Multiplex RT-PCR assayThe multiplex

Multiplex RT-PCR assay
The multiplex RT-PCR assay was carried out using the Real Fungus-ID multiplex RT-PCR assay kit (Optipharm) using the CFX-96 real-time PCR system (Bio-Rad, Hercules,CA), which was used for thermocycling and fluorescence detection. The multiplex RT-PCR amplification was performed in a total volume of 20 ll that contained 10 ll 29 Thunderbird probe qPCR mix (Toyobo, Osaka,Japan), 5 ll primer and TaqMan probe mixture, and 5 ll template DNA. The multiplex RT-PCR assay simultaneously detected ITS genes from Trichophyton spp. (Tricho-P), T. rubrum (Trub-P), T. mentagrophytes (Tmen-P),
and Microsporum spp. (Micro-P) from a single DNA sample by incorporating three target-specific TaqMan probes, which were labelled with different fluorophores (CAL Fluor Red 610, FAM, HEX and Cy5 respectively). Each multiplex RT-PCR assay included internal control (IC) DNA and was used as indicator of pure nucleic acid extraction, sample quality and to monitor the effect of PCR inhibitors in the reaction. Positive and negative controls were included throughout the procedure. No-template controls with sterile DW instead of template DNA were incorporated in each run under the following conditions:95°C for 3 min and 40 cycles of 95°C for 20 s and 60°C for 40 s. The bacterial load was quantified by determining the cycle threshold (CT), the number of PCR cycles required for the fluorescence to exceed a value significantly higher than the background fluorescence. A positive result was indicated when the CT value was less
than 35 after observing signal formation of wavelength from each channel.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

มัลติเพล็กซ์ RT-PCR assayการ RT-PCR assay มัลติเพล็กซ์ที่ถูกดำเนินการโดยใช้ ID จริงเชื้อรา multiplex RT-PCR assay kit การ (Optipharm) ใช้ CFX-96 แบบเรียลไทม์ PCR ระบบ (Bio-ล้อ เฮอร์คิวลิส CA), ซึ่งถูกใช้สำหรับการตรวจหาเทอร์โม゚และเรืองแสง ทำการ multiplex RT-กระบือในเสียงรวมของ 20 ll ที่อยู่ 10 ll 29 ธันเดอร์เบิร์ดสอบสวน qPCR ผสม (อลส์ โอซาก้า ญี่ปุ่น), 5 ll สีรองพื้น และผสมโพรบ TaqMan และ 5 ll แม่แบบดีเอ็นเอ การ RT-PCR assay มัลติเพล็กซ์พร้อมกันตรวจพบยีนของออกซิเจน Trichophyton (Tricho-P), T. rubrum (Trub-P), T. mentagrophytes (Tmen-P),และออกซิเจน Microsporum (Micro-P) จากดีเอ็นเอเดียว โดยผสมผสานสามเป้าหมายเฉพาะ TaqMan หัว ซึ่งถูกติดฉลากพร้อม fluorophores แตกต่างกัน (CAL ฟลูออแดง 610 กรุ๊ป HEX และ Cy5 ตามลำดับ) แต่ละ RT-PCR assay มัลติเพล็กซ์รวมการควบคุมภายใน (IC) ดีเอ็นเอ และถูกใช้เป็นตัวบ่งชี้ ของกรดนิวคลีอิกบริสุทธิ์ สกัด คุณภาพตัวอย่าง และ การตรวจสอบผลกระทบของสารยับยั้ง PCR ในปฏิกิริยา ควบคุมบวก และลบถูกรวมตลอดทั้งกระบวนการ ไม่มีแม่แบบควบคุม ด้วย DW เป็นหมันแทนแม่ดีเอ็นเอถูกรวมในแต่ละรันต่อไปนี้เงื่อนไข: 95 ° C สำหรับ 3 นาทีและ 40 รอบของ 95 ° C เป็นเวลา 20 s และ 60 ° C สำหรับ 40 s โหลดแบคทีเรียถูกวัด โดยกำหนดเขตแดนรอบ (CT) จำนวนของ PCR รอบต้องเกินค่าที่สูงกว่าพื้นหลังเรืองแสงเรืองแสง ระบุผลลัพธ์ที่เป็นบวกเมื่อค่า CT น้อยกว่า 35 หลังสังเกตสัญญาณก่อตัวของความยาวคลื่นจากแต่ละช่อง

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

multiplex RT-PCR assay
multiplex RT-PCR ทดสอบถูกนำออกมาใช้จริงเชื้อรา-ID multiplex RT-PCR ชุดทดสอบ (Optipharm) โดยใช้ CFX-96 ระบบเวลาจริง PCR (Bio-Rad, Hercules, CA) ซึ่ง ใช้สำหรับ thermocycling และการตรวจสอบการเรืองแสง multiplex RT-PCR ขยายได้ดำเนินการในปริมาณรวม 20 LL ที่มี 10 LL 29 Thunderbird สอบสวน qPCR ผสม (Toyobo โอซาก้าประเทศญี่ปุ่น) 5 LL ไพรเมอร์และ TaqMan สอบสวนส่วนผสมและ 5 LL แม่แบบดีเอ็นเอ multiplex RT-PCR ทดสอบพร้อมกันตรวจพบยีนจาก Trichophyton เอสพีพี (Tricho-P) T. rubrum (Trub-P) T. mentagrophytes (Tmen-P)
และ Microsporum เอสพีพี (Micro-P) จากตัวอย่างดีเอ็นเอเดียวโดยผสมผสานเป้าหมายเฉพาะสาม probes TaqMan ซึ่งถูกกำกับด้วย fluorophores แตกต่างกัน (CAL Fluor แดง 610 FAM, HEX และ Cy5 ตามลำดับ) แต่ละ multiplex RT-PCR ทดสอบรวมถึงการควบคุมภายใน (IC) DNA และถูกนำมาใช้เป็นตัวบ่งชี้ของการสกัดกรดนิวคลีอิกบริสุทธิ์คุณภาพตัวอย่างและการตรวจสอบผลกระทบของสารยับยั้ง PCR ในการเกิดปฏิกิริยา ควบคุมบวกและลบได้รวมตลอดขั้นตอน การควบคุมไม่มีแม่แบบที่มีการฆ่าเชื้อแทนใบสำคัญแสดงสิทธิอนุพันธ์ของแม่แบบดีเอ็นเอถูกจัดตั้งขึ้นในแต่ละทำงานภายใต้เงื่อนไขต่อไปนี้: 95 ° C เป็นเวลา 3 นาทีและ 40 รอบจาก 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 20 และ 60 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 40 วินาที โหลดแบคทีเรียถูกวัดโดยการกำหนดเกณฑ์วงจร (CT) จำนวนรอบ PCR ที่จำเป็นสำหรับการเรืองแสงที่จะเกินค่าที่สูงขึ้นกว่าการเรืองแสงพื้นหลังอย่างมีนัยสำคัญ ผลบวกถูกระบุเมื่อค่า CT น้อย
กว่า 35 หลังจากการเฝ้าสังเกตการก่อตัวของสัญญาณของความยาวคลื่นจากแต่ละช่อง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วิธี multiplex RT-PCR( วิธี multiplex ได้ดําเนินการใช้เชื้อรา multiplex RT-PCR ใช้ ID จริงชุด ( optipharm ) ใช้ cfx-96 เรียลไทม์ระบบไบโอดีเอ็นเอเรเดียน , Hercules , CA ) ซึ่งใช้สำหรับผื่นแดงและตรวจจับการเรืองแสงด้วย การเพิ่มปริมาณ multiplex RT-PCR แสดงในเล่มรวม 20 จะเห็นว่ามี 10 จะ 29 Thunderbird ตรวจสอบ qpcr ผสม ( toyobo , โอซาก้า , ญี่ปุ่น ) , primer 5 และจะ taqman ตรวจสอบส่วนผสมและ 5 ดีเอ็นเอแม่แบบ ll ( วิธี multiplex พร้อมกันตรวจพบยีนจาก Trichophyton spp . ( tricho-p ) ต. rubrum ( trub-p ) ต. mentagrophytes ( tmen-p )และ spp . ( micro-p ) จากตัวอย่างดีเอ็นเอเดียวโดยผสมผสานสามเป้าหมายที่เฉพาะเจาะจง taqman ) ซึ่งถูก labelled กับ fluorophores แตกต่างกัน ( แคล Fluor แดงแล้ว ดู hex และ cy5 ตามลำดับ ) แต่ละวิธี multiplex RT-PCR ) การควบคุมภายใน ( IC ) ดีเอ็นเอและถูกใช้เป็นตัวบ่งชี้ของบริสุทธิ์การสกัดกรดนิวคลีอิกตัวอย่างที่มีคุณภาพและตรวจสอบผลของ PCR และการเกิดปฏิกิริยา การควบคุมทางบวกและทางลบ รวมตลอดทั้งกระบวนการ ไม่มีแม่แบบการควบคุมด้วย DW ฆ่าเชื้อแทนดีเอ็นเอแม่แบบเป็นนิติบุคคลที่จัดตั้งขึ้นในแต่ละรันภายใต้เงื่อนไขต่อไปนี้ : 95 องศา C เป็นเวลา 3 นาทีและ 40 รอบ 95 องศา C เป็นเวลา 20 และ 60 องศา C นาน 40 วินาที แบคทีเรียโหลด โดยการกำหนดเกณฑ์วัดรอบ ( CT ) , จำนวนของเทคนิคที่จำเป็นสำหรับวงจร เรืองแสงเกินมูลค่าสูงกว่าเรืองแสงพื้นหลัง บวกถูกพบเมื่อค่า CT ที่น้อยกว่า 35 หลังจากการสร้างสัญญาณแสงจากการสังเกตของแต่ละช่อง