2. Material and methods2.1. Bacteri

2. Material and methods
2.1. Bacterial strains and growth conditions
C. perfringens strains used in this study consisted of seven FP
isolates including SM101 (an electroporatable derivative of the type
A FP isolate NCTC8798) (Zhao and Melville, 1998), NCTC8798
(Duncan et al., 1972), E13 (Sarker et al., 2000), NCTC8239,
NCTC10239, FD1041 (Collie et al., 1998), and 6263 (Harrison et al.,
2005). Four strains of type A NFB isolates include NB16 (Sarker
et al., 2000), B40, F4969, and F5603 (Collie et al., 1998). The GRmutants
of C. perfringens SM101 used in this study are DPS103
(gerAA) (Paredes-Sabja et al., 2008), DPS108 (gerKB) (Paredes-Sabja
et al., 2009a), DPS119 (gerKA), DPS122 (gerKC), and DPS122 (pSB18)
(gerKC mutant complemented with wild-type gerKA-KC) (Banawas
et al., 2013). All of the strains were maintained in cooked-meat
medium (Difco, Becton Dickinson, Spark, MD) and stored at
20 C. C. perfringens cultures were revived by growing in 10 ml
fluid thioglycolate broth (FTG) (Difco) for 18e24 h at 37 C.
2.2. Spore preparation and purification
The sporulating cultures of C. perfringens were prepared by a
previously described method (Paredes-Sabja et al., 2009c;
Udompijitkul et al., 2012). Briefly, 0.4 ml aliquots of overnight
FTG culture were transferred into new 10 ml FTG and incubated at
37 C for w8 h. Then, 0.4 ml of actively growing cells were transferred
into 10 ml of freshly prepared DuncaneStrong (DS) sporulation
medium (Duncan and Strong, 1968) and incubated overnight
at 37 C. The presence of spores was confirmed by phase-contrast
microscopy. A large number of C. perfringens spores was obtained
by scaling up the aforementioned procedure in 800 ml DS, and
spores were purified by repeated washing with cold sterile distilled
water until spore suspensions were >99% free of cell debris, sporulating
and germinating cells, as determined by phase-contrast
microscopy. The spore suspensions were adjusted to a final optical
density at 600 nm (OD600) w 6.0 with sterile distilled water and
stored at 80 C until used.
2.3. Preparation of germinant solutions
All tested amino acid (L-isomer) solutions were prepared with
25 mM Na2HPO4 buffer (pH 7.0). The tested compounds were
categorized into five groups, according to their side chain (R
group) (Table 1) (Berg et al., 2006). All amino acids used in this
Table

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. วัสดุและวิธีการ2.1. แบคทีเรียสายพันธุ์และสภาพการเจริญเติบโตC. perfringens สายพันธุ์ที่ใช้ในการศึกษานี้ประกอบด้วย 7 FPแยกรวมทั้ง SM101 (มี electroporatable อนุพันธ์ชนิดFP แยก NCTC8798) (เจียวและ Melville, 1998), NCTC8798(ดันแคนเอ็ด al., 1972), E13 (Sarker et al., 2000), NCTC8239NCTC10239, FD1041 (Collie et al., 1998), และ 6263 (Harrison et al.,2005) 4 สายพันธุ์ชนิด A NFB แยกรวม NB16 (Sarkerและ al., 2000), B40, F4969 และ F5603 (Collie et al., 1998) GRmutantsC. perfringens SM101 ที่ใช้ในการศึกษานี้เป็น DPS103(gerAA) (Paredes Sabja et al., 2008), DPS108 (gerKB) (Paredes-Sabjaal. ร้อยเอ็ด 2009a), DPS119 (gerKA), DPS122 (gerKC), และ DPS122 (pSB18)(gerKC mutant ด้วยชนิดของป่า gerKA KC) (Banawasร้อยเอ็ด al., 2013) ทุกสายพันธุ์ถูกรักษาไว้ในเนื้อสุกปานกลาง (Difco, Becton สัน สปาร์ค MD) และเก็บไว้ที่มีฟื้นฟูวัฒนธรรม 20 C. C. perfringens โดยเติบโตใน 10 mlของเหลว thioglycolate ซุป (FTG) (Difco) สำหรับ h ที่ 37 C. 18e242.2. สปอร์เตรียมและทำให้บริสุทธิ์Sporulating วัฒนธรรมของ C. perfringens ที่เตรียมโดยการก่อนหน้านี้ อธิบายวิธีการ (Paredes Sabja et al. ซี 2009Udompijitkul et al., 2012) สั้น ๆ 0.4 ml aliquots ของแอร์พอร์ตโอเวอร์ไนท์วัฒนธรรม FTG ถูกโอนเข้าใหม่ 10 ml FTG และ incubated ที่C 37 สำหรับ w8 h จากนั้น มีการถ่ายโอน 0.4 ml ของเซลล์การเจริญเติบโตอย่างแข็งขันใน 10 ml ของลิ้ม sporulation DuncaneStrong (DS)ปานกลาง (ดันแคนและแข็ง 1968) และ incubated ค้างคืนที่ 37 เซลเซียส ก็เพาะเฟิร์นได้รับการยืนยัน โดยระยะความคมชัดmicroscopy การ จำนวนเพาะเฟิร์น C. perfringens กล่าวโดยปรับขึ้นกระบวนการดังกล่าวใน DS, 800 ml และเพาะเฟิร์นได้บริสุทธิ์ โดยล้างซ้ำด้วยน้ำเย็นใส่กลั่นน้ำจนกว่าสปอร์พักได้ > 99% ฟรีของเศษเซลล์ sporulatingและ germinating เซลล์ ระยะความคมชัดmicroscopy การ บริการสปอร์ถูกปรับปรุงสุดแสงความหนาแน่นที่ 600 nm (OD600) w 6.0 ด้วยน้ำกลั่นฆ่าเชื้อ และเก็บที่ 80 C จนกว่าจะใช้2.3 การเตรียมการของโซลูชั่น germinantโซลูชั่นทดสอบกรดอะมิโน (L-หลัง) ทั้งหมดได้พร้อม25 มม. Na2HPO4 บัฟเฟอร์ (pH 7.0) สารทดสอบได้แบ่งเป็น 5 กลุ่ม ตามของโซ่ข้าง (Rกลุ่ม) (ตาราง 1) (เบิร์กลักซ์เชอรี่และ al., 2006) กรดอะมิโนทั้งหมดที่ใช้ในการนี้ตาราง

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2. วัสดุและวิธีการ
2.1 สายพันธุ์แบคทีเรียและเงื่อนไขในการเจริญเติบโตของ
ซี สายพันธุ์ perfringens ใช้ในการศึกษาครั้งนี้ประกอบด้วยเจ็ด FP
ไอโซ SM101 (อนุพันธ์ electroporatable ประเภท
FP แยก NCTC8798) (Zhao และเมลวิลล์, 1998), NCTC8798
(ดันแคน et al., 1972), E13 (Sarker et al., 2000) NCTC8239,
NCTC10239, FD1041 (คอลลี่ et al., 1998) และ 6263 (แฮร์ริสัน et al.,
2005) สี่สายพันธุ์ของชนิดเชื้อ NFB รวม NB16 (Sarker
et al., 2000), B40, F4969 และ F5603 (คอลลี่ et al., 1998) GRmutants
ของ C. perfringens SM101 ใช้ในการศึกษาครั้งนี้มี DPS103
(gerAA) (Paredes-Sabja et al., 2008) DPS108 (gerKB) (Paredes-Sabja
et al., 2009A) DPS119 (gerKA) DPS122 (gerKC ) และ DPS122 (pSB18)
(กลายพันธุ์ gerKC ครบครันด้วยป่าชนิด gerKA-KC) (Banawas
et al., 2013) ทุกสายพันธุ์ที่ได้รับการเก็บรักษาไว้ในที่ปรุงสุกเนื้อ
กลาง (Difco, Becton Dickinson, Spark, MD) และเก็บไว้ที่
20 CC วัฒนธรรม perfringens ถูกฟื้นขึ้นมาโดยเพิ่มขึ้นใน 10 ml
ของเหลวน้ำซุป thioglycolate (FTG) (Difco) สำหรับ 18e24 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 C .
2.2 การจัดทำสปอร์และการทำให้บริสุทธิ์
วัฒนธรรมสร้างสปอร์ของ perfringens C. ถูกจัดทำขึ้นโดย
วิธีการอธิบายไว้ก่อนหน้า (Paredes-Sabja, et al, 2009c.
. Udompijitkul, et al, 2012) สั้น ๆ 0.4 มล aliquots ของคืน
วัฒนธรรม FTG ถูกย้ายเข้าไปใหม่ 10 มล FTG และบ่มที่อุณหภูมิ
37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา W8 ชั่วโมง แล้ว 0.4 มลเซลล์เจริญเติบโตอย่างแข็งขันถูกโอน
เป็น 10 มลปรุงสดๆ DuncaneStrong (DS) สร้างสปอร์
กลาง (ดันแคนและแข็งแกร่ง, 1968) และบ่มค้างคืน
ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสการปรากฏตัวของสปอร์ได้รับการยืนยันโดยเฟสตรงกันข้าม
กล้องจุลทรรศน์ จำนวนมากของสปอร์ C. perfringens ที่ได้รับ
จากการปรับขึ้นขั้นตอนดังกล่าวข้างต้นใน 800 มล DS และ
สปอร์ที่ถูกทำให้บริสุทธิ์โดยการล้างซ้ำด้วยกลั่นเย็นผ่านการฆ่าเชื้อ
น้ำจนสปอร์แขวนลอยอยู่> 99% ฟรีเศษเซลล์สร้างสปอร์
และเซลล์งอก, ตามที่กำหนดโดยเฟสตรงกันข้าม
กล้องจุลทรรศน์ สปอร์แขวนลอยถูกปรับให้แสงสุดท้าย
ความหนาแน่นที่ 600 นาโนเมตร (OD600) กว้าง 6.0 ด้วยน้ำกลั่นผ่านการฆ่าเชื้อและ
เก็บไว้ที่ 80 C จนใช้.
2.3 การเตรียมความพร้อมของการแก้ปัญหา germinant
ทั้งหมดกรดอะมิโนที่ผ่านการทดสอบ (L-isomer) โซลูชั่นที่เตรียม
บัฟเฟอร์ 25 มิลลิ Na2HPO4 (pH 7.0) ได้รับสารทดสอบ
แบ่งออกเป็นห้ากลุ่มตามห่วงโซ่ด้านของพวกเขา (R
กลุ่ม) (ตารางที่ 1) (Berg et al., 2006) กรดอะมิโนที่ใช้ในการนี้
ตาราง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2 . วัสดุและวิธีการ
2.1 . สายพันธุ์แบคทีเรียและเงื่อนไขการเจริญเติบโต C . perfringens
สายพันธุ์ที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้ ได้แก่ sm101 เจ็ด FP
ไอโซเลท ( electroporatable ของอนุพันธ์ประเภท : FP แยก nctc8798 ) ( Zhao และ Melville , 1998 ) , nctc8798
( ดันแคน et al . , 1972 ) e13 ( Sarker et al . , 2000 ) nctc8239
nctc10239 , fd1041 ( คอลลี่ , et al . , 1998 ) และ 6263 ( Harrison et al . ,
2005 )สี่สายพันธุ์ของเชื้อ ได้แก่ ประเภท nfb nb16 ( Sarker
et al . , 2000 ) , ขาด f4969 , และ f5603 ( แกะ et al . , 1998 ) การ grmutants
C . perfringens sm101 ที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้ เป็น dps103
( geraa ) ( Paredes sabja et al . , 2008 ) , dps108 ( gerkb ) ( Paredes sabja
et al . , 2009a ) dps119 ( gerka ) dps122 ( gerkc ) และ dps122 ( psb18 )
( gerkc กลายพันธุ์ ครบครันด้วยยา gerka KC ) ( banawas
et al . , 2013 )ทั้งหมดของสายพันธุ์รักษาในสุกกลางเนื้อ
( difco เบคตอนดิกคินสัน , จุดประกาย , MD ) และเก็บรักษาที่อุณหภูมิ 20 C . C . perfringens
วัฒนธรรมถูก revived โดยการเติบโตใน 10 ml
ของเหลวไทโอไกลโคเลต broth ( ftg ) ( difco ) สำหรับ 18e24 H ที่ 37 C .
2.2 . การเตรียมการและการผลิตสปอร์สปอร์
C . perfringens วัฒนธรรมถูกเตรียมโดย
ก่อนหน้านี้อธิบายวิธี ( Paredes sabja et al . , 2009c ;
udompijitkul et al . , 2012 ) สั้น , 0.4 มล. เฉยๆของคืน
ftg วัฒนธรรมถูกย้ายเข้าใหม่ 10 มล. ftg บ่มที่ 37 C W8 H .
แล้ว 0.4 มิลลิลิตรอย่างแข็งขันเติบโตเซลล์ถูก
เป็น 10 มิลลิลิตรเตรียมสด duncanestrong ( DS ) สร้างสปอร์
ขนาดกลาง ( ดันแคนและแข็งแรง , 1968 ) และบ่มค้างคืน
ที่ 37 องศาเซลเซียส การปรากฏตัวของสปอร์ถูกยืนยันด้วยกล้องจุลทรรศน์ตรงกันข้าม
เฟสตัวเลขขนาดใหญ่ของ C . perfringens สปอร์ได้
โดยปรับขึ้นกระบวนการดังกล่าวใน DS 800 มิลลิลิตร และสปอร์มีความบริสุทธิ์ โดยล้างซ้ำ

น้ำกลั่นเย็นปลอดเชื้อจนกว่าสปอร์แขวนลอย ( > 99% ฟรีของเศษเซลล์และเซลล์ผลิตสปอร์งอก
, เมื่อพิจารณาจากกล้องจุลทรรศน์ตรงกันข้าม
เฟส การสร้างสปอร์แขวนลอย ( ปรับแสง
ครั้งสุดท้ายความหนาแน่นที่ 600 nm ( od600 ) W 6.0 กับหมันน้ำกลั่นและเก็บรักษาที่อุณหภูมิ 80 องศาเซลเซียส จนกระทั่งใช้
.
2.3 การเตรียม germinant โซลูชั่น
ทดสอบทั้งหมดกรดอะมิโน ( l-isomer ) โซลูชั่นเตรียมด้วย
na2hpo4 25 มม. ( บัฟเฟอร์ pH 7.0 ) การทดสอบสารประกอบถูก
แบ่งออกเป็น 5 กลุ่ม ตามข้างโซ่ ( r
2 ) ( ตารางที่ 1 ) ( Berg et al . , 2006 ) ทั้งหมดกรดอะมิโนที่ใช้ในนี้

โต๊ะ