโดยใช้การ Veriti 96-ดีร้อน Cycler (Biosystems ใช้), และพารามิเตอร์การขยายเป็นดังนี้: 3 นาทีที่ 94° C รอบ 40 วินาที 30 ที่ 94° C, 30 วินาทีที่ 55° C และวินาทีที่ 72° C และในที่สุด 7 นาทีที่ 72 องศาเซลเซียส ผลิตภัณฑ์เอาต์มี visualized โดยโบรไมด์ ethidium ย้อมสีหลังจากเจ electrophoresis ใน agarose 2.0% และส่งไปยังแพลตฟอร์มลำดับของ Genomic หน่วยปฏิบัติการของเซลล์สรีรวิทยาของ Darcy Fontoura (สหพันธ์มหาวิทยาลัยของริโอเดอจาเนโร บราซิล) หลังจากการยืนยันลักษณะเฉพาะของผลิตภัณฑ์เอาต์ใน GenBank ฐานข้อมูล กระบวนการมาตรฐานของ PCR จริงเริ่ม ปฏิกิริยา PCR โดยใช้ไพรเมอร์ทำปริมาณปฏิกิริยาของ 25 μL EhartF และ EhartR2 ใช้แพลทินัม SYBR Green qPCR SuperMix UDG (Invitrogen) วิเคราะห์เกี่ยวกับจำนวนไพรเมอร์และย้อมอ้างอิง ROX ได้ดำเนินเพียงตามที่อธิบายไว้ในส่วนก่อนหน้านี้สำหรับโพรโทคอล multiplex ยัง ปฏิกิริยาที่ได้ดำเนินการ thermocycler เดียวกัน ประกอบด้วยพารามิเตอร์ขี่ PCR 2 นาทีที่ 50° C, 2 นาทีที่ 95° C และ 35 รอบวินาทีที่ 95° C และวินาทีที่ 60 องศาเซลเซียส แล้วทำขั้น dissociation พารามิเตอร์ประกอบด้วยวินาทีที่ 95° C, 1 นาทีที่ 60° C, 15 วินาทีที่ 95° C และวินาทีที่ 60 องศาเซลเซียส ผลิตภัณฑ์เอาต์มี visualized กับโบรไมด์ ethidium ย้อมสีหลังจากเจ electrophoresis ใน agarose 2.0% สำหรับยืนยัน2.8 ประเมินตัวอย่างเก้าอี้การเลือกตัวอย่างบวก Entamoeba ถูกเรียกใช้สำหรับการประเมินเบื้องต้นของโพรโทคอลที่ PCR แบบเรียลไทม์ที่ระหว่างมาตรฐาน ดังนั้น อย่างมีระดับโครงสร้างของอาคาร dispar histolytica/E. E. ภายใต้กล้องจุลทรรศน์การตรวจสอบอย่างเดียวถูกวิเคราะห์ โดย multiplex PCR ธรรมดาและ multiplex PCR แบบเรียลไทม์สำหรับรหัสที่ถูกต้องของ E. histolytica E. dispar ตัวอย่างที่ มีผลเชิงลบที่ได้รับ โดยทั้งสองวิธีถูกส่งเพื่อการตรวจสอบเพิ่มเติม ด้วย PCR แบบเรียลไทม์สำหรับการระบุของ E. hartmanni

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.1 ตัวอย่างดีเอ็นเอควบคุมบวกใช้ใน SYBR เขียวทวีคูณ real-time PCR เป็นดีเอ็นเอจากสายพันธุ์มาตรฐานของ E. histolytica-HM1 IMSS และอี dispar P2 (สายพันธุ์ที่แยกได้จากตัวอย่างของผู้ป่วยในPiauí, บราซิล) ดีเอ็นเอวัดใน Qubit fluorometer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) และ 2 เท่าเจือจางในน้ำได้จัดทำขึ้นสำหรับการทดสอบโดยใช้สีเขียว SYBR แบบ real-time PCR โปรโตคอล สำหรับอี hartmanni แต่ขั้นตอนการโคลนนิ่งเป็นสิ่งจำเป็นที่จะได้รับการควบคุมบวกเพราะวัฒนธรรมของโปรโตซัวอี hartmanni ก็ไม่สามารถใช้ได้ สำหรับขั้นตอนนี้ตัวอย่างดีเอ็นเอบวกที่โดดเด่นในการศึกษาก่อนหน้านี้ถูกนำมาใช้ [20] เฉพาะอี hartmanni ลำดับถูกขยายกับไพร EhartF และ EhartR2; ส่วนนี้เป็นโคลนแล้วใช้ PCR 2.1 TOPO เวกเตอร์ตามที่อธิบายไว้ในโพรโทคอด้วยวิธี PCR-2.1 TOPO TA โคลน Kit (Invitrogen) การสกัดและการทำให้บริสุทธิ์ของดีเอ็นเอพลาสมิดที่มีส่วนโคลนถูกดำเนินการโดยใช้ Illustra PlasmidPrep จิ๋ว Kit (GE Healthcare UK Limited, Buckinghamshire สหราชอาณาจักร) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต พลาสมิดดีเอ็นเอนี้โคลนวัดใน fluorometer Qubit (Invitrogen) และ 10 เท่าเจือจางในน้ำได้จัดทำขึ้นสำหรับการทดสอบกับ SYBR สีเขียวแบบ real-time PCR โปรโตคอล ในโปรโตคอลทั้งสองโซลูชั่นดีเอ็นเอจากปรสิตลำไส้อื่น ๆ (สองของแต่ละคน) ได้ผ่านการประเมินความจำเพาะ:. E. moshkovskii, Cryptosporidium hominis, Giardia lamblia และ Schistosoma mansoni 2.2 ตัวอย่างคลินิกอุจจาระจาก 2,263 ผู้ป่วยที่ได้รับการรักษาที่โรงพยาบาลUniversitárioAntônioโดร (Huap) Niteróiในรีโอเดจาเนโร, บราซิล, ระหว่างเดือนสิงหาคมปี 2008 และมิถุนายน 2009 ถูกส่งไปตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์เพื่อตรวจสอบสถานะของปรสิต ขั้นตอนที่ได้รับการดำเนินการที่ห้องปฏิบัติการปรสิตวิทยา Huap ของ นอกจากนี้กลุ่มของ 292 อุจจาระจากประชาชนในแต่ละ Sumidouro, ริโอเดอจาเนโร, บราซิล, พื้นที่ชนบทถูกยัดเยียดยังตรวจสอบเดียวกัน ตัวอย่างผู้ที่ระบุว่าเป็นบวกสำหรับ E. histolytica / E dispar ซับซ้อนได้รับการคัดเลือกในการประเมิน SYBR นี้กรีนแบบ real-time PCR ระบบ อุจจาระเพิ่มเติมจาก 50 บุคคลที่มีการตรวจสอบปรสิตวิทยาเชิงลบโดยตรงได้รวมเป็นตัวควบคุมเชิงลบ การศึกษาครั้งนี้ได้รับการตรวจสอบและอนุมัติโดยคณะกรรมการสอบสวนของมนุษย์ Universidade กลางลูมินนีมีจำนวนโปรโตคอล 020/07. 2.3 กล้องจุลทรรศน์ตรวจสอบการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ได้ดำเนินการโดยพนักงานห้องปฏิบัติการปรสิตวิทยา Huap ของ ก่อนที่จะมีการวิเคราะห์รูปร่างบริการนี้เข้มข้นอุจจาระโดยใช้วิธีการตกตะกอนที่เกิดขึ้นเอง [21] จากนั้นตะกอนที่ได้มาวิเคราะห์ในเมาท์เปียกเปื้อนด้วยสารละลายไอโอดีนของ Lugol สำหรับการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์พนักงานห้องปฏิบัติการที่ใช้ Nikon คราส E20 กล้องจุลทรรศน์ (Nikon) หลังจากการวิเคราะห์ตะกอนถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียสสำหรับการสกัดดีเอ็นเอ. 2.4 สกัดดีเอ็นเอแม่แบบดีเอ็นเอถูกสกัดโดยใช้ดีเอ็นเอได้อย่างรวดเร็วเตรียมชุดและ FastPrep fp120 disrupter (MP Biomedicals, Solon, OH, USA) บริสุทธิ์นอกจากนี้ได้รับการดำเนินการโดยใช้การทำให้บริสุทธิ์ PCR QIAquick Kit (QIAGEN Inc. , วาเลนเซีย, CA, USA) และดีเอ็นเอบริสุทธิ์ที่ถูกเก็บไว้ที่ -20 ° C ทั้งสองวิธีได้ดำเนินการตามคำแนะนำของผู้ผลิต. 2.5 PCR Amplification ธรรมดาปฏิกิริยาเทคนิค multiplex PCR ได้ดำเนินการตามโปรโตคอลที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้โดย Santos และคณะ [22] ด้วยการปรับเปลี่ยนบางอย่าง ไพรเมอร์ที่เฉพาะเจาะจงสำหรับ E. histolytica และอี dispar ถูกกำหนดไว้ก่อนหน้าโดยNúñezและคณะ [23], E. histolytica (EHP1-5'CGATTTTCCCAGTAGAAATTA3 และ EHP2-5'CAAAATGGTCGTCTAGGC3 ') และอี dispar (EDP1-5'ATGGTGAGGTTGTAGCAGAGA3 และ EDP2-5'CGATATTGACCTAGTACT3') ชุดไพรเมอร์เหล่านี้ถูกนำมาใช้ในการขยายลำดับที่เฉพาะเจาะจงของ 132 bp สำหรับ histolytica อีและ 96 bp สำหรับอี dispar ปฏิกิริยาแต่ละคนได้ดำเนินการในปริมาณ 50 ไมโครลิตรวิธี PCR Supermix (Invitrogen), 20 pmol ของแต่ละไพรเมอร์, 0.1% ในซีรั่มอัลบูมิวัว (BSA Sigma Chem. Co. , สหรัฐอเมริกา) และ 2 ไมโครลิตรของตัวอย่างดีเอ็นเอ ปฏิกิริยา PCR ได้ดำเนินการโดยใช้ Veriti 96 Cycler ความร้อนดี (Applied Biosystems, CA, USA) และพารามิเตอร์การขยายมีดังนี้: 3 นาทีที่ 94 ° C; 30 รอบ 30 วินาทีที่ 94 ° C, 30 วินาทีที่ 55 องศาเซลเซียสและ 30 วินาทีที่ 72 ° C; และในที่สุด 7 นาทีที่ 72 ° C สินค้าที่ได้รับการมองเห็นการขยายด้วยการย้อมสีโบรไมด์ ethidium หลังจากกระแสไฟฟ้า 2.0% เจล agarose. 2.6 Multiplex SYBR เขียว PCR แบบ Real-Time มาตรฐานPCR ปฏิกิริยานี้เป็นมาตรฐานสำหรับการตรวจหาพร้อมกันและบัตรประจำตัวของ E. histolytica และอี dispar ไพรเมอร์เฉพาะที่ใช้สำหรับการตรวจสอบของ E. histolytica และอี dispar เป็นลำดับ oligonucleotide เดียวกันที่ใช้สำหรับเทคนิค multiplex PCR แบบเดิม ในขั้นต้นเป็นรูปแบบเดียวที่ได้รับการออกแบบมาเพื่อขยาย E. histolytica และอี dispar แยกต่างหาก รูปแบบนี้ให้เรารู้ว่าอุณหภูมิหลอมละลายเฉพาะ () ของลำดับขยายจากสายพันธุ์แต่ละคนและความเป็นไปได้ของมาตรฐานปฏิกิริยาทวีคูณกับไพรเหล่านี้ พารามิเตอร์การขี่จักรยาน PCR เริมประกอบด้วย 2 นาทีที่ 50 ° C, 2 นาทีที่ 95 ° C และ 35 รอบ 15 วินาทีที่ 95 องศาเซลเซียสและ 33 วินาทีที่ 55 ° C โดยใช้แพลทินั่ SYBR เขียว qPCR Supermix-UDG (Invitrogen) และ น้ำยา PCR เดียวกันและเงื่อนไข ขั้นตอนที่แยกออกจากกันได้ดำเนินการแล้ว; พารามิเตอร์ประกอบด้วย 15 วินาทีที่ 95 ° C, 1 นาทีที่ 60 ° C, 15 วินาทีที่ 95 องศาเซลเซียสและ 15 วินาทีที่ 60 ° C สุดท้ายรูปแบบมัลติเพล็กเป็นมาตรฐานในปริมาณสุดท้ายของ 25 ไมโครลิตร สี่จำนวนเงินที่แตกต่างกันของไพรเมอร์ได้รับการทดสอบ: 1.25, 2.5, 3.75, และ 5 pmol สองปริมาณของ ROX ย้อมอ้างอิง (Invitrogen) ได้มีการทดสอบยังอยู่ในขั้นตอนมาตรฐาน: 0.25 pmol และ 1.25 pmol ปฏิกิริยาทั้งหมดได้ดำเนินการใน ABI 7500 เครื่อง thermocycler ระบบ (Applied Biosystems) และพารามิเตอร์การขี่จักรยาน PCR ได้เหมือนกันตามที่อธิบายไว้สำหรับรูปแบบเดียวกับการเปรียบเทียบระหว่างสองเพิ่มเติมอุณหภูมิการหลอม: 55 ° C และ 60 ° C ผลิตภัณฑ์ที่ได้รับการมองเห็นการขยายด้วยการย้อมสีโบรไมด์ ethidium หลังจากกระแสไฟฟ้า 2.0% agarose เจลสำหรับการยืนยัน. 2.7 มาตรฐานของสีเขียว SYBR PCR แบบ Real-Time สำหรับบัตรประจำตัวของอี hartmanni การจัดเรียงลำดับดีเอ็นเอถูกดำเนินการโดยใช้ซอฟแวร์ CLC ลำดับ Viewer (ไบโอ CLC) ลำดับสอดคล้องเป็นยีน rRNA ของสายพันธุ์ที่คล้ายคลึงกันอย่างมาก E. histolytica, อี dispar, อี moshkovskii และอี hartmanni ภูมิภาคที่เฉพาะเจาะจงในลำดับอี hartmanni (การเข้าถึง GenBank: AF149907) ถูกระบุ EhartF ไพรไปข้างหน้า (5'-CGTTCAAGACATGAGTGTGA-3 ') และสองไพรย้อนกลับ (EhartR1-5'-CCGTAGATCTCCTATTCACTTT-3'); EhartR2 (5'-ACAACACATTCATGTCGCA-3 ') ได้รับการออกแบบ. ในการตรวจสอบตัวตนของเป้าหมายลำดับของไพรเมอร์, PCR แบบเดิมได้รับการดำเนินการในปริมาณ 50 ไมโครลิตรโดยใช้วิธี PCR Supermix (Invitrogen), 20 pmol ของแต่ละไพรเมอร์, 0.1% ในซีรั่มอัลบูมิวัว (BSA Sigma Chem. Co) และ 2 ไมโครลิตรของตัวอย่างดีเอ็นเอ ปฏิกิริยา PCR ได้ดำเนินการโดยใช้ Veriti 96 ดีความร้อน Cycler (Applied Biosystems) และพารามิเตอร์การขยายมีดังนี้: 3 นาทีที่ 94 ° C; 40 รอบ 30 วินาทีที่ 94 ° C, 30 วินาทีที่ 55 องศาเซลเซียสและ 30 วินาทีที่ 72 ° C; และในที่สุด 7 นาทีที่ 72 ° C สินค้าที่ได้รับการมองเห็นการขยายโดยการย้อมสีโบรไมด์ ethidium หลังจากกระแสไฟฟ้าด้วยเจล agarose 2.0% และส่งไปยังแพลตฟอร์มการเรียงลำดับของหน่วยจีโนมที่ห้องปฏิบัติการสรีรวิทยาของเซลล์ Fontoura ดาร์ซี (มหาวิทยาลัยสหพันธ์รีโอเดจาเนโร, บราซิล) หลังจากยืนยันตัวตนของสินค้าที่ขยายในฐานข้อมูล GenBank กระบวนการมาตรฐานของ real-time PCR เริ่ม ปฏิกิริยา PCR โดยใช้ไพรเมอร์ EhartF และ EhartR2 ได้รับการดำเนินการในปริมาณปฏิกิริยา 25 ไมโครลิตรโดยใช้แพลทินั่ SYBR เขียว qPCR Supermix-UDG (Invitrogen) การวิเคราะห์เกี่ยวกับปริมาณของไพรเมอร์และ ROX ย้อมอ้างอิงได้ดำเนินการเช่นเดียวกับที่อธิบายไว้ในส่วนก่อนหน้านี้สำหรับโปรโตคอลทวีคูณ นอกจากนี้ปฏิกิริยาได้ดำเนินการในเครื่อง thermocycler เดียวกัน พารามิเตอร์การขี่จักรยาน PCR ประกอบด้วย 2 นาทีที่ 50 ° C, 2 นาทีที่ 95 ° C และ 35 รอบ 15 วินาทีที่ 95 องศาเซลเซียสและ 33 วินาทีที่ 60 ° C ขั้นตอนที่แยกออกจากกันได้ดำเนินการแล้ว; พารามิเตอร์ประกอบด้วย 15 วินาทีที่ 95 ° C, 1 นาทีที่ 60 ° C, 15 วินาทีที่ 95 องศาเซลเซียสและ 15 วินาทีที่ 60 ° C ผลิตภัณฑ์ที่ได้รับการมองเห็นการขยายด้วยการย้อมสีโบรไมด์ ethidium หลังจากกระแสไฟฟ้า 2.0% agarose เจลสำหรับการยืนยัน. 2.8 สตูลประเมินผลตัวอย่างสำหรับการประเมินผลเบื้องต้นของแบบ real-time PCR โปรโตคอลมาตรฐานในระหว่างขั้นตอนการเลือก Entamoeba ตัวอย่างบวกกำลังวิ่ง ดังนั้นตัวอย่างเพียงการแสดงโครงสร้างของ E. histolytica / E ที่ซับซ้อน dispar ภายใต้การตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์วิเคราะห์ Multiplex PCR แบบดั้งเดิมและเทคนิค multiplex PCR แบบเรียลไทม์สำหรับประชาชนที่ถูกต้องของ E. histolytica และอี dispar ตัวอย่างผู้ที่มีผลลบที่ได้รับโดยวิธีการทั้งสองถูกส่งมาเพื่อการตรวจสอบต่อไปด้วย real-time PCR เพื่อระบุตัวตนของอี hartmanni

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.1 . ดีเอ็นเอ

บวกการควบคุมที่ใช้ในการมัลติเพล็กซ์แบบเรียลไทม์พีซีอาร์เป็น SYBR กรีนดีเอ็นเอจากสายพันธุ์มาตรฐานเช่นทั้งหมด 12 ตัวอย่าง hm1-imss และ E . dispar P2 ( สายพันธุ์ที่แยกได้จากผู้ป่วยตัวอย่างรัฐปีเอาอีประเทศบราซิล ) ดีเอ็นเอเป็นวัดใน qubit ฟลู โรมิเตอร์ ( Invitrogen Carlsbad , CA , USA )ถึงในน้ำและวิธีการเตรียมสำหรับการทดสอบการใช้ PCR แบบเรียลไทม์ SYBR กรีนโปรโตคอล สำหรับ อี hartmanni อย่างไรก็ตาม ขั้นตอนการจำเป็นที่ต้องได้รับการควบคุมที่ดี เพราะโปรโตซัววัฒนธรรมของ E . hartmanni ไม่ว่าง สำหรับกระบวนการนี้ ตัวอย่างดีเอ็นเอบวกโดดเด่นในการศึกษาก่อนหน้านี้เคยใช้ [ 20 ] ที่เฉพาะเจาะจงเช่นhartmanni ลำดับถูกขยายด้วยไพรเมอร์และ ehartf ehartr2 ; ส่วนนี้ถูกโคลนโดยใช้ PCR 2.1-topo เวกเตอร์ตามที่อธิบายไว้ในขั้นตอนกับ pcr 2.1-topo ทาโคลน Kit ( Invitrogen ) การสกัดและการโคลนชิ้นส่วนพลาสมิดดีเอ็นเอที่มีการใช้ illustra plasmidprep มินิปั่นชุด ( GE ดูแลสุขภาพ UK จำกัด เหมือนเดิม , UK )ตามคำแนะนำของผู้ผลิต นี้สามารถวัดในพลาสมิดดีเอ็นเอ qubit ฟลู โรมิเตอร์ ( Invitrogen ) และ 10 เท่าเจือจางในน้ำที่ถูกเตรียมไว้สำหรับการทดสอบด้วยวิธี PCR แบบเรียลไทม์ SYBR กรีนโปรโตคอล ในทั้งสองโปรโตคอล โซลูชั่นจากดีเอ็นเอ intestinal อื่น ๆ ( สองของแต่ละคน ) โดยมีความเฉพาะเจาะจงในการประเมิน : E . moshkovskii hominis , Cryptosporidium ,การ์เดียแลมเบลีย และ schistosoma mansoni .

. . คลินิกตัวอย่าง

อุจจาระตัวอย่างจาก 2263 ผู้ป่วยในโรงพยาบาลมหาวิทยาลัย . kgm ริโอมดเป็นการนีโอเปโดร ( huap ) ดินประสิวóผม ริโอ เดอ จาเนโร ประเทศบราซิล ระหว่างเดือนสิงหาคม 2008 และมิถุนายน 2009 ถูกส่งไปยังกล้องจุลทรรศน์เพื่อตรวจสอบสถานะของปรสิต ขั้นตอนดำเนินการที่ห้องปฏิบัติการปรสิตวิทยาของ huap . นอกจากนี้กลุ่ม 292 ตัวอย่างจากบุคคลผู้ sumidouro สตูล , ริโอ เดอ จาเนโร ประเทศบราซิล ชนบท ก็ต้องสอบเหมือนกัน ตัวอย่างการระบุเป็นบวกสำหรับ E / E dispar ทั้งหมด 12 ตัวอย่างที่ถูกเลือกเพื่อประเมินนี้ SYBR กรีนแบบเรียลไทม์ โดยระบบเพิ่มเติมตัวอย่างจาก 50 บุคคลที่มีแป้นลบตรงปรสิตวิทยาสอบถูกรวมเป็นควบคุมลบ การศึกษานี้ได้ตรวจสอบและอนุมัติโดยมนุษย์คณะกรรมการสอบสวนของมหาวิทยาลัยกับโพรโทคอลเบอร์ 020 Amrica / 07 .

2.3 กล้องจุลทรรศน์

ตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์นี้ดำเนินการโดย huap ปรสิตวิทยาปฏิบัติการของเจ้าหน้าที่ก่อนการวิเคราะห์รูปร่าง บริการนี้เข้มข้นตั่งใช้วิธีตกตะกอนตามธรรมชาติ [ 21 ] จากนั้นตะกอนวิเคราะห์ mounts เปียกเปื้อน lugol ของสารละลายไอโอดีน เป็นต้น สำหรับการตรวจสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์ เจ้าหน้าที่ห้องปฏิบัติการที่ใช้ Nikon คราสเตอร์แสงกล้องจุลทรรศน์ ( Nikon ) หลังจากการวิเคราะห์ ตะกอนที่อุณหภูมิ 20 ° C สำหรับ บริษัท เวสเทิร์น การสกัดดีเอ็นเอ

2.4 .การสกัดดีเอ็นเอดีเอ็นเอแม่แบบ

ถูกสกัดโดยใช้ดีเอ็นเออย่างรวดเร็วเตรียมชุดและ fastprep fp120 ยิง ( MP biomedicals โซลอน โอ้ , USA ) ต่อไปคือการใช้บำบัดน้ำเสีย qiaquick PCR ฟอก Kit ( QIAGEN อิงค์ , วาเลนเซีย , CA , USA ) และทำให้ดีเอ็นเอถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 20 องศา บริษัท เวสเทิร์น ทั้งสองวิธีมีการปฏิบัติตามคำแนะนำของผู้ผลิต

2.5

มีปฏิกิริยา PCR PCR ธรรมดาแบบมัลติเพล็กซ์ ได้ปฏิบัติตามขั้นตอนที่อธิบายไว้ก่อนหน้าโดยซานโตส et al . [ 22 ] , มีการปรับเปลี่ยน ไพร์เมอร์จำเพาะสำหรับ . . dispar ทั้งหมด 12 ตัวอย่างก่อนหน้านี้ที่กำหนดโดย N úñ EZ et al . [ 23 ] , E . ทั้งหมด 12 ตัวอย่าง ( MBC ’ cgattttcccagtagaaatta3 ehp1-5 และได้รับ ehp2-5 caaaatggtcgtctaggc3 School ) และ Edispar ( MBC MBC MBC และ atggtgaggttgtagcagaga3 edp1-5 edp2-5 cgatattgacctagtact3 School ) ชุดรองพื้นเหล่านี้ถูกใช้เพื่อขยายเฉพาะลำดับ 132   BP สำหรับ E ทั้งหมด 12 ตัวอย่างและ 96   BP สำหรับ E dispar . แต่ละปฏิกิริยาแสดงในปริมาตร 50  μผมใช้ PCR supermix ( Invitrogen ) , 20   pmol ของแต่ละคู่ , 0.1% อัลบูมิน ( 6 ซิกม่า เคมี Co . , USA ) และ 2  μ l ตัวอย่างดีเอ็นเอการตรวจปฏิกิริยาการใช้ veriti 96 ดีความร้อนรอบ ( Applied Biosystems , CA , USA ) และโดยการเพิ่มพารามิเตอร์ดังนี้ 3 นาทีที่ 94 ° C ; 30 รอบ 30 วินาทีที่ 94 ° C 30 วินาทีที่ 55 องศา C และ 30 นาทีที่ 72 ° C ; และในที่สุด 7 นาทีที่ 72 ° C ขยายผลิตภัณฑ์กับคู่ bromide staining หลังจากตรวจเอนไซม์บนเจล ( 2.0 %

2.6มัลติเพล็กซ์สีเขียว SYBR เวลา PCR จริงมาตรฐาน

0 มาตรฐานการตรวจหาปฏิกิริยาพร้อมกันและการ dispar ทั้งหมด 12 ตัวอย่าง และ E . . . โดยเฉพาะที่ใช้สำหรับการตรวจหาของ E . ทั้งหมด 12 ตัวอย่างและ E . dispar ได้เหมือนกัน ซึ่งลำดับในแบบ multiplex PCR ในรูปแบบเดียวถูกออกแบบมาเพื่อขยาย .ทั้งหมด 12 ตัวอย่างและ E . dispar ต่างหาก รูปแบบนี้ให้เราทราบอุณหภูมิหลอมเหลวที่เฉพาะเจาะจง ( ) ของลำดับเบสจากแต่ละชนิดและความเป็นไปได้ของมาตรฐานปฏิกิริยา multiplex กับไพรเมอร์เหล่านี้ วิธีซิมเพล็กซ์จักรยานพารามิเตอร์เป็น 2 นาทีที่ 50 ° C , 2 นาทีที่ 95 องศา C และ 35 รอบ 15 วินาทีที่ 95 องศา C และ 33 วินาทีที่ 55 องศา Cการใช้แพลทินัม SYBR สีเขียว qpcr supermix udg ( Invitrogen ) และเดียวกันจากสารเคมีและเงื่อนไข ขั้นตอนการได้ดำเนินการ ; พารามิเตอร์จำนวน 15 วินาทีที่ 95 องศา C , 1 นาทีที่ 60 ° C , 15 วินาทีที่ 95 องศา C และ 15 วินาทีที่อุณหภูมิ 60 องศา สุดท้ายรูปแบบ multiplex คือมาตรฐานในเล่มสุดท้าย 25  μล. 4 ปริมาณชิ้นดีเอ็นเอการทดสอบ : 1.25 , 2.5 , 3.75 ,และ 5   pmol . สองปริมาณสีอ้างอิง Rox ( Invitrogen ) ยังใช้ในกระบวนการมาตรฐาน : 0.25   pmol และ 1.25   pmol . เกิดปฏิกิริยา ได้ดำเนินการใน ABI 7500 ระบบเทอร์มอไซเคล ์ ( Applied Biosystems ) และ PCR จักรยานค่าเหมือนที่อธิบายในรูปแบบเดียวกับการเปรียบเทียบเพิ่มเติมระหว่างสองอุณหภูมิอบ : 55 ° C และ 60 องศา