Example 3: Generation of improved s

Example 3: Generation of improved succinate alanine strains

a) Basfia succiniciproducens DD1 was transformed as described above with the
pSacB_เดลต้า_/dhA and "Campbelled in" to yield a "Campbell in" strain. Transformation and integration into the genome of Basfia succiniciproducens was confirmed by PCR
20 yielding bands for the integrational event of the plasmid into the genome of Basfia
succiniciproducens.
The "Campbell in" strain was then "Campbelled out" using agar plates containing ซูโครส as a counter selection medium, selecting for the loss (of function) of the sacB gene. Therefore, the "Campbell in" strains were incubated in 25-35 ml of non selective
25 medium (BHI containing no antibiotic) at 37°C, 220 rpm over night. The overnight
culture was then streaked onto freshly prepared BHI containing ซูโครส plates (10%,
no antibiotics) and incubated overnight at 37°C ("first การส่งผ่านซูโครส"). Single colony
obtained from first transfer were again streaked onto freshly prepared BHI containing
ซูโครส plates (10%) and incubated overnight at 37°C ("second การส่งผ่านซูโครส").
30 This procedure was repeated until a minimal completion of five transfers ("third, forth,
fifth การส่งผ่านซูโครส") in ซูโครส. The term "first to fifth การส่งผ่านซูโครส" refers to the transfer of a strain after chromosomal integration of a vector containing a sacB-levan-
sucrase gene onto ซูโครส and growth medium containing agar plates for the purpose of selecting for strains with the loss of the sacB gene and the surrounding plasmid
35 sequences. Single colony from the fifth transfer plates were inoculated onto 25-35 ml
of non selective medium (BHI containing no antibiotic) and incubated at 37°C,
220 rpm over night. The overnight culture was serially diluted and plated onto BHI plates to obtain isolated single colonies.
The "Campbelled out" strains containing either the ไวด์ไทป์ situation of the /dhA-locus
40 or the mutation/deletion of the /dhA-gene were confirmed by คลอแรมเฟนิคอล
sensitivity. The mutation/deletion mutants among these strains were identified and



PF 75583
20
confirmed by PCR analysis. This led to the /dhA-deletion mutant Basfia succiniciproducens DD1 AldhA.
b) Basfia succiniciproducens DD1 AldhA was transformed with pSacB_เดลต้า_pf/D as
described above and "Campbelled in" to yield a "Campbell in" strain. Transformation
5 and integration was confirmed by PCR. The "Campbell in" strain was then
"Campbelled out" as described previously. The deletion mutants among these strains
were identified and confirmed by PCR analysis. This led to the IdhA OD-double
deletion mutant Basfia succiniciproducens DD1 AldhA Apf/D.
c) Basfia succiniciproducens DD1 AldhA ApfID (DD3) was transformed with pSacB_alaD
10 as described above and "Campbelled in" to yield a "Campbell in" strain.
Transformation and integration was confirmed by PCR. The "Campbell in" strain was then "Campbelled out" as described previously. The mutants among these strains were identified and confirmed by PCR analysis. This led to the IdhA pflD alaD mutant Basfia succiniciproducens DD1 AIdhA ApfID alaD (DD3 alaD).
15 d) Basfia succiniciproducens DD1 AldhA ApfID alaD (DD3 alaD) was transformed with
pSacB_เดลต้า_pckA as described above and "Campbelled in" to yield a "Campbell in" strain. Transformation and integration was confirmed by PCR. The "Campbell in" strain was then "Campbelled out" as described previously. The deletion mutants among these strains were identified and confirmed by PCR analysis. This led to the
20 mutant Basfia succiniciproducens DD1 AIdhA ApflD ApckA alaD (DD3 ApckA alaD).

Example 4: Cultivation of various DD1-strains on glucose

1. Medium preparation
25 The composition and preparation of the cultivation medium is as described in the
following tables 2 and 3.
Table 2a): Medium B4_AE (aerobic growth) composition (pre-culture) for cultivation on glucose.
Concentration
Compound
[g/L]
1 Calcium carbonate 50
2 Succinic acid 2.5
3 D-(+)-Glucose 50
4 Salt solution* 2,5
5 Sodium carbonate 2
6 Yeast extract 12.5
7 H2O ad 50 mL
30


PF 75583
21
Table 2 b) Medium B4_AN (anaerobic growth) composition (pre-culture) for cultivation on glucose.
Concentration

Compound

1 Magnesium sulfate
2 Succinic acid
3 D-(+)-Glucose
4 Salt solution*
5 Sodium carbonate
6 Yeast extract
7 H2O
* Salt solution:

[g/L]
50
2.5
50
2,5
2
12.5
ad 50 mL


Concentration
Compound
[gIL]

(NH4)2SO4 150
KH2PO4 100
5
Table 3a): Medium B5_AE (aerobic growth) composition glucose.
Concentration





(main-culture) for cultivation on

Compound

1 Calcium carbonate
2 Succinic acid

3 D-(+)-Glucose

4 Salt solution*

5 Ammonium sulfate

6 Sodium carbonate
7 Yeast extract
8 H2O



10






15

[g/L]
50
2.5

50

2,5
a) 6.5
b) 10.1
c) 13.7
2
12.5
ad 50 mL




PF 75583
22
Table 3b): Medium B5_AE (anaerobic growth) composition (main-culture) for cultivation on glucose.
Concentration

Compound

1 Magnesium sulfate
2 Succini

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ตัวอย่างที่ 3: สร้าง succinate ปรับปรุงสายพันธุ์อะลานีน) Basfia succiniciproducens DD1 ถูกแปลงตามที่อธิบายไว้ข้างต้นด้วยการpSacB_เดลต้า_/ดี เอชเอและ "Campbelled ใน" ต้องใช้ "Campbell ใน" ให้ การเปลี่ยนแปลงและรวมเป็นกลุ่ม Basfia succiniciproducens ได้รับการยืนยัน โดย PCR20 ผลผลิตวงสำหรับเหตุการณ์ integrational ของ plasmid ที่เป็นกลุ่มของ Basfiasucciniciproducensพันธุ์ "Campbell ใน" ถูกแล้ว "Campbelled ออก" โดยใช้แผ่น agar ที่ประกอบด้วยซูโครสเป็นเคาน์เตอร์เลือกสื่อ การเลือกสำหรับการสูญเสีย (ฟังก์ชัน) ของยีน sacB ดังนั้น สายพันธุ์ "Campbell ใน" ถูก incubated ใน 25-35 ml ของไม่เลือกกลาง 25 (BHI ที่ประกอบด้วยยาปฏิชีวนะไม่) ที่ 37° C, 220 รอบต่อนาทีข้ามคืน แอร์พอร์ตโอเวอร์ไนท์วัฒนธรรมแล้วมีลายบน BHI ลิ้มประกอบด้วยซูโครสแผ่น (10%ยาปฏิชีวนะไม่) และ incubated ที่ 37 ° C ค้างคืน ("แรกการส่งผ่านซูโครส") โคโลนีเดี่ยวรับจากแรก โอนได้อีกลายบน BHI ลิ้มประกอบด้วยซูโครสแผ่น (10%) และ incubated ที่ 37° C ค้างคืน ("สองการส่งผ่านซูโครส")30 ตอนนี้มีซ้ำจนกว่าจะเสร็จสมบูรณ์น้อยห้าโอน ("สาม ออกห้าการส่งผ่านซูโครส") ในซูโครส คำว่า "ครั้งแรกกับห้าการส่งผ่านซูโครส" หมายถึงการโอนต้องใช้หลังจากการรวมเวกเตอร์ประกอบด้วยการ sacB ของโครโมโซม-levan -sucrase ยีนบนซูโครสและเจริญเติบโตปานกลางมี agar แผ่นเพื่อเลือกสำหรับสายพันธุ์ที่มีการสูญเสียยีน sacB และ plasmid รอบลำดับ 35 โคโลนีเดี่ยวจากแผ่นโอนห้าถูก inoculated ไป 25-35 mlของไม่ใช้สื่อ (BHI ที่ประกอบด้วยยาปฏิชีวนะไม่) และ incubated ที่ 37° Cรอบต่อนาที 220 ข้ามคืน ค้างคืนวัฒนธรรมถูกผสม serially และเคลือบลงบนแผ่น BHI รับอาณานิคมแยกเดียวสายพันธุ์ "Campbelled ออก" ที่ประกอบด้วยทั้งสถานการณ์ไวด์ไทป์ของ /dhA-locus40 หรือการกลายพันธุ์/ลบ /dhA-gene ได้รับการยืนยัน โดยคลอแรมเฟนิคอลความไวในการ ระบุสายพันธุ์กลายพันธุ์/การลบระหว่างสายพันธุ์เหล่านี้ และ PF 7558320ยืนยัน โดยวิเคราะห์ PCR นี้นำไปสู่การ /dhA-deletion กลายพันธุ์ Basfia succiniciproducens DD1 AldhAข Basfia succiniciproducens DD1 AldhA ถูกแปลง ด้วย pSacB_เดลต้า_pf/D เป็นข้าง และ "Campbelled ใน" ต้องใช้ "Campbell ใน" ให้ การเปลี่ยนแปลง5 และรวมถูกยืนยัน โดย PCR พันธุ์ "Campbell ใน" ถูกแล้ว"Campbelled ออก" เป็นอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ลบสายพันธุ์ระหว่างสายพันธุ์เหล่านี้ระบุ และยืนยัน โดยวิเคราะห์ PCR นี้นำไป IdhA OD-คู่การลบกลายพันธุ์ Basfia succiniciproducens AldhA DD1 Apf/dc) Basfia succiniciproducens AldhA ApfID DD1 (DD3) แตกต่าง pSacB_alaD10 ตามที่อธิบายไว้ข้างต้นและ "Campbelled ใน" ต้องใช้ "Campbell ใน" ให้การเปลี่ยนแปลงและรวมถูกยืนยัน โดย PCR พันธุ์ "Campbell ใน" ได้แล้ว "Campbelled ออก" ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ สายพันธุ์ระหว่างสายพันธุ์เหล่านี้ได้ระบุ และยืนยัน โดยวิเคราะห์ PCR นี้นำไปสู่การ mutant alaD pflD IdhA Basfia succiniciproducens alaD DD1 AIdhA ApfID (DD3 alaD)15 d) Basfia succiniciproducens alaD DD1 AldhA ApfID (DD3 alaD) ถูกเปลี่ยนไปด้วยpSacB_เดลต้า_pckA ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น และ "Campbelled ใน" ต้องใช้ "Campbell ใน" ให้ การเปลี่ยนแปลงและรวมถูกยืนยัน โดย PCR พันธุ์ "Campbell ใน" ได้แล้ว "Campbelled ออก" ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ลบสายพันธุ์ระหว่างสายพันธุ์เหล่านี้ได้ระบุ และยืนยัน โดยวิเคราะห์ PCR นี้นำไปสู่การ20 กลายพันธุ์ Basfia succiniciproducens alaD DD1 AIdhA ApflD ApckA (DD3 ApckA alaD)ตัวอย่างที่ 4: การเพาะปลูกของสายพันธุ์ DD1 ต่าง ๆ ในกลูโคส1. เตรียมขนาดกลาง25 องค์ประกอบและเตรียมสื่อการเพาะปลูกอยู่ในตารางต่อไปนี้ 2 และ 3ตาราง 2a): กลาง B4_AE (แอโรบิกเติบโต) องค์ประกอบ (ก่อนวัฒนธรรม) สำหรับปลูกพืชในกลูโคสความเข้มข้นผสม[บัญชี]1 แคลเซียมคาร์บอเนต 50กรด 2 2.53 D- (+) -กลูโคส 50เกลือ 4 โซลูชัน * 2,55 โซเดียมคาร์บอเนต 2ยีสต์ 6 แยก 12.5โฆษณา H2O 7 50 mL30 PF 7558321ตาราง 2 ข) กลาง B4_AN (ไม่ใช้ออกซิเจนเจริญเติบโต) บทประพันธ์ (วัฒนธรรมก่อน) สำหรับปลูกพืชในกลูโคสความเข้มข้น ผสม1 แมกนีเซียมซัลเฟตกรด 23 D- (+) -กลูโคส4 เกลือแก้ปัญหา *5 โซเดียมคาร์บอเนตสารสกัดจากยีสต์ 6เอชทูโอ 7* เกลือโซลูชัน: [บัญชี]502.5502,5212.5โฆษณา 50 mL ความเข้มข้นผสม[จิ] (NH4) 2SO4 150KH2PO4 1005ตาราง 3a): น้ำตาลกลูโคส B5_AE กลาง (แอโรบิกเติบโต) องค์ประกอบความเข้มข้น (หลักวัฒนธรรม) สำหรับปลูกพืชใน ผสมแคลเซียมคาร์บอเนต 1กรด 23 D- (+) -กลูโคส4 เกลือแก้ปัญหา *5 แอมโมเนียซัลเฟต6 โซเดียมคาร์บอเนตสารสกัดจากยีสต์ 7เอชทูโอ 81015 [บัญชี]502.5502,5ก) 6.5ข) 10.1c) 13.7212.5โฆษณา 50 mL PF 7558322ตาราง 3b): กลาง B5_AE (ไม่ใช้ออกซิเจนเจริญเติบโต) องค์ประกอบ (หลักวัฒนธรรม) สำหรับปลูกพืชในกลูโคสความเข้มข้น ผสม1 แมกนีเซียมซัลเฟต2 Succini

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ตัวอย่างที่ 3: การสร้างสายพันธุ์ที่ดีขึ้นอะลานีน succinate ก) Basfia succiniciproducens DD1 ถูกเปลี่ยนตามที่อธิบายไว้ข้างต้นด้วยpSacB_ เดลต้า _ / ดีเอชเอและ "Campbelled ใน" เพื่อให้เป็น "แคมป์เบลใน" สายพันธุ์ การเปลี่ยนแปลงและบูรณาการเข้าไปในจีโนมของ succiniciproducens Basfia ได้รับการยืนยันโดยวิธี PCR 20 วงดนตรีที่ให้ผลผลิตสำหรับเหตุการณ์ integrational ของพลาสมิดเข้าไปในจีโนมของ Basfia succiniciproducens. ว่า "แคมป์เบลใน" สายพันธุ์แล้ว "Campbelled ออก" โดยใช้แผ่นวุ้นที่มีซูโครสเป็นเคาน์เตอร์ สื่อเลือกเลือกสำหรับการสูญเสีย (จากฟังก์ชั่น) ของยีน sacB ดังนั้น "แคมป์เบลใน" สายพันธุ์ที่ถูกบ่มใน 25-35 มล. ไม่เลือก25 ขนาดกลาง (BHI มียาปฏิชีวนะไม่ได้) ที่ 37 ° C, 220 รอบต่อนาทีข้ามคืน ค้างคืนวัฒนธรรมแล้วก็ลายลงบน BHI ปรุงสดใหม่ที่มีซูโครสแผ่น (10%, ยาปฏิชีวนะไม่ได้) และบ่มค้างคืนที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส ("ครั้งแรกของการส่งผ่านซูโครส") โคโลนีเดี่ยวที่ได้รับจากการโอนครั้งแรกที่มีลายอีกครั้งบนปรุงสดใหม่ BHI มีซูโครสแผ่น (10%) และบ่มค้างคืนที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส ("สองการส่งผ่านซูโครส"). 30 ขั้นตอนนี้ซ้ำจนกว่าจะเสร็จสิ้นที่น้อยที่สุดของห้าโอน ( "สามมาที่ห้าการส่งผ่านซูโครส") ในซูโครส คำว่า "ครั้งแรกที่ห้าการส่งผ่านซูโครส" หมายถึงการถ่ายโอนจากความเครียดหลังจากที่บูรณาการของโครโมโซมของเวกเตอร์ที่มี sacB-levan- ยีน sucrase บนซูโครสและขนาดกลางที่มีการเจริญเติบโตแผ่นวุ้นเพื่อวัตถุประสงค์ในการเลือกสายพันธุ์ที่มีการสูญเสีย ของยีน sacB และพลาสมิดรอบ35 ลำดับ อาณานิคมเดียวจากแผ่นโอนห้าถูกเชื้อเข้าสู่ 25-35 มล. ของกลางไม่เลือก (BHI มียาปฏิชีวนะไม่ได้) และบ่มที่อุณหภูมิ 37 ° C, 220 รอบต่อนาทีข้ามคืน วัฒนธรรมในชั่วข้ามคืนถูกเจือจางลำดับและชุบลงบนแผ่น BHI ที่จะได้รับอาณานิคมเดียวโดดเดี่ยว. "การ Campbelled ออก" สายพันธุ์ที่มีทั้งไวด์ไทป์สถานการณ์ของ / DHA-สถานที่40 หรือการกลายพันธุ์ / ลบ / DHA ยีนได้ ได้รับการยืนยันโดยคลอแรมเฟนิคอลไว การกลายพันธุ์ / ลบในหมู่มนุษย์กลายพันธุ์สายพันธุ์เหล่านี้ถูกระบุและPF 75583 20 ได้รับการยืนยันโดยการวิเคราะห์ PCR นี้นำไปสู่การ / DHA-ลบกลายพันธุ์ Basfia succiniciproducens DD1 AldhA. ข) Basfia succiniciproducens DD1 AldhA ถูกเปลี่ยนด้วย pSacB_ เดลต้า _pf / D เป็นอธิบายไว้ข้างต้นและ"Campbelled ใน" เพื่อให้เป็น "แคมป์เบลใน" สายพันธุ์ การเปลี่ยนแปลง5 และบูรณาการได้รับการยืนยันโดยวิธี PCR ว่า "แคมป์เบลใน" สายพันธุ์แล้ว"Campbelled ออก" ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ กลายพันธุ์ลบในหมู่สายพันธุ์เหล่านี้ถูกระบุและได้รับการยืนยันโดยการวิเคราะห์ PCR นี้นำไปสู่ ​​IdhA OD สองลบกลายพันธุ์Basfia succiniciproducens DD1 AldhA APF / D. ค) Basfia succiniciproducens DD1 AldhA ApfID (DD3) ถูกเปลี่ยนด้วย pSacB_alaD 10 ที่อธิบายข้างต้นและ "Campbelled ใน" เพื่อให้เป็น "แคมป์เบลใน" สายพันธุ์การเปลี่ยนแปลงและบูรณาการได้รับการยืนยันโดยวิธี PCR ว่า "แคมป์เบลใน" สายพันธุ์แล้ว "Campbelled ออก" ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ กลายพันธุ์ในหมู่สายพันธุ์เหล่านี้ถูกระบุและได้รับการยืนยันโดยการวิเคราะห์ PCR นี้นำไปสู่ ​​IdhA pflD alaD กลายพันธุ์ Basfia succiniciproducens DD1 AIdhA ApfID alaD (DD3 alaD). 15 ง) Basfia succiniciproducens DD1 AldhA ApfID alaD (DD3 alaD) ถูกเปลี่ยนด้วยpSacB_ เดลต้า _pckA ตามที่อธิบายไว้ข้างต้นและ "Campbelled ใน" เพื่อให้เป็น " แคมป์เบลใน "สายพันธุ์ การเปลี่ยนแปลงและบูรณาการได้รับการยืนยันโดยวิธี PCR ว่า "แคมป์เบลใน" สายพันธุ์แล้ว "Campbelled ออก" ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ กลายพันธุ์ลบในหมู่สายพันธุ์เหล่านี้ถูกระบุและได้รับการยืนยันโดยการวิเคราะห์ PCR นี้นำไปสู่​​20 กลายพันธุ์ Basfia succiniciproducens DD1 AIdhA ApflD ApckA alaD (DD3 ApckA alaD). ตัวอย่างที่ 4: การเพาะปลูกสายพันธุ์ DD1 ต่างๆในกลูโคส1 การเตรียมการขนาดกลาง25 องค์ประกอบและการเตรียมความพร้อมของกลางการเพาะปลูกที่มีการอธิบายไว้ในตารางต่อไปนี้ที่2 และ 3 ตารางที่ 2a): ขนาดกลาง B4_AE (การเจริญเติบโตแอโรบิก) องค์ประกอบ (Pre-วัฒนธรรม) สำหรับการเพาะปลูกในกลูโคส. ความเข้มข้นของสารประกอบ[กรัม / ลิตร] แคลเซียมคาร์บอเนต 1 50 2 Succinic กรด 2.5 3 D - (+) - กลูโคส 50 4 สารละลายเกลือ * 2,5 5 โซเดียมคาร์บอเนต 2 6 ยีสต์สกัด 12.5 7 H2O โฆษณา 50 มล30 PF 75583 21 ตารางที่ 2 ข) กลาง B4_AN (การเจริญเติบโตแบบไม่ใช้ออกซิเจน ) องค์ประกอบ (Pre-วัฒนธรรม) สำหรับการเพาะปลูกในกลูโคส. ความเข้มข้นของสารประกอบ1 แมกนีเซียมซัลเฟต2 Succinic กรด3 D - (+) - กลูโคส4 สารละลายเกลือ * 5 โซเดียมคาร์บอเนต6 ยีสต์สารสกัดจาก7 H2O * วิธีการแก้ปัญหาเกลือ: [g / L] 50 2.5 50 2.5 2 12.5 โฆษณา 50 มลความเข้มข้นของสารประกอบ[กิล] (NH4) 2SO4 150 KH2PO4 100 5 3a ตาราง): ขนาดกลาง B5_AE (การเจริญเติบโตแอโรบิก) ระดับน้ำตาลในองค์ประกอบ. ความเข้มข้น(หลักวัฒนธรรม) สำหรับการเพาะปลูกในCompound 1 แคลเซียมคาร์บอเนต2 กรดซั3 D - (+) - กลูโคส4 สารละลายเกลือ * 5 แอมโมเนียมซัลเฟต6 โซเดียมคาร์บอเนต7 สารสกัดจากยีสต์8 H2O 10 15 [g / L] 50 2.5 50 2.5) ที่ 6.5 ข) 10.1 ค) 13.7 2 12.5 โฆษณา 50 มลPF 75583 22 ตาราง 3b): ขนาดกลาง B5_AE (การเจริญเติบโตแบบไม่ใช้ออกซิเจน) องค์ประกอบ (หลักวัฒนธรรม) สำหรับการเพาะปลูกในกลูโคส. ความเข้มข้นของสารประกอบ1 แมกนีเซียมซัลเฟต2 Succini