ELISA protocolIgG was prepared by c

ELISA protocol
IgG was prepared by chromatography on Protein A Sepharose. Puri®ed BS1-IgG was coupled to biotin; the BS1-IgG was separated from the free biotin by gel ®ltration (Guesdon et al. 1979).
One hundred microlitre volumes were used in each well for the ELISA, unless stated otherwise, with samples loaded in duplicate and incubation stages carried out in a humid chamber at 37 C. Samples and standards were
diluted in PBST (0
05 mol lÿ1 phosphate, 0
15 mol lÿ1 NaCl, 0
01% Tween 20, pH 7
4), which was supplemented
with 1% bovine serum albumin (BSA) for the dilution of BS1-IgG-biotin and streptavidin-alkaline phosphatase. In between each stage, plates (Dyrex Technologies,Billinghurst, UK) were washed three times with PBST.
Plates were coated with BS1-IgG diluted to 5 mg mlÿ1 in50 mmol lÿ1 carbonate bicarbonate buffer, pH 9
6, and
incubated for 3 h. Plates were blocked with 1% (w/v) BSA in carbonate bicarbonate buffer (200 ml per well) and incubated for 1 h. Samples, standards and marker wells (i.e. ablank (PBST) and a positive control containing a BS1 Lform
suspension at a protein concentration of 1
7 mg mlÿ1)
were loaded in duplicate. After overnight incubation at 4 C, 0
3 mg mlÿ1 BS1-IgG-biotin was added and incubated
for 3 h. This was followed by streptavidin-alkaline phosphatase
(Amersham Pharmacia Biotech UK, Little
Chalfont, UK) diluted to 1/1000 and incubated for 1 h.
The substrate, 2 mg mlÿ1 p-nitrophenol phosphate (Sigma,
Poole, UK) in 0
1 mol l
ÿ1 glycine buffer with 1 mmol l
ÿ1
MgCl2 and 1 mmol l
ÿ1 ZnCl2, pH 10
4, was added. The
reaction was developed in the dark at room temperature for
approximately 20±40 min and plates then read at 405 nm
(MRX Microplate reader; KPL). The positive/negative
threshold was the mean absorbance of control wells ‡4
standard deviations (C ‡ 4 S.D.; Sutula et al. 1986).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

โพรโทคอล ELISAIgG ถูกเตรียม chromatography บนโปรตีน ASepharose Puri® ed BS1 IgG ถูกควบคู่กับไบโอติน การBS1 IgG ถูกแยกออกจากไบโอตินฟรี โดยเจล® เป็น(Guesdon et al. 1979)ใช้ปริมาณหนึ่งร้อย microlitre ในแต่ละดีสำหรับ ELISA เว้นแต่ระบุไว้เป็นอย่างอื่น ตัวอย่างโหลดในขั้นตอนที่ดำเนินการซ้ำและบ่มตัวห้องชื้นที่ 37 C. ตัวอย่างและมาตรฐานได้เจือจางใน PBST (โมล 0 05 lÿ1 ฟอสเฟต 0 15 mol lÿ1NaCl, 0 01% แต่ 20, pH 7 4), ซึ่งถูกเสริมกับ 1% วัว serum albumin (บีเอสเอ) สำหรับการเจือจางของBS1-IgG-ไบโอติน และ streptavidin อัลคาไลน์ฟอสฟา ในระหว่างแต่ละขั้นตอน แผ่น (เทคโนโลยี DyrexBillinghurst, UK) ถูกล้าง 3 ครั้ง ด้วย PBSTแผ่นถูกเคลือบ ด้วย BS1 IgG เจือจางให้ 5 มก. mlÿ1 in50 มิลลิโมลต่อลิตรÿ1 คาร์บอเนตไบคาร์บอเนตบัฟเฟอร์ 9 6 ค่า pH และได้รับการกกสำหรับแผ่น 3 h. ได้ถูกบล็อก ด้วย 1% (w/v) บีเอสเอในคาร์บอเนต ไบคาร์บอเนตบัฟเฟอร์ (200 มิลลิลิตรต่อ) และได้รับการกกสำหรับตัวอย่างที่ 1 h. มาตรฐาน และหลุมหมาย (เช่นเป็นว่าง (PBST) และการควบคุมเชิงบวกที่ประกอบด้วยการ Lform BS1ระบบกันสะเทือนที่ความเข้มข้นของโปรตีนของ mlÿ1 7 มิลลิกรัม 1)โหลดซ้ำได้ หลังจากบ่มข้ามคืนที่ 4 C, mlÿ1 3 มก. 0 เพิ่ม และได้รับการกก BS1-IgG-ไบโอตินสำหรับ 3 h แล้ว streptavidin อัลคาไลน์ฟอสฟา(ไบโอเทคฟาร์ Amersham UK น้อยชาร์ฟอร์นเซน UK) เจือจาง 1/1000 และ 1 ชม.ได้รับการกกพื้นผิว ฟอสเฟต p-nitrophenol mlÿ1 2 มิลลิกรัม (Sigmaพูล สหราชอาณาจักร) ใน 0 1 mol lบัฟเฟอร์ glycine ÿ1 กับ 1 มิลลิโมลต่อลิตรÿ1MgCl2 และ 1 มิลลิโมลต่อลิตรÿ1 ZnCl2, pH 10 4 ถูก การปฏิกิริยาที่ได้รับการพัฒนาในมืดที่อุณหภูมิห้องประมาณ 20±40 นาทีและแผ่นอ่านแล้วที่ 405 nm(อ่าน MRX Microplate KPL) บวกเป็นค่าลบเกณฑ์คือ ค่าเฉลี่ยของหลุมควบคุม 4ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน (C 4 S.D. Sutula et al. 1986)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วิธี ELISA โปรโตคอล
IgG ถูกจัดทำขึ้นโดยโครมาโตในโปรตีน
Sepharose Puri®ed BS1-IgG ถูกคู่กับไบโอติน;
BS1-IgG ถูกแยกออกจากไบโอตินฟรีโดยเจล®ltration
(Guesdon et al. 1979).
หนึ่งร้อยเล่มไมโครลิตรถูกนำมาใช้ในแต่ละดี
สำหรับวิธี ELISA ยกเว้นที่ระบุไว้เป็นอย่างอื่นกับกลุ่มตัวอย่าง
ในการโหลดที่ซ้ำกันและการบ่มขั้นตอนการดำเนินการใน
ห้องชื้นที่ 37 องศาเซลเซียส ตัวอย่างและมาตรฐานถูก
เจือจางใน PBST (0? 05 mol L
Y1 ฟอสเฟต, 0? 15 mol L
Y1
โซเดียมคลอไรด์, 0? 01% Tween 20 พีเอช 7? 4) ซึ่งได้รับการเสริม
ด้วย 1% อัลบูมิวัวซีรั่ม (BSA) สำหรับ การลดสัดส่วนของ
BS1-IgG-ไบโอตินและฟอสฟาเตอัลคาไลน์ ใน
ระหว่างแต่ละขั้นตอน, จาน (Dyrex Technologies,
Billinghurst สหราชอาณาจักร) ถูกล้างสามครั้งด้วย PBST.
แผ่นถูกเคลือบด้วย BS1-IgG ลดลงเหลือ 5 mlÿ1มิลลิกรัม in50 มิลลิโมลต่อลิตร
Y1 คาร์บอเนตบัฟเฟอร์ไบคาร์บอเนตค่า pH 9 6 และ
บ่มเป็นเวลา 3 H แผ่นถูกบล็อกด้วย 1% (w / v) บีเอสเอ
ในบัฟเฟอร์ไบคาร์บอเนตคาร์บอเนต (200 มิลลิลิตรต่อกัน) และบ่ม
เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ตัวอย่างมาตรฐานและเครื่องหมายหลุม (เช่น
ว่าง (PBST) และการควบคุมในเชิงบวกที่มี BS1 Lform
ระงับที่มีความเข้มข้นของโปรตีน 1? 7 มิลลิกรัมmlÿ1
)
ถูกโหลดในที่ซ้ำกัน หลังจากการบ่มค้างคืนที่ 4? C, 0? 3 มิลลิกรัมmlÿ1 BS1-IgG-ไบโอตินถูกเพิ่มเข้ามาและบ่ม
เป็นเวลา 3 ชั่วโมง นี้ตามมาด้วยสเตอัลคาไลน์ฟอสฟา
(Amersham Pharmacia ไบโอเทคสหราชอาณาจักรเล็ก ๆ น้อย ๆ
Chalfont สหราชอาณาจักร) ลดลงเหลือ 1/1000 และบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมง.
สารตั้งต้น, 2 มิลลิกรัมmlÿ1 P-nitrophenol ฟอสเฟต (Sigma,
พูล, สหราชอาณาจักร) ใน 0? 1 mol L
บัฟเฟอร์ Y1 glycine 1 มิลลิโมลต่อลิตร
Y1
MgCl2 และ 1 มิลลิโมลต่อลิตร
Y1 ZnCl2 ค่า pH 10? 4 ถูกเพิ่มเข้ามา
ปฏิกิริยาได้รับการพัฒนาในความมืดที่อุณหภูมิห้อง
ประมาณ 20 ± 40 นาทีและแผ่นแล้วอ่านที่ 405 นาโนเมตร
(MRX ไมโครอ่าน; KPL) บวก / เป็นลบ
เกณฑ์การดูดกลืนแสงเป็นค่าเฉลี่ยของการควบคุมหลุม ?? 4
ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (C ?? 4 SD; Sutula et al, 1986).