Approximately 200g of frozen xylem

Approximately 200g of frozen xylem were ground to a
powder in a Waring Blendor cooled with liquid nitrogen. The
powder was then transferred to a glass beaker and a twofold
(v/w) excess of buffer A added. The frozen mixture was stirred
gently with a spatula until the buffer thawed, then squeezed
through 10 layers of cheesecloth (premoistened with buffer A)
and filtered through one layer of Miracloth.
The filtrate was centrifuged at 20,000g for 30 min. Ammonium
sulfate fractionation was carried out on the supernatant,
and the fraction precipitating between 40 and 70% of
saturation was taken for further purification. The precipitate
was resuspended in a minimum volume of buffer B and
dialyzed against two changes of buffer B. Insoluble material
was removed by centrifugation at 14,000g for 20 min. The
supernatant was diluted to a protein concentration of less
than 15 mg/mL and loaded onto a 2.5 x 20-cm column of
DEAE-Sephacel. The column was washed with buffer B until
the protein content of the effluent returned to baseline level,
determined by an in-line UV monitor. A linear gradient
elution was then carried out with 250 mL each of buffer B
and buffer C, and 5-mL fractions were collected.
Fractions containing PAL activity were pooled and concentrated
to 1 mL using centrifugal ultrafiltration devices (Centriprep
30; Amicon). The concentrated material was then
loaded onto a 1.5 x 80-cm Sephacryl S-300 gel filtration
column and eluted with buffer D, and 2-mL fractions were
collected. Fractions containing PAL activity were pooled and
concentrated as before, and the purified enzyme preparation
stored at -70°C. The S-300 column was calibrated for native
mol wt determination using marker proteins from Sigma:
bovine thyroglobulin (Mr 669,000), equine apoferritin (Mr
443,000), sweet potato p3-amylase (Mr 200,000), yeast alcohol
dehydrogenase (Mr 150,000), and BSA (Mr 66,000).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ประมาณ 200 กรัมของ xylem แช่แข็งถูกพื้นดินที่จะเป็นผงใน Blendor มี Waring เย็น ด้วยไนโตรเจนเหลว การผงแล้วโอนย้ายไปบีกเกอร์แก้วและเป็นสองเท่าส่วนเกิน (v/w) ของบัฟเฟอร์เพิ่ม A กวนผสมแช่แข็งด้วยไม้พายจนกระทั่งเตรียมบัฟเฟอร์ แล้ว บีบเบา ๆผ่าน 10 ชั้นของผ้า (premoistened กับบัฟเฟอร์ A)และกรองผ่านชั้นหนึ่งของ Miraclothการกรองถูกจากที่ 20,000 กรัมสำหรับ 30 นาทีแอมโมเนียซัลเฟตแยกดำเนินการบน supernatantและเศษส่วนหยดระหว่าง 40 ถึง 70% ของอิ่มถูกนำสำหรับการทำให้บริสุทธิ์ต่อไป ตะกอนถูก resuspended ในปริมาณต่ำสุดของบัฟเฟอร์ B และdialyzed กับการเปลี่ยนแปลงสองบัฟเฟอร์ละลายข.วัสดุถูกเอาออก โดยการหมุนเหวี่ยงที่ 14,000 กรัมสำหรับ 20 นาทีการsupernatant ถูกเจือจางให้ความเข้มข้นของโปรตีนน้อยกว่า 15 มิลลิกรัม/มิลลิลิตร และโหลดลงคอลัมน์ 2.5 x 20 ซม.DEAE-Sephacel คอลัมน์ถูกล้าง ด้วยบัฟเฟอร์ที่ B จนถึงปริมาณโปรตีนของน้ำกลับไปยังพื้นฐานระดับกำหนด โดยจอภาพ UV ในสาย การไล่ระดับสีเชิงเส้นชะแล้วดำเนินการกับ 250 mL แต่ละบัฟเฟอร์ Bและเก็บบัฟเฟอร์ C และเศษส่วน 5 มิลลิลิตรเศษส่วนที่ประกอบด้วยกิจกรรม PAL พู และเข้มข้นไป 1 มล.โดยใช้อุปกรณ์กรองแรงเหวี่ยง (Centriprep30 Amicon) วัสดุที่เข้มข้นได้แล้วโหลดไปยังเครื่องกรองเจ Sephacryl S-300 1.5 x 80 ซม.คอลัมน์ และ eluted กับบัฟเฟอร์ D และก็เศษส่วน 2 มิลลิลิตรการเก็บรวบรวม เศษส่วนที่ประกอบด้วยกิจกรรม PAL ได้พู และเข้มข้นเป็นมาก่อน และการเตรียมเอนไซม์บริสุทธิ์เก็บที่-70 องศาเซลเซียส S-300 คอลัมน์ถูกตั้งค่าสำหรับพื้นเมืองwt โมลกำหนดใช้เครื่องหมายโปรตีนจากซิกม่า:วัว (นาย 669,000), ฟอสฟา apoferritin ม้า (Mr443,000), มันฝรั่งหวาน p3-อะไมเลส (Mr 200,000), ยีสต์แอลกอฮอล์พร่อง (150,000 นาย), และบีเอสเอ (66,000 นาย)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ประมาณ 200g ของท่อน้ำแช่แข็งมาบดให้เป็น
ผงใน Waring Blendor ระบายความร้อนด้วยไนโตรเจนเหลว
ผงนั้นก็ย้ายไปบีกเกอร์แก้วและสองเท่า
(v / w) ส่วนเกินของบัฟเฟอร์เพิ่ม ส่วนผสมที่แช่แข็งถูกกวน
เบา ๆ ด้วยไม้พายจนบัฟเฟอร์ละลายแล้วบีบ
ทั้งหมด 10 ชั้นของผ้า (premoistened กับบัฟเฟอร์ A)
และกรองผ่านชั้นหนึ่ง Miracloth.
กรองถูกหมุนเหวี่ยงที่ 20,000g เป็นเวลา 30 นาที แอมโมเนียม
ซัลเฟตแยกได้ดำเนินการในสารละลายที่
และเศษทำให้เกิดความวุ่นวายระหว่าง 40 และ 70% ของ
ความอิ่มตัวของสีถูกนำสำหรับการทำให้บริสุทธิ์ต่อไป ตะกอน
ถูก resuspended ในปริมาณขั้นต่ำของบัฟเฟอร์ B และ
dialyzed กับสองการเปลี่ยนแปลงของวัสดุที่ไม่ละลายน้ำบัฟเฟอร์บี
ถูกลบออกโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 14,000g สำหรับ 20 นาที
สารละลายเจือจางความเข้มข้นของโปรตีนน้อย
กว่า 15 mg / ml และโหลดลงในคอลัมน์ 2.5 x 20 ซม. ของ
DEAE-Sephacel คอลัมน์ถูกล้างด้วยบัฟเฟอร์ B จนกว่า
ปริมาณโปรตีนของน้ำทิ้งกลับไปที่ระดับพื้นฐาน
กำหนดโดยจอภาพรังสียูวีในสายการผลิต ลาดเชิงเส้น
ชะได้ดำเนินการแล้วออกมาพร้อมกับ 250 มลแต่ละบัฟเฟอร์ B
และ buffer C, และเศษส่วน 5 มิลลิลิตรถูกเก็บรวบรวม.
เศษส่วนที่มีกิจกรรม PAL ถูกรวบรวมและเข้มข้น
1 มิลลิลิตรใช้อุปกรณ์กรองแรงเหวี่ยง (Centriprep
30 Amicon) วัสดุที่มีความเข้มข้นแล้ว
โหลดลง 1.5 x 80 ซม Sephacryl S-300 กรองเจล
คอลัมน์และชะด้วยบัฟเฟอร์ D, และเศษส่วน 2 มิลลิลิตรถูก
เก็บรวบรวม เศษส่วนที่มีกิจกรรม PAL ถูกรวบรวมและ
เข้มข้นเป็นมาก่อนและการเตรียมเอนไซม์
ที่เก็บไว้ที่อุณหภูมิ -70 องศาเซลเซียส คอลัมน์ S-300 ได้รับการสอบเทียบสำหรับพื้นเมือง
mol การกำหนดน้ำหนักโดยใช้โปรตีนเครื่องหมายจากซิกม่า:
thyroglobulin วัว (นาย 669000) apoferritin ม้า (นาย
443,000) มันเทศ P3 อะไมเลส (นาย 200,000) ยีสต์แอลกอฮอล์
dehydrogenase (นาย 150,000) และบีเอสเอ (นาย 66,000)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ประมาณ 200 กรัมของไซเลม มีพื้นดินต้องแช่แข็งผงในสินค้า blendor เย็นด้วยไนโตรเจนเหลว ที่แป้งฝุ่นแล้วโอนไปยังบีกเกอร์และสองเท่า( v / w ) ส่วนเกินของบัฟเฟอร์มีเพิ่ม แช่แข็งผสมกวนเบา ๆด้วยไม้พายจนกระทั่งบัฟเฟอร์ละลายแล้วบีบผ่าน 10 ชั้นของผ้า ( premoistened บัฟเฟอร์ )และกรองผ่านชั้นของ miracloth .หนักเป็นระดับที่ 20000g เป็นเวลา 30 นาที แอมโมเนียมส่วนซัลเฟตได้ดําเนินการในนำ ,และส่วนตกตะกอนระหว่าง 40 และ 70 เปอร์เซ็นต์การถ่ายเป็นหลักฐานต่อไป การตกตะกอนคือ resuspended ในปริมาณขั้นต่ำของบัฟเฟอร์ B และผ่านการเปลี่ยนแปลงของบัฟเฟอร์ต่อสองน้ำวัสดุ .จะถูกลบออกโดยการปั่นเหวี่ยงที่ 14000g 20 นาทีเจือจาง เพื่อนำโปรตีนน้อยกว่า 15 mg / ml และโหลดลงในคอลัมน์ของ 2.5 x 20 ซม.การทำเอนไซม์ . คอลัมน์ B จนถึงล้างบัฟเฟอร์ปริมาณโปรตีนในน้ำทิ้งกลับมาในระดับพื้นฐานกำหนดโดย UV ในจอภาพ ลาดเชิงเส้นได้มาแล้วดำเนินการกับแต่ละบัฟเฟอร์บี 250 มิลลิลิตรบัฟเฟอร์ซี และ 5-ml เศษส่วนที่ถูกบุกรุกเศษส่วนที่มีกิจกรรมเพื่อนถูก pooled และเข้มข้น1 มิลลิลิตรโดยใช้อุปกรณ์กรองแรงเหวี่ยง ( centriprep30 ; amicon ) แบบวัสดุแล้วโหลดลง 1.5 x 80 ซม. sephacryl s-300 เจลฟิลคอลัมน์และตัวอย่างกับบัฟเฟอร์ D และ 2-ml เศษส่วนคือรวบรวม เศษส่วนที่มีกิจกรรมและเพื่อนถูก pooledเข้มข้นเช่นเดิม และการเตรียมเอนไซม์บริสุทธิ์เก็บที่อุณหภูมิ - 70 องศา C s-300 คอลัมน์สอบเทียบสำหรับพื้นเมืองการใช้โปรตีนจาก WT โมลเครื่องหมายซิกม่า :ไทโรโกลบูลินวัว ( นาย 669000 ) , ม้าการส่งเสียงอึกทึก ( อ.443000 ) อะไมเลส P3 มันฝรั่งหวาน ( นาย 200000 ) แอลกอฮอล์ยีสต์ดีไฮโดรจีเนส ( คุณ 150 , 000 ) และกลุ่มนาย 66000 )