3.2. Column chromatographic purific

3.2. Column chromatographic purification of the monoclonal human
IgGs using adsorbents derived from the immobilised 40-TerPSEA
Based on the above findings, the potential of the immobilised
pyridine-based ligands (Fig. 1) in the purification of mAbs was validated,
using 40-TerPSEA as the preferred exemplar, in packed bed
chromatographic experiments. Under the chosen volume overload
and wash conditions used in these small scale laboratory experiments,
on average the losses at the breakthrough and wash stages
accounted for between 15% and 20% of the loaded mAb content.
Obviously, with design-of-experiment (DoE) optimised experimental
conditions, these losses at the load and wash stages could be

with each adsorbent were different for the three humanised IgG
mAb samples. While the humanised IgG1 mAb showed a broader
gradient elution peak (Fig. 4A), the humanised IgG2 mAb eluted
as both a lower abundance peak at a similar gradient position followed
by a later eluting, more abundant peak (Fig. 5A). SDS-PAGE
analysis of the recovered fractions (Fig. 5B) indicated that the
humanised IgG2 mAb was predominantly found in the later eluting
fractions. Thus, under these conditions, the humanised IgG2 mAb
bound more strongly than the humanised IgG1 mAb to the immobilised
40-TerPSEA ligand, a finding consistent with the batch
adsorption studies. The chromatographic profile for the humanised
IgG4 mAb was similar to the result obtained with the humanised
IgG1 mAb with a major peak followed by a lower abundance peak
of longer retention time (Fig. 6A). The majority of IgG4 was contained
in the first peak as evident from SDS-PAGE analysis (Fig. 6B).
The binding of mAbs to this new class of immobilised ligands is
a consequence of the interplay of multiple physicochemical effects,
including electrostatic and hydrophobic interactions, typical of
mixed mode adsorbents. Moreover, these results suggest the possibility
that these ligands may have the capability to bind independently
to two (or more) sites within the IgG mAbs, a possibility
that is under current investigation. Nevertheless, changes in the
buffer composition or pH are anticipated to lead to subtle variations
in selectivity for IgG mAbs of different isotype, depending
on their structural and physical attributes. For instance, the
humanised IgG2 mAb has a lower pI value (pI 7.4) than the humanised
IgG1 or IgG4 mAbs (both with pI 8.0 respectively) [28]. When
the loading buffer is set at pH 8.0, the humanised IgG2 mAb will be
more negatively charged than the humanised IgG1 or IgG4 mAb.
These differences may influence the propensity to self-associate
and form dimers/aggregates [29] and this may account for the fact
that the humanised IgG1 or IgG4 mAbs eluted as broader peaks, yet
upon SDS-PAGE analysis under non-reducing conditions, these
eluted fractions behaved as intact IgGs, i.e. as 160 kDa proteins
together with minor, lower molecular weight species generated
from the heat-induced fragmentation of these IgGs. The generation
of such lower molecular weight mAb fragments has been as noted
previously [24] and confirmed by MALDI-TOF MS analysis [19,20].

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

3.2. คอลัมน์โครมาบริสุทธิ์ของมนุษย์โมโนIgGs ใช้ adsorbents มาจาก immobilised 40-TerPSEAตามประเด็นข้างต้น ศักยภาพของการ immobilisedใช้ pyridine ligands (รูปที่ 1) ในการทำให้บริสุทธิ์ของ mAbs ถูกตรวจสอบใช้ 40-TerPSEA เป็นที่ต้องการเพื่อ บรรจุเตียงการทดลองโครมา ภายใต้การโอเวอร์โหลดเสียงท่านเงื่อนไขที่ใช้ในการทดลองห้องปฏิบัติการขนาดเล็กเหล่านี้ ความสะอาดบนเฉลี่ยการสูญเสียในขั้นตอนการล้างและความก้าวหน้าคิดเป็น 15% และ 20% ของโหลดมาบอย่างชัดเจน มีการออกแบบการทดลอง (DoE) เหมาะทดลองเงื่อนไข สูญเหล่านี้ในขั้นตอนการล้างและโหลดอาจจะมี adsorbent แต่ละแตกต่างกันสำหรับหา igg จำเพาะ humanised สามตัวอย่างมาบ ในขณะที่มาบ IgG1 humanised แสดงให้เห็นว่ากลยุทธ์พีชะไล่ระดับ (รูปที่ 4A) มาบ IgG2 humanised ที่ elutedเป็นทั้งความอุดมสมบูรณ์ต่ำ ตามยอดที่ตำแหน่งไล่ระดับสีที่คล้ายกันโดยภายหลัง eluting มากสูงสุด (รูป 5A) SDS-หน้าการวิเคราะห์เศษกู้คืน (รูป 5B) ระบุว่า การมาบ IgG2 humanised ส่วนใหญ่พบใน eluting ภายหลังเศษส่วน ดังนั้น ภายใต้เงื่อนไขเหล่านี้ มาบ IgG2 humanisedกับขอมากกว่ามาบ IgG1 humanised ที่ immobilisedลิแกนด์ 40 TerPSEA หาที่สอดคล้องกับชุดการศึกษาการดูดซับ โพรไฟล์การโครมาสำหรับการ humanisedมาบ IgG4 ได้เหมือนกับผลที่ได้ที่ humanisedมาบ IgG1 กับ peak สำคัญตาม ด้วยสูงสุดความอุดมสมบูรณ์ต่ำเวลาเก็บข้อมูลนาน (รูปที่ 6A) ส่วนใหญ่ของ IgG4 ประกอบอยู่ในช่วงที่แรกเป็นที่เห็นได้จากการวิเคราะห์หน้า SDS (รูปที่ 6B)เป็นการรวมของ mAbs เพื่อทำใหม่ immobilised ligandsเป็นผลมาจากอิทธิพลของหลายคุณลักษณะผลรวมถึงไฟฟ้าสถิต และแบบโต้ตอบ ของโหมดผสม adsorbents นอกจากนี้ ผลเหล่านี้แนะนำได้ให้ ligands เหล่านี้อาจมีความสามารถในการผูกอย่างอิสระไปยังเว็บไซต์ที่สอง (หรือมากกว่า) ภายใน mAbs หา igg จำเพาะ ความเป็นไปได้ตรวจสอบปัจจุบันได้ อย่างไรก็ตาม การเปลี่ยนแปลงในการองค์ประกอบของบัฟเฟอร์หรือ pH เพื่อนำไปสู่การเปลี่ยนแปลงเล็กน้อยในวิธีสำหรับ mAbs หา igg จำเพาะของ isotype ต่าง ขึ้นอยู่กับในคุณลักษณะของโครงสร้าง ทางกายภาพ เช่น การมาบ IgG2 humanised มีค่าต่ำกว่าปี่ (ปี่ 7.4) กว่าการ humanised(ทั้งกับผีการการ 8.0 ตามลำดับ) mAbs IgG1 หรือ IgG4 [28] เมื่อมีการตั้งค่าโหลดบัฟเฟอร์ที่ pH 8.0 มาบ IgG2 humanised จะเติมประจุลบมากกว่ามาบ IgG1 หรือ IgG4 humanisedความแตกต่างนี้อาจมีอิทธิพลต่อนิสัยชอบการเชื่อมโยงด้วยตนเองและแบบฟอร์ม dimers/ผล [29] และนี้อาจหมายความจริงว่า mAbs IgG1 หรือ IgG4 humanised eluted เป็นยอดกว้าง ยังเมื่อวิเคราะห์ SDS-หน้าใต้ไม่ลดเงื่อนไข เหล่านี้ส่วน eluted ทำงานเป็น IgGs เหมือนเดิม เช่นเป็นโปรตีน kDa 160ร่วมกับผู้เยาว์ ลดน้ำหนักโมเลกุลชนิดที่สร้างขึ้นจากการเหนี่ยวนำความร้อนกระจายตัวของ IgGs เหล่านี้ รุ่นที่ของมาบเช่นน้ำหนักโมเลกุลต่ำกว่า ชิ้นส่วนได้ตามที่ระบุไว้ก่อนหน้านี้ [24] และยืนยัน โดย MALDI TOF MS วิเคราะห์ [19,20]

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

3.2 คอลัมน์ฟอกสารของมนุษย์โมโนโคลนอล
IgGs ใช้ตัวดูดซับที่ได้มาจากการตรึง 40 TerPSEA
จากผลการวิจัยดังกล่าวข้างต้นที่มีศักยภาพของการตรึง
แกนด์ไพริดีนตาม (รูปที่ 1). ในการทำให้บริสุทธิ์ของโคลนที่ถูกตรวจสอบ
โดยใช้ 40 TerPSEA เป็น แบบอย่างที่ต้องการในเตียงบรรจุ
การทดลองสาร ภายใต้เกินปริมาณที่ได้รับการแต่งตั้ง
และล้างเงื่อนไขที่ใช้ในการทดลองเหล่านี้ห้องปฏิบัติการขนาดเล็ก
โดยเฉลี่ยการสูญเสียในการพัฒนาและล้างขั้นตอน
สัดส่วนระหว่าง 15% และ 20% ของเนื้อหา mAb โหลด.
เห็นได้ชัดว่ามีการออกแบบของการทดสอบ (DoE ) การทดลองที่ดีที่สุด
เงื่อนไขสูญเสียเหล่านี้ที่โหลดและล้างขั้นตอนอาจจะเป็นกับแต่ละตัวดูดซับที่แตกต่างกันสำหรับสาม humanised IgG ตัวอย่าง mAb ในขณะที่ humanised IgG1 mAb แสดงให้เห็นว่าที่กว้างขึ้นยอดเขาชะลาด (รูป. 4A) ที่ humanised IgG2 mAb ชะเป็นทั้งจุดสูงสุดของความอุดมสมบูรณ์ต่ำในตำแหน่งที่ไล่ระดับสีที่คล้ายกันตามโดย eluting ต่อมายอดอุดมสมบูรณ์มากขึ้น (รูป. 5A) ระบบ SDS-PAGE วิเคราะห์ของเศษส่วนกู้คืน (รูป. 5B) ชี้ให้เห็นว่าhumanised IgG2 mAb ก็พบว่าส่วนใหญ่ใน eluting ภายหลังเศษส่วน ดังนั้นภายใต้เงื่อนไขเหล่านี้ humanised IgG2 mAb ผูกพันมากขึ้นอย่างมากกว่า humanised IgG1 mAb ไปตรึง40 TerPSEA แกนด์, การค้นพบที่สอดคล้องกับชุดการศึกษาการดูดซับ รายละเอียดของโครมาสำหรับ humanised IgG4 mAb ก็คล้ายคลึงกับผลที่ได้รับกับ humanised IgG1 mAb กับยอดที่สำคัญตามมาด้วยยอดความอุดมสมบูรณ์ต่ำของเวลาการเก็บรักษาอีกต่อไป (รูป. 6A) ส่วนใหญ่ของ IgG4 ถูกบรรจุอยู่ในจุดสูงสุดเป็นครั้งแรกที่เห็นได้ชัดจากการวิเคราะห์ระบบ SDS-PAGE (รูป. 6B). ผลผูกพันของโคลนไปเรียนใหม่นี้ของแกนด์ตรึงเป็นผลมาจากการมีปฏิสัมพันธ์ของผลกระทบทางเคมีกายภาพหลายรวมถึงปฏิสัมพันธ์และไม่ชอบน้ำ ตามแบบฉบับของตัวดูดซับโหมดผสม นอกจากนี้ผลการเหล่านี้ขอแนะนำความเป็นไปได้ว่าแกนด์เหล่านี้อาจมีความสามารถในการผูกอิสระสอง (หรือมากกว่า) ไซต์ภายใน IgG โคลน, ความเป็นไปได้ที่อยู่ภายใต้การตรวจสอบข้อเท็จจริงในปัจจุบัน อย่างไรก็ตามการเปลี่ยนแปลงในองค์ประกอบบัฟเฟอร์หรือค่า pH ที่คาดว่าจะนำไปสู่การเปลี่ยนแปลงที่ลึกซึ้งในการคัดสรรสำหรับ IgG โคลนของ isotype ที่แตกต่างกันขึ้นอยู่กับลักษณะโครงสร้างและกายภาพของพวกเขา ยกตัวอย่างเช่นhumanised IgG2 mAb มีค่า pI ต่ำ (PI 7.4) กว่า humanised IgG1 หรือ IgG4 โคลน (ทั้งที่มี pI 8.0 ตามลำดับ) [28] เมื่อบัฟเฟอร์โหลดมีการตั้งค่าที่ pH 8.0 humanised IgG2 mAb จะถูกเรียกเก็บเงินเกินในเชิงลบกว่า IgG1 humanised หรือ IgG4 mAb. แตกต่างเหล่านี้อาจมีอิทธิพลต่อนิสัยชอบด้วยตนเองร่วม- และรูปแบบ dimers / มวลรวม [29] และอาจบัญชีสำหรับ ความจริงที่ว่า IgG1 humanised หรือ IgG4 โคลนชะเป็นยอดเขาที่กว้างขึ้น แต่การวิเคราะห์ระบบ SDS-PAGE ภายใต้เงื่อนไขที่ไม่ใช่การลดเหล่านี้เศษส่วนชะประพฤติเป็น IgGs เหมือนเดิมคือเป็น 160 โปรตีนกิโลดาลตันร่วมกับเล็ก ๆ น้อย ๆ ที่ต่ำกว่าสายพันธุ์ที่มีน้ำหนักโมเลกุลที่สร้างจาก การกระจายตัวของความร้อนที่เกิดขึ้นของ IgGs เหล่านี้ รุ่นดังกล่าวมีน้ำหนักโมเลกุลต่ำ mAb เศษได้รับตามที่ระบุไว้ก่อนหน้านี้ [24] และได้รับการยืนยันโดย MALDI-TOF MS วิเคราะห์ [19,20]