To study distribution of GnRHR mRNA

To study distribution of GnRHR mRNA in different feline tissues, RT-PCR analyses were performed. An aliquot of approximately 50 mg tissue was placed in a 2-mL conical screw cap tube containing high wear-resistant zirconia grinding 3-mm beads and homogenized using a Precellys 24 homogenizer . Each homogenization cycle was 20 seconds at 6000 rpm at room temperature. Total RNA was extracted using a RNeasy Mini Kit (Qiagen) and treated with RNA-free DNase (Qiagen). The RNA concentrationwas determined by a NanoDrop 2000 (Thermo Scientific). Using a OneStep RTPCR
Kit, RT-PCR was performed as described by the manufacturer (Qiagen). Primers (Table 2)were designed based on the feline GnRHR cDNA sequence obtained in this study. In all primer sets, the forward primer (F1) starts at position 1 of the feline GnRHR nucleotide sequence. The reverse primers (R478, R576, R672, R821, R918, R960, and R981) end at the different positions included in their names. Feline b-actin was used as a reference gene to confirm RNA integrity. Sequences for the gene primers are shown in Table 2. The RNA samples were tested in direct PCR using Taq PCR Master Mix Kit (Qiagen) to make sure that amplification did not come from carryover genomic DNA.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

เพื่อศึกษาการกระจายของ GnRHR mRNA ในกระดาษทิชชู่แมวแตกต่างกัน มีทำ RT-PCR วิเคราะห์ เป็นส่วนลงตัวของเนื้อเยื่อประมาณ 50 มิลลิกรัมถูกวางไว้ในหลอด 2 มล.ทรงกรวยสกรูฝาประกอบด้วย zirconia สวมทนสูงบดเม็ด 3 mm และ homogenized เป็นกลุ่มใช้ homogenizer Precellys 24 แต่ละวงจร homogenization วินาทีที่ 6000 รอบต่อนาทีที่อุณหภูมิห้องได้ อาร์เอ็นเอทั้งหมดถูกสกัดโดยใช้ชุดมินิ RNeasy (Qiagen) และรับฟรีอาร์เอ็นเอ DNase (Qiagen) Concentrationwas อาร์เอ็นเอที่ถูกกำหนด โดย 2000 NanoDrop (เทอร์โมวิทยาศาสตร์) ใช้ OneStep RTPCRชุด RT-PCR ที่ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ โดยผู้ผลิต (Qiagen) ไพรเมอร์ (ตาราง 2) ถูกออกแบบตามลำดับแมวของ cDNA GnRHR ได้รับในการศึกษานี้ ทั้งหมดชุดรองพื้น รองพื้นไปข้างหน้า (F1) เริ่มต้นที่ตำแหน่งที่ 1 ของลำดับนิวคลีโอไทด์ GnRHR แมว ไพรเมอร์กลับ (R478, R576, R672, R821, R918, R960 และ R981) สิ้นสุดที่ตำแหน่งต่าง ๆ ที่รวมอยู่ในชื่อ แมวบีแอกตินใช้เป็นยีนอ้างอิงเพื่อยืนยันความสมบูรณ์ของอาร์เอ็นเอ ลำดับสำหรับไพรเมอร์ของยีนจะแสดงในตารางที่ 2 ตัวอย่างอาร์เอ็นเอถูกทดสอบในการใช้ชุดการผสมหลัก PCR Taq (Qiagen) เพื่อให้แน่ใจว่า ขยายไม่ได้เกิดจาก carryover genomic DNA PCR โดยตรง

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เพื่อศึกษาการกระจายตัวของ mRNA GnRHR ในเนื้อเยื่อแมวที่แตกต่างกัน, การวิเคราะห์ RT-PCR ได้ดำเนินการ aliquot ประมาณ 50 มิลลิกรัมเนื้อเยื่อถูกวางไว้ใน 2 มิลลิลิตรหลอดฝาเกลียวกรวยที่มีเซอร์โคเนียทนต่อการสึกหรอสูงบดเม็ด 3 มมปั่นและใช้ Precellys 24 homogenizer วงจรทำให้เป็นเนื้อเดียวกันแต่ละ 20 วินาทีที่ 6000 รอบต่อนาทีที่อุณหภูมิห้อง รวม RNA ถูกสกัดโดยใช้ RNeasy Mini Kit (Qiagen) และรับการรักษาด้วย DNase อาร์เอ็นเอฟรี (Qiagen) concentrationwas RNA กำหนดโดย NanoDrop 2000 (เทอร์โมวิทยาศาสตร์) ใช้ OneStep RTPCR
ชุด RT-PCR ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้โดยผู้ผลิต (Qiagen) ไพรเมอร์ (ตารางที่ 2) ได้รับการออกแบบขึ้นอยู่กับแมวลำดับยีน GnRHR ที่ได้รับในการศึกษาครั้งนี้ ในชุดไพรเมอร์ทุกไพรเมอร์ไปข้างหน้า (F1) เริ่มต้นที่ตำแหน่งที่ 1 ของแมว GnRHR ลำดับเบส ไพรเมอร์กลับ (R478, R576, R672, R821, R918, R960 และ R981) สิ้นสุดที่ตำแหน่งต่าง ๆ ที่รวมอยู่ในชื่อของพวกเขา แมวขโปรตีนที่ใช้เป็นยีนอ้างอิงเพื่อยืนยันความสมบูรณ์ของอาร์เอ็นเอ ลำดับสำหรับไพรเมอร์ยีนที่แสดงในตารางที่ 2 กลุ่มตัวอย่างที่อาร์เอ็นเอได้รับการทดสอบใน PCR โดยตรงโดยใช้ Taq PCR โทผสม Kit (Qiagen) เพื่อให้แน่ใจว่าการขยายไม่ได้มาจากการยกยอดดีเอ็นเอ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เพื่อศึกษาการกระจายของ gnrhr mRNA ในเนื้อเยื่อ แมวที่แตกต่างกัน , การวิเคราะห์เทคนิคการวิจัย เป็นส่วนลงตัวของประมาณ 50 mg เนื้อเยื่ออยู่ใน 2-ml กรวยสกรูฝาท่อที่มีสูง ทนต่อการสึกหรอ เซอร์โคเนียคัฟ 3-mm เม็ดและบดด้วยเครื่องปั่น precellys 24 . แต่ละรอบการเป็น 20 วินาทีที่ 6 , 000 รอบต่อนาที ที่ อุณหภูมิ ห้องอาร์เอ็นเอทั้งหมดถูกสกัดโดยใช้ชุดมินิ rneasy ( เพิ่ม ) และรักษาด้วย DNA ตรวจหา ADNase ฟรี ( เพิ่ม ) ยีน concentrationwas กำหนดด้วย nanodrop 2000 ( เทอร์โมวิทยาศาสตร์ ) การใช้ผลงาน rtpcr
ชุดนี้ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้โดยผู้ผลิต ( เพิ่ม ) ไพรเมอร์ ( ตารางที่ 2 ) ได้รับการออกแบบขึ้นอยู่กับแมว gnrhr ลำดับยีนที่ได้ในการศึกษานี้ ในชุดไพรเมอร์ทั้งหมดรองพื้นไปข้างหน้า ( F1 ) เริ่มที่ตำแหน่งที่ 1 ของแมว gnrhr ลำดับนิวคลีโอไทด์ . ย้อนกลับ ( r478 r576 r672 , ไพรเมอร์ , r821 r918 r960 , , , , และ r981 ) จบที่ตำแหน่งต่าง ๆ รวมอยู่ในชื่อของพวกเขา แมว b-actin ถูกใช้เป็นข้อมูลอ้างอิงเพื่อยืนยันความสมบูรณ์ของยีนยีน . ลำดับสำหรับยีน PCR จะแสดงในตารางที่ 2ยีนตัวอย่างทดสอบ PCR โดยตรงโดยใช้แท็ก PCR Master Mix Kit ( เพิ่ม ) เพื่อให้แน่ใจว่าเด็กไม่ได้มาจากคงไป genomic DNA