Isolation Techniques1. Rapid boilin

Isolation Techniques
1. Rapid boiling method for small plasmids in E. coli (Holmes & Quigley,1981; modified by Riggs & McLachlan, 1986)
- Centrifuge 1.5 ml of culture in Eppendorf tube and resuspend pellet in 200 μl of STET buffer (8.0% sucrose, 0.5% Triton X-100, 0.05 M EDTA, 0.05 M Tris-HCl, pH 8.0) containing 10 μl of lysozyme (20 mg/ml, freshly dissolved in H2O) and 20 μl ZnCl2 (1% in H2O)
- Incubate at about 100°C for 45-55 sec, then cool on ice
- Centrifuge for 5 min and add supernatant to Eppendorf tube containing 480 μl of IS mix
(400 μl isopropanol, 80 μl 5 M ammonium acetate). Incubate at RT for 20-30 min
- Centrifuge for 5 min, wash DNA pellet with 70% cold ethanol twice and dry in a vacuum dessiccator
- Resuspend pellet in 20 μl of storage TE buffer or in RNase buffer (see RNase treatment) before using for agrose gel electrophoresis
2. Hot alkaline method for all plasmid sizes and bacteria (Kado & Liu,1981), modified
- Centrifuge 2-3 ml of culture, resuspend pellet in 1 ml of solution containing 0.04 M Tris- acetate, pH 8.0 (adjust pH with glacial acetic acid) and 2 mM EDTA
- Add 2 ml of lysis buffer (0.05 M Tris, 3% SDS, pH 12.50, adjusted with 2 N NaOH) and mix
- Incubate at 60-68°C for 30-45 min (strain dependent)
- Add to hot samples 6 ml of phenol/chloroform (1:1) and mix gently to complete emulsification
- Separate phases by centrifugation at 10.000 x g for 15-20 min at RT and transfer the upper aqueous phase carefully (avoid interphase which contains debris) to new tube containing 1 volume of chloroform. Mix and centrifuge again for separation of phases
- Recover aqueous phase and use directly for agarose gel
3. Lysozyme method for various Gram-negative bacteria (Davis et al.,1980)
- Centrifuge 10 ml of culture, resuspend pellet in 1.4 ml of the following TE buffer: 0.01 M Tris, pH 8.5 and 1 mM EDTA. Transfer to Eppendorf tubes and spin for 3 min
- Resuspend pellet in 0.4 ml of solution (15% sucrose, 0.05 M Tris, pH 8.5, 0.05 M EDTA), mix vigorously, cool on ice
- Add 0.1 ml of freshly prepared lysozyme (5 mg/ml in TE buffer used above), mix carefully and incubate on ice for 20-40 min
- Add 0.3 ml of precooled Triton buffer (0.1% Triton X-100, 0.05 M Tris, pH
- 8.5, 0.05 M EDTA), incubate on ice for 20 min and centrifuge at 4°C for 4 min
- Transfer clear supernatant into new tube and add 4 μl of diethyloxydiformiate, mix gently
- Incubate for 15 min at 70°C, cool for 15 min to RT, then incubate on ice for 15 min
- Centrifuge for 4 min, transfer supernatant into new tube, fill up with ¬20°C ethanol for DNA precipitation, mix gently
- Centrifuge for at least 30 min at RT, dry pellet in vacuum dessiccator and resuspend in storage TE buffer or in RNase buffer (see RNase treatment) before use
Plasmid Isolation from Bacteria © 2011 DSMZ GmbH

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

เทคนิคการแยก1. rapid เดือดวิธีสำหรับ plasmids เล็กใน E. coli (โฮล์มส์แอนด์ควิกเล่ย์ 1981 แก้ไข โดยริกส์และราห์แมคลาชแลน 1986)-วัฒนธรรมใน Eppendorf หลอด 1.5 มิลลิลิตรเครื่องหมุนเหวี่ยง และ resuspend เม็ดใน μl 200 STET บัฟเฟอร์ (ซูโครส 8.0%, 0.5% Triton X-100, 0.05 M EDTA, 0.05 M HCl ทริ ค่า pH 8.0) ประกอบด้วย 10 μl ของ lysozyme การถูก (20 มิลลิกรัม/มิลลิลิตร สดละลายใน H2O) และ 20 μl ZnCl2 (1% ใน H2O)-ฟักประมาณ 100° c เป็นเวลา 45-55 วินาที แล้วเย็นน้ำแข็ง-เครื่องหมุนเหวี่ยงสำหรับ 5 นาที และเพิ่ม supernatant หลอด Eppendorf μl 480 ของผสมคือที่ประกอบด้วย(400 μl isopropanol, 80 μl 5 ม.แอมโมเนียอะซิเตท) ฟักที่ RT 20-30 นาที-เครื่องหมุนเหวี่ยง 5 นาที ล้างเม็ดดีเอ็นเอ ด้วย 70% เอทานอลเย็นสองครั้ง และแห้งใน dessiccator ดูด-เม็ด resuspend μl 20 ของเก็บบัฟเฟอร์ TE หรือ RNase บัฟเฟอร์ (ดูรักษา RNase) ก่อนที่จะใช้สำหรับ agrose เจอิ2. ร้อนวิธีอัลคาไลน์ขนาด plasmid และแบคทีเรีย (Kado & หลิว 1981), แก้ไข-เครื่องหมุนเหวี่ยง 2-3 ml ของวัฒนธรรม resuspend เม็ดใน 1 มิลลิลิตรของโซลูชันที่ประกอบด้วย 0.04 M ทริ - อะซิเต ค่า pH 8.0 (ปรับค่า pH ด้วยกรดอะซิติกน้ำแข็ง) และ 2 mM EDTA-เพิ่ม 2 มล. lysis บัฟเฟอร์ (0.05 M ทริ SDS 3% ค่า pH 12.50 ปรับ ด้วย 2 N NaOH) และผสม-ฟัก 60-68° c 30-45 นาที (ขึ้นกับสายพันธุ์)-เพิ่มตัวอย่าง 6 ml ของฟีนอล/คลอโรฟอร์ม (1:1) และผสมเบา ๆ การ emulsification ปริมาณที่เสร็จสมบูรณ์- Separate phases by centrifugation at 10.000 x g for 15-20 min at RT and transfer the upper aqueous phase carefully (avoid interphase which contains debris) to new tube containing 1 volume of chloroform. Mix and centrifuge again for separation of phases- Recover aqueous phase and use directly for agarose gel3. Lysozyme method for various Gram-negative bacteria (Davis et al.,1980)- Centrifuge 10 ml of culture, resuspend pellet in 1.4 ml of the following TE buffer: 0.01 M Tris, pH 8.5 and 1 mM EDTA. Transfer to Eppendorf tubes and spin for 3 min- Resuspend pellet in 0.4 ml of solution (15% sucrose, 0.05 M Tris, pH 8.5, 0.05 M EDTA), mix vigorously, cool on ice- Add 0.1 ml of freshly prepared lysozyme (5 mg/ml in TE buffer used above), mix carefully and incubate on ice for 20-40 min- Add 0.3 ml of precooled Triton buffer (0.1% Triton X-100, 0.05 M Tris, pH- 8.5, 0.05 M EDTA), incubate on ice for 20 min and centrifuge at 4°C for 4 min- Transfer clear supernatant into new tube and add 4 μl of diethyloxydiformiate, mix gently- Incubate for 15 min at 70°C, cool for 15 min to RT, then incubate on ice for 15 min- Centrifuge for 4 min, transfer supernatant into new tube, fill up with ¬20°C ethanol for DNA precipitation, mix gently- Centrifuge for at least 30 min at RT, dry pellet in vacuum dessiccator and resuspend in storage TE buffer or in RNase buffer (see RNase treatment) before usePlasmid Isolation from Bacteria © 2011 DSMZ GmbH

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เทคนิคการแยก
1 วิธีการเดือดอย่างรวดเร็วสำหรับพลาสมิดเล็ก ๆ ใน E. coli (โฮล์มส์และควิกลีย์ 1981; แก้ไขโดยริกส์ & McLachlan, 1986)
- เครื่องปั่นเหวี่ยง 1.5 มล. ของวัฒนธรรมในหลอด Eppendorf และเม็ด resuspend ใน 200 ไมโครลิตรของ buffer STET (8.0% ซูโครส 0.5% Triton X-100, 0.05 M EDTA, 0.05 M Tris-HCl ค่า pH 8.0) ที่มี 10 ไมโครลิตรของไลโซไซม์ (20 mg / ml ละลายสดใน H2O) และ 20 ไมโครลิตร ZnCl2 (1% ใน H2O)
- บประมาณ 100 ° C เป็นเวลา 45-55 วินาทีแล้วเย็นบนน้ำแข็ง
- เครื่องปั่นเหวี่ยงเป็นเวลา 5 นาทีและเพิ่มใสหลอด Eppendorf มี 480 ไมโครลิตรของผสม
(400 ไมโครลิตร isopropanol 80 ไมโครลิตร 5 M แอมโมเนียมอะซิเตท) ฟักไข่ที่ RT 20-30 นาที
- เหวี่ยงเป็นเวลา 5 นาทีล้างเม็ดดีเอ็นเอกับเอทานอล 70% เย็นสองครั้งและแห้งใน dessiccator สูญญากาศ
- Resuspend เม็ดใน 20 ไมโครลิตรของการจัดเก็บ TE บัฟเฟอร์หรือ RNase บัฟเฟอร์ (ดูรักษา RNase) ก่อนที่จะใช้ สำหรับ agrose เจลอิเลค
2 วิธีด่างร้อนสำหรับขนาดพลาสมิดและแบคทีเรีย (Kado และหลิว 1981) แก้ไข
- เครื่องปั่นเหวี่ยง 2-3 มิลลิลิตรวัฒนธรรม resuspend เม็ดใน 1 มิลลิลิตรของการแก้ปัญหาที่มี 0.04 M tris- อะซิเตท, พีเอช 8.0 (ปรับค่า pH ที่มีกรดอะซิติกน้ำแข็ง ) และ 2 mm EDTA
- เพิ่ม 2 มิลลิลิตรของบัฟเฟอร์สลาย (0.05 M Tris, 3% SDS ค่า pH 12.50 ปรับ 2 N NaOH) และผสม
- บที่ 60-68 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30-45 นาที (ขึ้นอยู่กับสายพันธุ์)
- เพิ่มตัวอย่างร้อน 6 มล. ของฟีนอล / คลอโรฟอร์ม (1: 1) และผสมเบา ๆ ให้เสร็จสมบูรณ์ emulsification
- ขั้นตอนการแยกโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 10.000 XG ประมาณ 15-20 นาทีที่ RT และโอนเฟสน้ำตอนบนระมัดระวัง (หลีกเลี่ยงระหว่างเฟสซึ่งมีเศษ) หลอดใหม่ที่มี 1 ปริมาณของคลอโรฟอร์ม ผสมและแปะอีกครั้งสำหรับการแยกขั้นตอน
- กู้คืนเฟสน้ำและใช้โดยตรง agarose gel ที่
3 (. เดวิส, et al, 1980) วิธีการ lysozyme สำหรับแบคทีเรียแกรมลบต่างๆ
- เครื่องปั่นเหวี่ยง 10 มล. ของวัฒนธรรมเม็ด resuspend 1.4 มิลลิลิตรบัฟเฟอร์ต่อไป TE: 0.01 M Tris ค่า pH 8.5 และ 1 mM EDTA ถ่ายโอนไปยังหลอด Eppendorf และสปินเป็นเวลา 3 นาที
- Resuspend เม็ดใน 0.4 มิลลิลิตร (ซูโครส 15%, 0.05 M Tris พีเอช 8.5, 0.05 M EDTA) วิธีการผสมแรงอากาศเย็นบนน้ำแข็ง
- เพิ่ม 0.1 มิลลิลิตร lysozyme ปรุงสดใหม่ (5 mg / ml ในบัฟเฟอร์ TE ใช้ด้านบน) ผสมอย่างระมัดระวังและฟักบนน้ำแข็งสำหรับ 20-40 นาที
- เพิ่ม 0.3 มิลลิลิตร precooled กันชนไทรทัน (0.1% Triton X-100, 0.05 M Tris พีเอช
- 8.5, 0.05 M EDTA) ฟักบนน้ำแข็งเป็นเวลา 20 นาทีและหมุนเหวี่ยงที่ 4 ° C เป็นเวลา 4 นาที
- โอนใสลงในหลอดใหม่และเพิ่ม 4 ไมโครลิตรของ diethyloxydiformiate ผสมเบา ๆ
- ฟัก 15 นาทีที่ 70 องศาเซลเซียสอากาศเย็นเป็นเวลา 15 นาทีถึง RT แล้วฟักไข่ บนน้ำแข็งนาน 15 นาที
- เครื่องปั่นเหวี่ยง 4 นาทีโอนใสลงในหลอดใหม่กรอกกับเอทานอล¬20° C เป็นเวลาตกตะกอนดีเอ็นเอผสมเบา ๆ
- เครื่องปั่นเหวี่ยงอย่างน้อย 30 นาทีที่ RT, เม็ดแห้งใน dessiccator เครื่องดูดฝุ่นและ resuspend ในการจัดเก็บ บัฟเฟอร์ TE หรือ RNase บัฟเฟอร์ (ดูรักษา RNase) ก่อนที่จะใช้
พลาสมิดแยกจากแบคทีเรีย© 2011 DSMZ GmbH