Expression analysis by semi-quantit

Expression analysis by semi-quantitative RT-PCR
Total RNA was extracted from young leaves
of 2-week-old rice seedlings using the TRIzol
method (Life Technologies, USA). The extracted
RNA was treated with DNase I (New England
Biolabs, UK) at 37 oC for 10 min to remove
contaminated DNA. The DNase I – treated RNA
samples were reverse transcribed by Superscript III
first-strand synthesis system (Life Technologies,
USA) according to the manufacturer’s instructions.
For the template, 1 g of total RNA was used in a
10 l Reverse Transcription (RT) reaction. The RT
profile was as follows: denaturation and annealing of oligo
(dT) at 65 oC for 5 min, reverse transcription at 50 oC for
50 min, and reaction termination at 85 oC for 5 min.
Gene-specific primers were designed from
coding regions of different rice anthocyanin structural
genes. A list of primers was shown in Table 1.
Amplification of target cDNA was performed with
GoTaq® Green Master Mix. The PCR profile was 95
oC for 3 min, 27 cycles at 95 oC for 1 min, 52-56 oC
for 1 min and 72 oC for 1 min, and 5 min at 72 oC
for the final extension. Aliquots of PCR products
were analyzed on a 1 % (w/v) agarose gel by
electrophoresis. For semi-quantitative RT-PCR
assays, the total amount of cDNA in samples was
standardized after the amount of actin mRNA was
evaluated with an OsActin primer pair (Table 1).

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การวิเคราะห์การแสดงออกโดยกึ่งเชิงปริมาณ RT-PCR
รวม RNA
ถูกสกัดจากใบอ่อนของต้นกล้าข้าว2 สัปดาห์อายุการใช้ Trizol
วิธี (ไลฟ์เทคโนโลยีส์, สหรัฐอเมริกา) ที่สกัด
RNA รับการรักษาด้วย DNase ฉัน (นิวอิงแลนด์
Biolabs สหราชอาณาจักร) ที่ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10
นาทีเพื่อขจัดดีเอ็นเอที่ปนเปื้อน ฉัน DNase -
อาร์เอ็นเอได้รับการรักษาตัวอย่างที่ถูกคัดลอกกลับโดยยกที่สามระบบเส้นใยสังเคราะห์แรก
(ชีวิต Technologies,
USA.) ตามคำแนะนำของผู้ผลิตสำหรับแม่แบบ 1 gของอาร์เอ็นเอรวมถูกนำมาใช้ใน 10 lกลับถอดความ ( RT) ปฏิกิริยา อารายละเอียดดังนี้ denaturation และหลอมของ Oligo (dT) ที่ 65 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาทีถอดความย้อนกลับที่ 50 องศาเซลเซียส50 นาทีและการเลิกจ้างปฏิกิริยาที่ 85 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที. ไพรเมอร์ยีนที่เฉพาะเจาะจงได้รับการออกแบบจากภูมิภาคเข้ารหัสข้าวที่แตกต่างกันของโครงสร้าง anthocyanin ยีน รายชื่อของไพรเมอร์ที่ถูกแสดงในตารางที่ 1 การขยายของยีนเป้าหมายได้ดำเนินการกับGoTaq®สีเขียวผสมปริญญาโท รายละเอียด PCR เป็น 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 3 นาที 27 รอบที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาที, 52-56 องศาเซลเซียสเป็นเวลา1 นาทีและ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาทีและ 5 นาทีที่ 72 องศาเซลเซียสสำหรับส่วนขยายสุดท้าย aliquots ของผลิตภัณฑ์ PCR วิเคราะห์บน 1% (w / v) เจล agarose โดยอิ สำหรับกึ่งเชิงปริมาณ RT-PCR ตรวจจำนวนเงินรวมของยีนในตัวอย่างได้มาตรฐานหลังจากที่ปริมาณของโปรตีน mRNA ได้รับการประเมินด้วยคู่ไพรเมอร์OsActin (ตารางที่ 1)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การศึกษาการแสดงออกของยีนโดยวิธีกึ่งปริมาณ
ทั้งหมดสกัดจากใบอ่อนของต้นกล้าข้าว
2-week-old โดยใช้วิธี trizol
( เทคโนโลยี , USA ) สกัด RNA ได้รับการตรวจหา ADNase
( อังกฤษ
biolabs , UK ) ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 10 นาที เพื่อลบ
ดีเอ็นเอปนเปื้อน การตรวจหา ADNase ฉัน–การปฏิบัติตัวอย่าง RNA
ถูกย้อนกลับและลวดหนาม 3
โดยระบบการสังเคราะห์กลุ่มแรก ( ชีวิตเทคโนโลยี
USA ) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต
สำหรับแม่แบบ 1 กรัม ซึ่งทั้งหมดถูกใช้ใน
10 ผมถอดความย้อนกลับ ( RT ) ปฏิกิริยา RT
รายละเอียดดังนี้ ( annealing ของโอลิโก
( DT ) ที่อุณหภูมิ 65 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาทีกลับถอดความที่ 50 oc สำหรับ
50 นาที และการเกิดปฏิกิริยาที่อุณหภูมิ 85 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที
โดยเฉพาะยีนที่ถูกออกแบบจาก
รหัสภูมิภาคของยีนโครงสร้าง
ข้าวแอนโธไซยานินที่แตกต่างกัน รายการของไพรเมอร์ถูกแสดงในตารางที่ 1 .
เพิ่มปริมาณ cDNA เป้าหมายได้ด้วย
gotaq ®สีเขียวต้นแบบผสม pcr โปรไฟล์ 95
องศาเซลเซียสนาน 3 นาที , 27 รอบ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาที 52-56 OC
1 นาที 72 องศาเซลเซียสนาน 1 นาที และ 5 นาทีที่ 72 องศาเซลเซียส
สำหรับส่วนขยายสุดท้าย เฉยๆของ PCR ผลิตภัณฑ์
วิเคราะห์บน 1% ( w / v ) เจลอิเลคโตรโฟรีซีสโดย
. สำหรับกึ่งปริมาณ 4
) , ปริมาณเชื้อในตัวอย่างคือ
มาตรฐานหลังจากปริมาณ actin mRNA ของ
ประเมินด้วย osactin ไพรเมอร์คู่ ( ตารางที่ 1 )