and the supernatant was discarded.

and the supernatant was discarded. Finally, the pellet was dried at 37 C, dissolved in 100 lLH 2O and stored at -20 C until used.
Wizard DNA extraction
DNA from rapeseed samples (n = 12) were extracted using the Wizard DNA extraction method. One millilitre extraction buffer (1 M Tris–HCl, 1.5 M NaCl, 0.5 M EDTA, 10 % SDS, pH = 8.0) was added to 100 mg of the rapeseed sample and incubated at 60 C for 30 min. Subsequently, a centrifugation step at 14,0009g for 15 min. was performed and 500 lL of the supernatant were transferred to a new tube. 20 lL proteinase K (20 mg mL-1) and 50 lL guanidine-HCl solution (5-M guanidine hydrochloride) were added. The mixture was vortexed and incubated for 3 h at 60 C while shaking. After centrifugation at 14,0009g for 10 min., 250 lL of the clear supernatant were transferred to a new tube and 6.25 lL RNase A (4 mg lL-1) were added, followed by an incubation step at 60 C for 5 min., and 1 mL Wizard resin (Promega, Mannheim, Germany) was added. The mixture was pipetted into the mini columns (Promega, Mannheim, Germany) and vacuum was applied. Afterwards, the column was washed two times using 1 mL 2-propanol (80 %), followed by a centrifugation step at 10,0009g for 2 min. in order to remove residual 2-propanol. After drying the column for 5 min. at room temperature, the DNA was eluted using 100 lL prewarmed (70 C) elution buffer (10 mM Tris–HCl, pH = 9.0). Finally, the column was incubated for 1 min. at room temperature and centrifuged for 1 min. at 10,0009g . The eluted DNA was stored at -20 C until used.
Photometric and fluorimetric analysis
DNA concentration was measured using the Quant-iT PicoGreen dsDNA reagent (Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany) according to the manufacturers’ instructions. DNA purity was checked by analysing the 260/280 nm and 260/230 nm absorbance ratios using Nanodrop spectrophotometer (Thermo Scientific, Langenselbold, Germany).
Quantitative PCR
Quantitative real-time PCR (qPCR) experiments were carried out using the ABI 7900HT (Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany) system. The qPCR master mix consisted of forward primer and reverse primer, hydrolysis probe (synthesised by Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany, HPLC purified), 19 Quanta Biosciences qPCR ToughMix (Gaithersburg, Maryland, USA)

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

และ supernatant ถูกละทิ้ง สุดท้าย เม็ดที่แห้งที่ 37 C ละลายใน 100 lLH 2O และเก็บไว้ที่-20 C จนกว่าจะใช้ตัวช่วยสร้างการสกัดดีเอ็นเอดีเอ็นเอจากตัวอย่างเมล็ดต้นเรพ (n = 12) ถูกสกัดโดยใช้วิธีการสกัดดีเอ็นเอของตัวช่วยสร้าง Millilitre หนึ่งแยกบัฟเฟอร์ (1 M ตรี – HCl, 1.5 M NaCl, 0.5 M EDTA, 10% SDS, pH = 8.0) เพิ่ม 100 มก.อย่างเรพซีด และ incubated ที่ 60 C ใน 30 นาที ในเวลาต่อมา centrifugation ขั้นตอนที่ 14, 0009g สำหรับ 15 นาทีจะทำ และ 500 ของ supernatant จะถูกโอนย้ายไปหลอดใหม่ มีเพิ่ม 20 จะ proteinase K (20 mg mL-1) และโซลูชัน guanidine HCl จะ 50 (guanidine 5 M ไฮโดรคลอไรด์) ส่วนผสม vortexed และ incubated สำหรับ h 3 ที่ 60 C ขณะสั่น หลังจาก centrifugation ที่ 14, 0009g สำหรับ 10 นาที 250 ของ supernatant ชัดเจนจะถูกโอนไปที่หลอดใหม่และ 6.25 จะ RNase (4 mg จะ-1) มี เพิ่ม ตาม ด้วยขั้นตอนบ่มตัวที่ 60 C สำหรับส่วนลด 5 และ 1 mL ช่วยเรซิน (Promega มา เยอรมนี) เข้ามา ส่วนผสมคือ pipetted เป็นคอลัมน์ขนาดเล็ก (Promega มันน์ไฮม์ ประเทศเยอรมนี) และใช้เครื่องดูดฝุ่น คอลัมน์หลัง ที่ล้างครั้งที่สองโดยใช้ 1 mL 2-อย่างไร propanol (80%), ตาม ด้วยขั้นตอน centrifugation 10, 0009g สำหรับการเอาออกอย่างไร propanol 2 เหลือ 2 นาที หลังจากแห้งคอลัมน์สำหรับ 5 นาทีที่อุณหภูมิห้อง ดีเอ็นเอถูก eluted โดยใช้บัฟเฟอร์ elution lL prewarmed (70 C) 100 (ตรี – HCl 10 มม. pH = 9.0) สุดท้าย คอลัมน์ incubated ใน 1 นาทีที่อุณหภูมิห้อง และ centrifuged ใน 1 นาทีที่ 10, 0009g ดีเอ็นเอ eluted ถูกเก็บไว้ที่-20 C จนกว่าจะใช้วิเคราะห์ Photometric และ fluorimetricความเข้มข้นของดีเอ็นเอถูกวัดโดยใช้การ PicoGreen Quant มัน dsDNA รีเอเจนต์ (ชีวิตเทคโนโลยี GmbH ดาร์มส เยอรมนี) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต มีการตรวจสอบความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอ โดยวิเคราะห์ 260/280 nm และ 260/230 nm absorbance อัตราโดยใช้เครื่องทดสอบกรดด่าง Nanodrop (เทอร์โม Scientific, Langenselbold เยอรมนี)PCR เชิงปริมาณเชิงปริมาณแบบ real-time PCR (qPCR) การทดลองได้ดำเนินการโดยใช้ ABI 7900HT (ชีวิตเทคโนโลยี GmbH ดาร์มส เยอรมนี) ระบบการ ผสมหลัก qPCR ประกอบด้วยสีรองพื้นไปข้างหน้าและย้อนกลับพื้น ไฮโตรไลซ์โพรบ (synthesised โดยชีวิตเทคโนโลยี GmbH, purified ตัดท์ เยอรมนี HPLC), 19 เวลาออก Quanta qPCR ToughMix (Gaithersburg แมริแลนด์ สหรัฐอเมริกา)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

และใสทิ้ง สุดท้ายเม็ดแห้งที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส, ละลายใน 100 lLH 2O และเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียสจนใช้.
ตัวช่วยสร้างการสกัดดีเอ็นเอ
จากตัวอย่างดีเอ็นเอเรพซีด (n = 12) ถูกสกัดโดยใช้ตัวช่วยสร้างวิธีการสกัดดีเอ็นเอ หนึ่งมิลลิลิตรบัฟเฟอร์สกัด (1 M Tris-HCl 1.5 M NaCl, 0.5 M EDTA, 10% SDS ค่า pH = 8.0) ถูกบันทึกอยู่ใน 100 มิลลิกรัมของกลุ่มตัวอย่างเรพซีดและบ่มที่ 60 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 นาที ต่อจากนั้นเป็นขั้นตอนการหมุนเหวี่ยงที่ 14,0009g นาน 15 นาที ได้ดำเนินการและ 500 LL ของสารละลายที่ถูกถ่ายโอนไปยังหลอดใหม่ 20 โปร LL k (20 mg ML-1) และ 50 จะแก้ปัญหา guanidine-HCl (5-M ไฮโดรคลอไร guanidine) ถูกเพิ่ม ส่วนผสมที่ถูกการ vortex และบ่มเป็นเวลา 3 ชั่วโมงที่ 60 องศาเซลเซียสขณะที่สั่น หลังจากที่ปั่น 14,0009g เป็นเวลา 10 นาที. 250 LL ของสารละลายที่ชัดเจนถูกโอนไปยังหลอดใหม่และ 6.25 LL RNase (4 มิลลิกรัม LL-1) มีการเพิ่มตามด้วยขั้นตอนการบ่มที่ 60 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที . และ 1 มิลลิลิตรตัวช่วยสร้างเรซิน (Promega, ไฮม์, เยอรมนี) ถูกเพิ่มเข้ามา ส่วนผสมที่ถูกปิเปตลงในคอลัมน์เล็ก (Promega, ไฮม์, เยอรมนี) และสูญญากาศถูกนำมาใช้ หลังจากนั้นคอลัมน์ถูกล้างครั้งที่สองโดยใช้ 1 มิลลิลิตร 2 โพรพาน (80%) ตามด้วยขั้นตอนการหมุนเหวี่ยงที่ 10,0009g เป็นเวลา 2 นาที เพื่อที่จะเอาที่เหลือ 2 โพรพาน หลังจากการอบแห้งคอลัมน์เป็นเวลา 5 นาที ที่อุณหภูมิห้องดีเอ็นเอที่ถูกชะใช้ 100 LL prewarmed (70 องศาเซลเซียส) บัฟเฟอร์ชะ (10 มิลลิ Tris-HCl ค่า pH = 9.0) สุดท้ายคอลัมน์ถูกบ่มเป็นเวลา 1 นาที ที่อุณหภูมิห้องและปั่นเป็นเวลา 1 นาที ที่ 10,0009g ดีเอ็นเอชะถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียสจนใช้.
แสงและการวิเคราะห์ชั้น uorimetric
เข้มข้นดีเอ็นเอถูกวัดโดยใช้ควอนท์-iT PicoGreen dsDNA สาร (ชีวิตเทคโนโลยี GmbH, Darmstadt, เยอรมนี) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ความบริสุทธิ์ดีเอ็นเอถูกตรวจสอบโดยการวิเคราะห์ 260/280 นาโนเมตรและอัตราส่วนการดูดกลืนแสงนาโนเมตรโดยใช้ 260/230 spectrophotometer Nanodrop (เทอร์โม scienti สาย C, Langenselbold, เยอรมนี).
ปริมาณ PCR
เชิงปริมาณแบบ real-time PCR (qPCR) ทดลองดำเนินการโดยใช้ ABI 7900HT (ชีวิต เทคโนโลยี GmbH, Darmstadt, เยอรมนี) ระบบ ผสมต้นแบบ qPCR ประกอบด้วยไพรเมอร์ไพรเมอร์ไปข้างหน้าและย้อนกลับสอบสวนย่อยสลาย (สังเคราะห์โดยชีวิตเทคโนโลยี GmbH, Darmstadt, เยอรมนี, HPLC Puri เอ็ด FI) 19 ควอนตั้มชีววิทยาศาสตร์ qPCR ToughMix (Gaithersburg, Maryland, USA)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

และนำมันทิ้ง ในที่สุด , เม็ดแห้งที่อุณหภูมิ 37  C ละลาย 100 llh เหลืองและเก็บไว้ที่ - 20 องศาเซลเซียส จน  ใช้

ตัวช่วยสร้างการสกัดดีเอ็นเอดีเอ็นเอจากตัวอย่างเรปซีด ( n = 12 ) ถูกสกัดโดยใช้ตัวช่วยสร้างการสกัดดีเอ็นเอวิธี หนึ่งมิลลิลิตรการสกัดบัฟเฟอร์ ( 1 เมตร ทั้งนี้ – HCl , 1.5 M NaCl 0.5 M EDTA 10% SDS , pH = 80 ) คือเพิ่ม 100 mg ของเมล็ดต้นตัวอย่างและบ่มที่อุณหภูมิ 60 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 นาที  เมื่อ ขั้นตอนที่ 3 140009g เป็นเวลา 15 นาที และจะถูกดำเนินการ 500 และน่านมีการโอนท่อใหม่ 20 จะโปร K ( 20 mg แน่นอน ) และ 50 จะกัวนิดีนกรดไฮโดรคลอริก ( 5-m กัวนิดีน ไฮโดรคลอไรด์ ) มีการเพิ่ม ส่วนผสม vortexed บ่มเป็นเวลา 3 ชม. ที่ 60  C ในขณะที่สั่นหลังการปั่นเหวี่ยงที่ 140009g 10 นาทีของนำใส 250 จะถูกโอนไปยังหลอดใหม่และ 6.25 จะเลส ( 4 มิลลิกรัม ll-1 ) เพิ่มขึ้น ตามขั้นตอนที่ 1  60 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที , เรซินพ่อมด 1 ml ( promega Mannheim , เยอรมนี ) คือเพิ่ม ส่วนผสม pipetted ลงมินิ คอลัมน์ ( promega Mannheim , เยอรมัน ) และ สูญญากาศ คือใช้ หลังจากนั้นคอลัมน์ล้าง 2 ครั้ง โดยใช้โพรพานอล 1 ml ( 80% ) , ตามด้วย 3 ขั้นตอนที่ 100009g 2 นาทีเพื่อลบโพรพานอลที่เหลือ หลังการอบแห้งคอลัมน์สำหรับ 5 นาทีที่อุณหภูมิห้องโดยใช้ดีเอ็นเอตัวอย่าง 100 จะ prewarmed ( 70  C ) ใช้บัฟเฟอร์ ( 10 มม. นอกจากนี้ –กรดไฮโดรคลอริก pH = 9.0 ) สุดท้าย คอลัมน์ที่ถูกบ่มเป็นเวลา 1 นาทีที่อุณหภูมิห้องและที่ระดับ 1 นาทีที่ 100009g . ตัวอย่างดีเอ็นเอที่ถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิ - 20 องศาเซลเซียส จน  ใช้ .
แสงfl uorimetric และการวิเคราะห์ดีเอ็นเอจะถูกวัดโดยใช้ความเข้มข้น
จํานวนมัน picogreen dsdna Reagent ( ไลฟ์ เทคโนโลยี GmbH , ดาร์มสตัดท์ , เยอรมนี ) ตามที่ผู้ผลิตแนะนำดีเอ็นเอตรวจสอบความบริสุทธิ์โดยวิเคราะห์ 260 / 280 nm และ 260 / 230 nm ค่าอัตราส่วนการใช้ nanodrop Spectrophotometer ( เทอร์โม scienti จึง C langenselbold , เยอรมนี )

เทคนิคเชิงปริมาณแบบเรียลไทม์พีซีอาร์ ( qpcr ) การทดลองใช้อบิ 7900ht ( ไลฟ์ เทคโนโลยี GmbH , ดาร์มสตัดท์ , เยอรมนี ) ระบบ การ qpcr ต้นแบบผสมรองพื้นไปข้างหน้าและย้อนกลับ ประกอบด้วย ไพรเมอร์การสอบสวน ( synthesised ตามไลฟ์ เทคโนโลยี GmbH , ดาร์มสตัดท์ , เยอรมนี , HPLC ปุริจึงเอ็ด ) , 19 qpcr toughmix Quanta BIOSCIENCES ( Gaithersburg , แมรี่แลนด์ , สหรัฐอเมริกา )