Tyrosinase Inhibitor Screening Prot

Tyrosinase Inhibitor Screening Protocol: 1. Screening compounds, Inhibitor control and Blank Control Preparations: Dissolve test inhibitors into proper solvent. Dilute to 5X the desired test concentration with Tyrosinase Assay Buffer before use. Add 20 μl diluted test inhibitors, Inhibitor Control working solution, or Tyrosinase Assay Buffer into wells assigned as test inhibitors (Sample, S), Inhibitor Control (IC), or Tyrosinase Enzyme Control (EC) wells, respectively. Additional wells with serial dilutions of the test inhibitors may be prepared at this time if desired, containing 20 µl in each candidate well. Note: Preferred final solvent concentration should not be more than 5% by volume. If solvent exceeds 5% include a Solvent Control to test the effect of the solvent on enzyme activity. 2. Tyrosinase Enzyme Solution Preparation: For each well, prepare 50 μl Tyrosinase Enzyme Solution. 48 μl Tyrosinase Assay Buffer 2 μl Tyrosinase Mix well & add 50 μl/well into wells containing test inhibitors, Inhibitor Control & Enzyme Control. Mix. Incubate for 10 min. at 25ºC. 3. Tyrosinase Substrate solution preparation: For each well, prepare 30 µl of Tyrosinase Substrate solution 23 μl Tyrosinase Assay Buffer 2 μl Tyrosinase Substrate 5 µl Tyrosinase Enhancer Mix and add 30 μl of Tyrosinase Substrate Solution into each well. Mix well. 4. Measurement: Measure the absorbance in kinetic mode for 30-60 min. at 510 nm. Choose two time points (T1 & T2) in the linear range of the plot and obtain the corresponding values for the Absorbance (Abs1 and Abs2). 5. Calculations: Calculate the slope for all samples, including Enzyme Activity Control (EC), by dividing the net ΔAbs (Abs2- Abs1) values by the time ΔT (T2-T1). Calculate % Relative Inhibition as follows:

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

Tyrosinase ผลคัดกรองโพรโทคอล: 1 การคัดกรองสาร ควบคุมผล และ เตรียมตัวควบคุมว่าง: inhibitors ทดสอบจางหายเข้าไปในตัวทำละลายที่เหมาะสม Dilute กับ 5 X ความเข้มข้นต้องทดสอบกับ Tyrosinase วิเคราะห์บัฟเฟอร์ก่อนที่จะใช้ เพิ่ม 20 μl ผสมทดสอบ inhibitors โซลูชันควบคุมสารยับยั้งการทำงาน หรือ บัฟเฟอร์ Assay Tyrosinase ในบ่อกำหนดเป็นทดสอบ inhibitors (ตัวอย่าง S), ตัวควบคุมสารยับยั้ง (IC), หรือ บ่อควบคุมเอนไซม์ Tyrosinase (EC) ตามลำดับ อาจเตรียมบ่อเพิ่มเติมกับ dilutions ประจำของ inhibitors ทดสอบในเวลานี้ถ้าต้อง ประกอบด้วย 20 µl ในผู้สมัครแต่ละกัน หมายเหตุ: ความเข้มข้นเป็นตัวทำละลายสุดท้ายที่ไม่ควรมากกว่า 5% โดยปริมาตร ถ้าตัวทำละลายมากกว่า 5% รวมถึงควบคุมตัวทำละลายเพื่อทดสอบผลของตัวทำละลายเอนไซม์ 2. tyrosinase เอนไซม์โซลูชันเตรียม: ดีละ เตรียม 50 μl โซลูชั่นเอนไซม์ Tyrosinase Μl μl Tyrosinase วิเคราะห์บัฟเฟอร์ 2 48 Tyrosinase ผสมดี และเพิ่ม μl 50 บ่อเป็นบ่อที่ประกอบด้วยทดสอบ inhibitors เอนไซม์ควบคุมและการควบคุมผล ผสมการฟักใน 10 นาทีที่ 25ºC 3. เตรียมแก้ปัญหาพื้นผิว tyrosinase: ดีละ เตรียม 30 µl ของ Tyrosinase พื้นผิวโซลูชัน 23 μl Tyrosinase วิเคราะห์บัฟเฟอร์ 2 μl Tyrosinase พื้นผิว 5 µl ผสม Enhancer Tyrosinase และเพิ่ม μl 30 ของพื้นผิว Tyrosinase ในแต่ละบ่อ น้ำพริกลาบ 4. วัด: วัด absorbance ในโหมดเดิม ๆ สำหรับ 30-60 นาทีที่ 510 nm เลือกสองจุดเวลา (T1 และ T2) ในช่วงเชิงเส้นของพล็อต และรับค่าเกี่ยวข้องสำหรับ Absorbance (Abs1 และ Abs2) 5. คำนวณ: คำนวณความชันสำหรับตัวอย่างทั้งหมด รวมถึงเอนไซม์กิจกรรมควบคุม (EC), โดยหารค่าสุทธิ ΔAbs (Abs2 - Abs1) ด้วย ΔT เวลา (T2-T1) คำนวณ%ยับยั้งสัมพัทธ์ดังนี้:

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

tyrosinase ยับยั้งการคัดกรองพิธีสาร 1. การคัดกรองสารควบคุมและยับยั้งการเตรียมการควบคุมเปล่า: ละลายสารยับยั้งการทดสอบออกเป็นตัวทำละลายที่เหมาะสม เจือจางความเข้มข้น 5 เท่าการทดสอบที่ต้องการด้วย Tyrosinase Assay บัฟเฟอร์ก่อนการใช้งาน เพิ่ม 20 ไมโครลิตรเจือจางสารยับยั้งการทดสอบ, การควบคุมยับยั้งการแก้ปัญหาการทำงานหรือ Tyrosinase Assay บัฟเฟอร์ลงไปในหลุมที่ได้รับมอบหมายเป็นสารยับยั้งการทดสอบ (ตัวอย่าง S), การควบคุมยับยั้ง (IC) หรือเอนไซม์ Tyrosinase ควบคุม (EC) หลุมตามลำดับ หลุมเพิ่มเติมกับเจือจางอนุกรมของสารยับยั้งการทดสอบอาจจะต้องเตรียมในเวลาถ้าต้องการนี​​้มี 20 ไมโครลิตรในผู้สมัครแต่ละคนได้ดี หมายเหตุ: ความเข้มข้นของตัวทำละลายที่ต้องการสุดท้ายไม่ควรเกิน 5% โดยปริมาตร ถ้าตัวทำละลายเกินกว่า 5% รวมถึงการควบคุมตัวทำละลายในการทดสอบผลของตัวทำละลายในการทำงานของเอนไซม์ 2. เอนไซม์ Tyrosinase โซลูชั่นการเตรียมสำหรับแต่ละดีเตรียมความพร้อม 50 ไมโครลิตรเอนไซม์ Tyrosinase โซลูชั่น 48 ไมโครลิตร Tyrosinase Assay บัฟเฟอร์ 2 ไมโครลิตร Tyrosinase ผสมกันและเพิ่ม 50 ไมโครลิตร / ดีในหลุมที่มีสารยับยั้งการทดสอบ, การควบคุมยับยั้งเอนไซม์และการควบคุม การผสม ฟักไข่เป็นเวลา 10 นาที ที่ 25 องศาเซลเซียส 3. การเตรียม Tyrosinase วิธีการแก้ปัญหาของพื้นผิว: สำหรับแต่ละดีเตรียมความพร้อม 30 ไมโครลิตรของ Tyrosinase วิธีการแก้ปัญหาของพื้นผิว 23 ไมโครลิตร Tyrosinase Assay บัฟเฟอร์ 2 ไมโครลิตร Tyrosinase พื้นผิว 5 ไมโครลิตร Tyrosinase Enhancer ผสมและเพิ่ม 30 ไมโครลิตรของ Tyrosinase โซลูชั่นในแต่ละพื้นผิวได้ดี ผสมให้เข้ากัน 4. การวัด: การวัดการดูดกลืนแสงในโหมดการเคลื่อนไหวสำหรับ 30-60 นาที ที่ 510 นาโนเมตร เลือกสองจุดเวลา (T1 และ T2) ในช่วงเชิงเส้นของพล็อตและได้รับค่าที่สอดคล้องกันสำหรับการดูดกลืนแสง (Abs1 และ Abs2) 5. การคำนวณ: คำนวณลาดชันสำหรับตัวอย่างทั้งหมดรวมทั้งการควบคุมกิจกรรมของเอนไซม์ (EC) โดยการหารΔAbsสุทธิ (Abs2- Abs1) ค่าตามเวลาΔTนี้ (T2-T1) คำนวณ% ยับยั้งญาติดังนี้

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ยับยั้งการคัดเลือกโปรไทโรซิเนส : 1 การคัดกรองสาร ควบคุม ยับยั้ง และการเตรียมการควบคุมว่าง : ละลายการทดสอบเป็นตัวทำละลายที่เหมาะสม เจือจางกับ 5x ที่ต้องการทดสอบสมาธิกับ ไทโรซิเนส ( บัฟเฟอร์ก่อนใช้ เพิ่ม 20 μฉันเจือจางทดสอบ inhibitors ซึ่งควบคุมการทำงาน โซลูชั่น หรือ ไทโรซิเนส ( buffer ลงในหลุมมอบหมาย เช่น การทดสอบตัวอย่าง ( s )ควบคุมยับยั้ง ( IC ) หรือควบคุมเอนไซม์ ไทโรซิเนส ( EC ) บ่อ ตามลำดับ เวลส์เพิ่มเติมด้วยวิธีการทดสอบอนุกรมของโปรตีนอาจจะจัดในเวลานี้ถ้าต้องการ ประกอบด้วย 20 µ L ในผู้สมัครแต่ละคนด้วย หมายเหตุ : ที่ต้องการสุดท้ายตัวทำละลายความเข้มข้นไม่ควรเกิน 5 % โดยปริมาตรถ้าละลายเกิน 5% รวมถึงการควบคุมสารเคมี เพื่อทดสอบผลของตัวทำละลายต่อกิจกรรมของเอนไซม์ 2 . การเตรียมสารละลายเอนไซม์ไทโรซิเนสสำหรับแต่ละอย่างดี เตรียม 50 μ l สารละลายเอนไซม์ไทโรซิเนส . 48 μแอล ไทโรซิเนส ( บัฟเฟอร์ 2 μ L ไทโรซีนผสมกัน&เพิ่ม 50 μ L / ในบ่อที่มีสารยับยั้งเอนไซม์&ทดสอบการควบคุมการควบคุมยับยั้ง . ผสม พัก 10 นาทีที่ 25 º C 3 .ไท โรซิเนสพื้นผิวการเตรียมสารละลายสำหรับแต่ละดี เตรียม 30 µลิตร ไทโรซิเนส ( โซลูชั่น 23 μผม ไทโรซิเนส ( บัฟเฟอร์ 2 μแอล ไทโรซิเนส ( 5 µ L ไทโรซิเนส Enhancer ผสมและเพิ่ม 30 μ L ของสารละลายตั้งต้นไทโรซิเนสกันด้วย ผสมให้เข้ากัน 4 . วัด : วัดการดูดกลืนแสงในโหมดจลน์สำหรับ 30-60 นาที ที่ 510 nm .เลือกสองจุดเวลา ( & T1 T2 ) ในช่วงเชิงเส้นของพล็อตและได้รับค่านิยมที่สอดคล้องกันสำหรับการดูดกลืนแสง ( abs1 และ abs2 ) 5 . คำนวณคำนวณความชันอย่างทั้งหมด รวมทั้งการควบคุมเอนไซม์ ( EC ) โดยแบ่ง ABS Δสุทธิ ( abs2 - abs1 ) ค่าโดยเวลาΔ T ( t2-t1 ) คำนวณ % เทียบยับยั้งดังนี้