RNA extraction, reverse transcripti

RNA extraction, reverse transcription, and quantitative real-time PCR
(RT-qPCR)
Total RNA was extracted with a RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) according to the
manufacturer’s instructions, quantified with a spectrophotometer (NanoDrop ND-1000;
Thermo Scientific, Wilmington, DE), and stored at -80°C before use. The first strand cDNA
was synthesized by RT from 1.0 μg of total RNA using Ready-To-Go You-Prime First-Strand
Beads as previously described [19,25]. Quantitative real-time PCR was performed in a
Mx3005P QPCR System (Stratagene, La Jolla, CA) with 20 μl reaction volume containing 5 μl
of cDNA, 1 μl gene expression assay and 10 μl gene expression master mix (TaqMan; ABI).
TaqMan gene expression assays used for this study were: GAPDH (Hs99999905_m1),
HMOX1 (Hs01110250_m1) and COX2 (Hs00153133_m1). The thermocycler parameters were
50°C for 2 min and 95°C for 10 min, followed by 40 cycles of 95°C for 15 s and 60°C for 1 min.
A non-template control was included to evaluate DNA contamination. The results were analyzed
by the comparative threshold cycle (Ct) method and normalized by GAPDH as an internal
control [26].

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

แยกอาร์เอ็นเอ transcription ย้อนกลับ และ PCR เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์(RT-qPCR)มีสกัดอาร์เอ็นเอรวมกับ RNeasy พลัสมินิชุด (Qiagen, Valencia, CA) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต quantified ด้วยเครื่องทดสอบกรดด่าง (NanoDrop ND-1000วิทยาศาสตร์เทอร์โม วิลมิ DE), และเก็บไว้ที่-80 ° C ก่อนที่จะใช้ CDNA สาระแรกสังเคราะห์ โดย RT จาก μg 1.0 ของอาร์เอ็นเอทั้งหมดที่ใช้พร้อมไปคุณนายกแรกสแตรนด์ลูกปัดเป็นก่อนหน้านี้อธิบาย [19,25] ทำ PCR เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์ในการMx3005P ระบบการ QPCR (Stratagene, La Jolla, CA) ด้วยปริมาณปฏิกิริยา μl 20 ประกอบด้วย 5 μlของ cDNA วิเคราะห์นิพจน์ยีน 1 μl และ 10 μl ยีนนิพจน์หลักผสม (TaqMan ABI)ถูกใช้สำหรับการศึกษานี้ assays นิพจน์ของยีน TaqMan: GAPDH (Hs99999905_m1),HMOX1 (Hs01110250_m1) และ COX2 (Hs00153133_m1) มีพารามิเตอร์ thermocycler50 องศาเซลเซียส 2 นาที และ 95° C สำหรับ 10 นาที ตามรอบ 40 95 องศาเซลเซียส 15 s และ 60° C ใน 1 นาทีตัวควบคุมไม่มีแม่แบบรวมอยู่ในการประเมินการปนเปื้อน DNA มีวิเคราะห์ผลลัพธ์โดยขีดจำกัดเปรียบเทียบวงจรวิธี (Ct) และตามปกติเป็นการภายใน โดย GAPDHควบคุม [26]

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การสกัดอาร์เอ็นเอถอดความย้อนกลับและเชิงปริมาณ PCR แบบ real-time
(RT-qPCR)
รวม RNA ถูกสกัดด้วย RNeasy พลัสมินิ Kit (Qiagen, วาเลนเซีย, CA)
ตามคำแนะนำของผู้ผลิตปริมาณที่มีspectrophotometer (NanoDrop ND-1000;
เทอร์โมวิทยาศาสตร์ Wilmington, DE) และเก็บไว้ที่ -80 องศาเซลเซียสก่อนการใช้งาน cDNA
สาระแรกที่ถูกสังเคราะห์โดยRT จาก 1.0 ไมโครกรัมของอาร์เอ็นเอรวมใช้ Ready-To-Go คุณนายกแรก Strand
ลูกปัดตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [19,25] เชิงปริมาณแบบ real-time PCR ได้ดำเนินการใน
Mx3005P qPCR ระบบ (Stratagene, La Jolla, CA) 20 ไมโครลิตรปฏิกิริยาปริมาณที่มี 5
ไมโครลิตรของยีน, การวิเคราะห์การแสดงออกของยีน 1 ไมโครลิตรและ 10 ไมโครลิตรผสมต้นแบบการแสดงออกของยีน (TaqMan; ABI).
TaqMan การวิเคราะห์การแสดงออกของยีนที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้มี: GAPDH (Hs99999905_m1)
HMOX1 (Hs01110250_m1) และ COX2 (Hs00153133_m1) พารามิเตอร์ thermocycler เป็น
50 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 นาทีและ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาทีตามด้วย 40 รอบของ 95 ° C เป็นเวลา 15 วินาทีและ 60 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาที.
ควบคุมไม่ใช่แม่ถูกรวมอยู่ในการประเมินผลการปนเปื้อนดีเอ็นเอ ผลการวิเคราะห์โดยรอบเกณฑ์เปรียบเทียบ (กะรัต) วิธีการและโดยปกติ GAPDH เป็นภายในการควบคุม[26]

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การสกัดอาร์เอ็นเอ ย้อนกลับ ถอดความ และเชิงปริมาณแบบเรียลไทม์พีซีอาร์
( RT qpcr )
อาร์เอ็นเอทั้งหมดถูกสกัดด้วย rneasy พลัสมินิชุด ( เพิ่ม , Valencia , CA ) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต
quantified กับ Spectrophotometer ( nanodrop nd-1000 ;
เทอร์โมวิทยาศาสตร์ , Wilmington , DE ) และเก็บรักษาที่อุณหภูมิ - 80 องศา C ก่อนที่จะใช้ เกลียวดีเอ็นเอ
แรกถูกสังเคราะห์โดย RT จาก 10 μกรัมใช้อาร์เอ็นเอทั้งหมดพร้อมที่จะไป คุณท่านแรกเกลียวลูกปัดตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ 19,25
[ ] เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์ โดยแสดงในระบบ qpcr เป็น
mx3005p ( stratagene , La Jolla , CA ) 20 μ L ปฏิกิริยาปริมาณที่มี 5 μ L
cDNA 1 μ L ยีนและการแสดงออกของยีนใน 10 μ l Master Mix ( taqman ; ABI )
taqman ยีน ยีนที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้ได้แก่gapdh ( hs99999905_m1 )
hmox1 ( hs01110250_m1 ) และ cox2 ( hs00153133_m1 ) ส่วนค่าเทอร์มอไซเคล ์
50 ° C เป็นเวลา 2 นาที 95 องศา C นาน 10 นาที ตามด้วย 40 รอบ 95 องศา C เป็นเวลา 15 วินาทีและ 60 ° C เป็นเวลา 1 นาที
ไม่ใช่แม่แบบควบคุมรวมเพื่อประเมินการปนเปื้อน DNA วิเคราะห์ผลโดยรอบ
( CT ) และเกณฑ์เปรียบเทียบวิธีมาตรฐาน โดย gapdh เป็นการควบคุมภายใน
[ 26 ]