Analysis of transgenic plants PCR,

Analysis of transgenic plants PCR, Southern blot and Elisa analyses:
Plant genomic DNA of transgenic and nontransgenic papaya plants was extracted as follows: 1) 750 µl of extraction buffer
[one volume of DNA extraction buffer (0.35 M Sorbitol, 0.1 M Tris, 5 mM EDTA, 25 mM Sodium bisulfite, pH 8.26), 1 volume nuclei lysis buffer (0.2 M Tris, 50 mM EDTA, 2 M NaCl, 2% CTAB), and 0.4 volume of 5% Sarkosyl] was
added to a 2 ml micro tube containing 100-200 mg of leaf tissue ground in liquid N, and then incubated at 65 °C for
30-60 min; 2) 750 µl of chloroform:isoamyl alcohol (24:1) was added to the mix and centrifuged at 10,000 rpm for 10
min; 3) the upper layer was removed and mixed with one volume of cold isopropanol, and then centrifuged at 10,000
rpm for 10 min; 4) the pellet was rinsed with cold 75% ethanol, dried for 5 min in speed vacuum, ressuspended in
50 µl of TE buffer (pH 7.5) (Sambrook et al., 1991), and then treated with 10 µl of RNase A (1 mg/ml) at 37 °C for
30 min. Quantified DNA was stored at -20 °C until assaying the presence of the cp transgene by PCR.

22 A 2 µl aliquot with 100 ng/ µl solution of genomic DNA was used as template for PCR under the following conditions: 100 ng of each dNTP , 1X PCR buffer, 100 ng of each 5’-end and 3’-end primers, 1.5 mM MgCl2, and 2.5 units ofT aq DNA polymerase per tube, in a 50 µl volume. A cycle of 94 °C/ 3 min, 40 °C/ 1 min, and 72 °C/ 3 min, was followed by 30 cycles of 92 °C/ 1 min, 53 °C/ 1 min, and 72°C/ 2.5 min, and by a cycle of 72 °C/ 7 min. The same conditions were used to amplify allcp gene constructs, and the PCR products were separated as described above.

33 Ten micrograms of Hind III-digested DNA were separated by electrophoresis in 1% agarose gel buffered in 1X TBE, stained with ethidium bromide, and transferred to a GeneScreenPlus nylon membrane (BioTechnology Systems, NEN Research Products, Boston, MA) using capillary transfer as described in the manufacturer’s protocol. The membrane was hybridized with a probe consisting of thecp gene excised from the TL version of the gene described earlier in this work, and labeled with 32 P by using a random primer based system (Feinberg & V ogelstein, 1983).

44 Papaya leaves were homogenized in extraction buffer (0.25 M potassium phosphate, 0.1 M EDTA, pH 7.5)
(Gonsalves & Ishii, 1980) and then centrifuged at 5,000 rpm at 4°C for 3 min. Total protein was quantified in the sample
by the Bio-Rad ProteinAssay (Bio-Rad Laboratories, NY).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วิเคราะห์จำลองพืช PCR ใต้น้า และ Elisa วิเคราะห์:ดีเอ็นเอออกโรงของจำลอง และ nontransgenic มะละกอพืชถูกแยกเป็นดังนี้: 1) 750 µl ของบัฟเฟอร์สกัด[ระดับหนึ่งบัฟเฟอร์สกัดดีเอ็นเอ (0.35 M ซอร์บิทอ 0.1 M ทริ EDTA, 25 มม.โซเดียมไบซัลไฟต์ 5 มม. pH 8.26), 1 volume นิวเคลียส lysis บัฟเฟอร์ (0.2 M ทริสเรทติ้ง EDTA, 50 มม. 2 M NaCl, 2% CTAB), และปริมาตร 0.4 5% Sarkosyl] แก้ไขลงหลอดไมโคร 2 มล.ที่ประกอบด้วยเนื้อเยื่อใบบดใน N ของเหลว และได้รับการกกแล้ว ที่อุณหภูมิ 65 ° C สำหรับ 100-200 มิลลิกรัม30-60 นาที 2) เพิ่มการผสม และจากที่ 10,000 rpm 10 µl 750 แอลกอฮอล์คลอโรฟอร์ม: isoamyl (24:1)นาที 3) ชั้นบนออก และผสม ด้วยหนึ่ง isopropanol เย็น แล้ว จากที่ 10,000rpm 10 นาที 4 เม็ด)ถูกล้าง ด้วยเย็น 75% เอทานอล แห้งสำหรับ 5 นาทีในความเร็วในสุญญากาศ ressuspended ใน50 µl TE บัฟเฟอร์ (pH 7.5) (Sambrook et al. 1991), และจากนั้น รักษา ด้วย 10 µl ของ RNase เป็น (1 มิลลิกรัม/มิลลิลิตร) ที่ 37 ° C สำหรับ30 นาที Quantified DNA ถูกเก็บไว้ที่-20 ° C จนถึงการตรวจวิเคราะห์ของ cp transgene โดย PCR22 A 2 µl ทั้ง 100 ฉบับ / µl โซลูชันของดีเอ็นเอที่ออกใช้เป็นแม่แบบสำหรับ PCR ภายใต้เงื่อนไขต่อไปนี้: 100 ฉบับของแต่ละ dNTP, 1 X PCR บัฟเฟอร์ 100 ฉบับละ 5' ส่วนปลาย 3' ไพรเมอร์ 1.5 มม. MgCl2 และ 2.5 หน่วยของดีเอ็นเอพอลิเมอเรสต่อหลอด ในโวลุ่ม 50 µl aq รอบ 3 นาที 94 ° C, 40 ° C 1 นาที และ 72 องศาเซลเซียส 3 นาที ตามมา โดยรอบที่ 30 92 ° C 1 นาที 1 นาที 53 ° C และ 2.5 นาที 72° C และวงจรของ 72 ° C 7 นาที ใช้เงื่อนไขเดียวกันในการขยายโครงสร้างของยีน allcp และผลิตภัณฑ์ PCR แยกตัวตามที่อธิบายไว้ข้างต้น33 สิบไมโครกรัมไฮนด์ III-ย่อยดีเอ็นเอถูกคั่น โดยอิ 1% agarose เจบัฟเฟอร์ใน TBE X 1 ย้อม ด้วยโบรไมด์ ethidium และโอนย้ายไปเยื่อไนล่อน GeneScreenPlus (ระบบเทคโนโลยีชีวภาพ วิจัยผลิตภัณฑ์ฆราวาส Boston, MA) ใช้ฝอยโอนตามที่อธิบายไว้ในผู้ผลิตโพรโทคอล เมมเบรนเป็นไฮบริด ด้วยโพรบที่ประกอบด้วยยีน thecp สรรพสามิตจากรุ่น TL ของยีนที่อธิบายไว้ก่อนหน้าในงานนี้ และติดป้าย ด้วย 32 P โดยใช้ไพรเมอร์แบบสุ่มจากระบบ (Feinberg & V ogelstein, 1983)ใบมะละกอ 44 ถูก homogenized ในบัฟเฟอร์สกัด (0.25 มโพแทสเซียมฟอสเฟต 0.1 M EDTA, pH 7.5)(Gonsalves & Ishii, 1980) แล้ว จากที่ 5,000 rpm ที่อุณหภูมิ 4° C สำหรับโปรตีนทั้งหมด 3 นาทีถูกวัดในตัวอย่างโดย Bio-ล้อ ProteinAssay (เชื้อ NY)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การวิเคราะห์ของพืชดัดแปรพันธุกรรม PCR, blot ภาคใต้และเอลิซาวิเคราะห์:
พืชดีเอ็นเอของพืชมะละกอดัดแปรพันธุกรรมและ nontransgenic ถูกสกัดดังนี้ 1) 750 ไมโครลิตรของ buffer สกัด
[หนึ่งปริมาณของบัฟเฟอร์สกัดดีเอ็นเอ (0.35 M ซอร์บิทอ, 0.1 M Tris 5 มิลลิ EDTA, 25 มมโซเดียม bisulfite ค่า pH 8.26) 1 ปริมาณบัฟเฟอร์นิวเคลียสสลาย (0.2 M Tris 50 มิลลิ EDTA, 2 M NaCl, 2% CTAB) และ 0.4 ปริมาณของ 5% Sarkosyl] ถูก
เพิ่มลงใน 2 มล. ไมโคร หลอดที่มี 100-200 มิลลิกรัมของพื้นดินเนื้อเยื่อใบในของเหลว N แล้วบ่มที่อุณหภูมิ 65 องศาเซลเซียสเป็นเวลา
30-60 นาที; 2) 750 ไมโครลิตรคลอโรฟอร์ม: เครื่องดื่มแอลกอฮอล์ isoamyl (24: 1) ถูกบันทึกอยู่ในการผสมและหมุนเหวี่ยงที่ 10,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 10
นาที; 3) ชั้นบนจะถูกลบออกและผสมกับปริมาณหนึ่ง isopropanol เย็นแล้วหมุนเหวี่ยงที่ 10,000
รอบต่อนาทีเป็นเวลา 10 นาที; 4) เม็ดได้รับการล้างด้วยน้ำเย็นเอทานอล 75% แห้งเป็นเวลา 5 นาทีในสุญญากาศความเร็ว ressuspended ใน
50 ไมโครลิตรของ TE บัฟเฟอร์ (pH 7.5) (Sambrook et al., 1991) และจากนั้นได้รับการรักษาที่มี 10 ไมโครลิตรของ RNase A ( 1 mg / ml) ที่ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา
30 นาที ปริมาณ DNA ถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียสจน assaying การปรากฏตัวของยีน CP โดยวิธี PCR.

22 หาร 2 ไมโครลิตร 100 ng / วิธีการแก้ปัญหาไมโครลิตรของดีเอ็นเอถูกนำมาใช้เป็นแม่แบบสำหรับ PCR ภายใต้เงื่อนไขดังต่อไปนี้: 100 NG ของแต่ละ dNTP , 1X PCR บัฟเฟอร์ 100 NG ของแต่ละ 5'-end และ 3'สิ้นไพรเมอร์, 1.5 มิลลิ MgCl2 และ 2.5 หน่วยโพลิเมอร์ผู้ทรง AQ ดีเอ็นเอต่อหลอดในปริมาณ 50 ไมโครลิตร รอบ 94 ° C / 3 นาที, 40 ° C / 1 นาทีและ 72 ° C / 3 นาทีตามมาด้วย 30 รอบ 92 ° C / 1 นาที, 53 ° C / 1 นาทีและ 72 ° C / 2.5 นาทีและวงจรของ 72 ° C / 7 นาที เงื่อนไขเดียวกันถูกนำมาใช้ในการขยาย allcp โครงสร้างยีนและผลิตภัณฑ์ PCR ที่ถูกแยกออกจากกันตามที่อธิบายไว้ข้างต้น.

33 สิบไมโครกรัมดีเอ็นเอ Hind III-ย่อยถูกแยกจากกันโดย electrophoresis ในเจล agarose 1% บัฟเฟอร์ใน 1X TBE, ย้อมด้วย ethidium bromide และ โอนไปยังเมมเบรน GeneScreenPlus ไนลอน (เทคโนโลยีชีวภาพระบบวิจัยผลิตภัณฑ์ NEN, บอสตัน) โดยใช้การโอนเส้นเลือดฝอยที่อธิบายไว้ในโพรโทคอของผู้ผลิต เมมเบรนถูกไฮบริดที่มีการสอบสวนประกอบด้วยยีน thecp ตัดจากรุ่น TL ของยีนที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ในงานนี้และติดป้าย 32 P โดยใช้ระบบไพรเมอร์แบบสุ่มตาม (ไฟน์เบิร์ก & V ogelstein, 1983).

44 ใบมะละกอมี หดหายในบัฟเฟอร์สกัด (0.25 M โพแทสเซียมฟอสเฟต 0.1 M EDTA, ค่า pH 7.5)
(ก้านขดและอิชิ, 1980) และจากนั้นหมุนเหวี่ยงที่ 5,000 รอบต่อนาทีที่ 4 ° C เป็นเวลา 3 นาที โปรตีนรวมอยู่ที่วัดในตัวอย่าง
โดย Bio-Rad ProteinAssay (Bio-Rad ห้องปฏิบัติการนิวยอร์ก)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การวิเคราะห์พืชดัดแปรพันธุกรรม โดยตรวจสอบด้วยการทำ Southern blot และ ELISA การวิเคราะห์ :พืชดัดแปรพันธุกรรม ดีเอ็นเอ และ nontransgenic พืชมะละกอสกัด ดังนี้ 1 ) 750 µผมกันชน การสกัด[ หนึ่งปริมาณของบัฟเฟอร์การสกัดดีเอ็นเอ ( 0.35 m ซอร์บิทอล 0.1 M โดย 5 mM EDTA , 25 มิลลิเมตรโซเดียมไบซัลไฟต์ , pH 8.26 ) 1 ปริมาณของการสลายบัฟเฟอร์ ( 0.2 เมตรโดย 50 mM EDTA , 2 M NaCl , 2% ctab ) , และ 0.4 ปริมาณ 5% sarkosyl ] คือเพิ่มเป็น 2 หลอดบรรจุ 100-200 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตรไมโครใบเนื้อเยื่อพื้นในของเหลวไนโตรเจน แล้วบ่มที่อุณหภูมิ 65 องศา C สำหรับ30-60 นาที 2 ) 750 µชั้นคลอโรฟอร์ม : แอลกอฮอล์ในปริมาณ ( 24 : 1 ) ถูกเพิ่มไปยังผสมไฟฟ้าที่ 10 , 000 รอบต่อนาที 10มิน ; 3 ) ชั้นบนจะถูกลบออกและผสมกับปริมาณของกระแสไฟฟ้าที่เย็นแล้ว ,รอบต่อนาทีเป็นเวลา 10 นาที 4 ) เม็ดถูกล้างด้วยเอทานอล 75% เย็นแห้งเป็นเวลา 5 นาทีในความเร็ว ressuspended ในสุญญากาศ50 µ l TE บัฟเฟอร์ pH 7.5 ) ( sambrook et al . , 1991 ) และจากนั้นได้รับ 10 µลเลส ( 1 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตรที่อุณหภูมิ 37 องศา C สำหรับ30 นาที ปริมาณดีเอ็นเอที่ถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิ - 20 องศา C ถึง assaying พระพักตร์ของยีน CP โดย PCR22 2 µ L ส่วนลงตัวกับ 100 ng / µ L สารละลายดีเอ็นเอถูกใช้เป็นแม่แบบสำหรับ PCR ภายใต้เงื่อนไขต่อไปนี้ : 100 ng ของแต่ละ dntp , 1x PCR buffer , 100 กรัมของแต่ละ 5 " - 3 " - จบท้ายด้วย 1.5 มม. MgCl2 และ 2.5 หน่วยๆ AQ DNA polymerase ต่อ หลอดใน 50 µ L ปริมาณ วงจรของ 94 ° C / 3 นาที 40 ° C / 1 นาที และ 72 ° C / 3 นาที ตามด้วย 30 รอบ 92 องศา C / 1 นาที 53 ° C / 1 นาที และ 72 ° C / 2.5 นาที และโดยรอบ 72 ° C / 7 นาที เงื่อนไขเดียวกันถูกใช้เพื่อขยายยีน allcp โครงสร้างและผลิตภัณฑ์ PCR ถูกแยกจากกันตามที่อธิบายไว้ข้างต้น33 ไมโครกรัมสิบของ Hind III ย่อยดีเอ็นเอถูกแยกโดยวิธีอิเล็กโทรโฟรีซีสใน 1% เจลกรดใน 1X ทีบี เปื้อนกับทิเดียมโบรไมด์ และโอนไปยังเยื่อไนลอน genescreenplus ( เทคโนโลยีชีวภาพระเณรวิจัยผลิตภัณฑ์ , Boston , MA ) การถ่ายโอนความสามารถตามที่อธิบายไว้ในขั้นตอนของผู้ผลิต เยื่อแผ่นกับดีเอ็นเอตรวจสอบที่ประกอบด้วยยีน thecp ตัดจาก TL รุ่นของยีนอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ในงานนี้ และติดป้ายที่มีต่อโดยใช้ primer แบบสุ่มที่ใช้ระบบ ( ไฟน์เบิร์ก & V ogelstein , 1983 )44 ใบมะละกอบดในการสกัด ( 0.25 m โพแทสเซียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ความเข้มข้น 0.1 M EDTA pH 7.5 )( กอนซาลเวส & อิชิ , 1980 ) และระดับที่ 5 , 000 รอบต่อนาทีที่อุณหภูมิ 4 องศา C เป็นเวลา 3 นาที รวมเป็นปริมาณโปรตีนในตัวอย่างโดยไบโอ ราด proteinassay ( ห้องปฏิบัติการ , เรด ไบโอ นิวยอร์ก )