Following the administration of the

Following the administration of the indicated treatments, the culture medium was removed and the cells were washed with cold PBS and scraped into 60 ml of cold lysis buffer. The protein content was determined by Bradford assay. Aliquots of the extracted proteins (approx. 30 mg/lane) were separed according to molecular weight on a mono-dimensional SDS-PAGE, 10% (for Beclin, Akt, p70S6K) and 12% (for LC3 and Caspase 3) and were transferred to nitrocellulose membrane. Non-specific binding sites were blocked with 5% (w/v) non-fat milk in Tris-buffered saline (pH 7.6) containing 0.1% (v/v) Tween 20, for 1h at room temperature. Nitrocellulose membrane was incubated with primary antibodies (caspase 3, LC3, Beclin 1, anti-phosphorylated and total form of Akt and p70S6K) overnight at 4 C. GAPDH was used a as loading control. After an additional incubation period with secondary HRP- coupled antibody for 1h at room temperature, the blots were developed by chemiluminescence using the ECL system and were quantified by scanning densitometry (UN-SCAN-IT gel 6.1)

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ต่อการดูแลรักษาที่ระบุ วัฒนธรรมสื่อที่ถูกเอาออก และล้าง ด้วย PBS เย็น และขูด 60 มล.เย็น lysis บัฟเฟอร์ลงในเซลล์ มีกำหนดปริมาณโปรตีน โดยทดสอบแบรดฟอร์ด Aliquots โปรตีนสกัด (ประมาณ 30 mg/เลน) ได้ separed ตามน้ำหนักโมเลกุลโมโนมิติ SDS-เพจ 10% (สำหรับ Beclin, Akt, p70S6K) และ 12% (สำหรับ LC3 และ Caspase 3) และถูกโอนย้ายไปไนโตรเซลลูโลสเมมเบรน รวมไม่ใช่เฉพาะไซต์ได้ถูกบล็อก ด้วยนมปลอดไขมัน 5% (w/v) ในน้ำเกลือที่ทริสเรทติ้งบัฟเฟอร์ (pH 7.6) ที่มี 0.1% (v/v) แต่ 20 สำหรับ h 1 ที่อุณหภูมิห้อง ไนโตรเซลลูโลสเมมเบรนมี incubated มีแอนติบอดีหลัก (caspase 3, LC3, Beclin 1 แบบฟอร์มรวม และ phosphorylated ป้องกัน Akt และ p70S6K) ค้างคืนที่ 4 ใช้ C. GAPDH ที่เป็นการโหลดตัวควบคุม หลังจากรอบระยะเวลาการกกไข่เพิ่มเติมกับรอง HRP - ควบคู่แอนติบอดีสำหรับ 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง จัดได้รับการพัฒนา โดยใช้ระบบ ECL chemiluminescence และถูกวัด โดยการสแกนชมีความหนาแน่น (UN สแกนมันเจล 6.1)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ต่อไปนี้การบริหารงานของการรักษาที่ระบุในอาหารเลี้ยงเชื้อจะถูกลบออกและเซลล์ที่ถูกล้างด้วยพีบีเอสที่หนาวเย็นและคัดลอกลงใน 60 มล. ของบัฟเฟอร์สลายเย็น ปริมาณโปรตีนถูกกำหนดโดยแบรดฟอทดสอบ aliquots ของโปรตีนสกัด (ประมาณ. 30 มก. / เลน) ถูก separed ตามน้ำหนักโมเลกุลบนโมโนมิติระบบ SDS-หน้า 10% (สำหรับ Beclin, สิ้นคิด, p70S6K) และ 12% (สำหรับ LC3 และ Caspase 3) และ โอนไปยังเมมเบรนไนโตรเซลลูโลส เว็บไซต์ที่มีผลผูกพันที่ไม่เฉพาะเจาะจงที่ถูกบล็อก 5% (w / v) นมไม่มีไขมันในน้ำเกลือ Tris บัฟเฟอร์ (pH 7.6) ที่มี 0.1% (v / v) Tween 20 สำหรับ 1H ที่อุณหภูมิห้อง เมมเบรน nitrocellulose ถูกบ่มกับแอนติบอดีปฐมภูมิ (caspase 3 LC3, Beclin 1 ป้องกัน phosphorylated และรูปแบบทั้งหมดของสิ้นคิดและ p70S6K) ค้างคืนที่ 4 องศาเซลเซียส GAPDH ถูกใช้เป็นตัวควบคุมการโหลด หลังจากระยะฟักตัวเพิ่มเติมกับ HRP- รองคู่แอนติบอดีสำหรับ 1H ที่อุณหภูมิห้อง blots ได้รับการพัฒนาโดย chemiluminescence ใช้ระบบ ECL และได้รับการวัดโดยการสแกน densitometry (UN-SCAN-IT เจล 6.1)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ตามการบริหารงานพบการรักษาวัฒนธรรม สื่อจะถูกลบออกและเซลล์ถูกล้างด้วย pbs เย็นและขูดลงในบัฟเฟอร์การสลาย 60 ml ของเย็น ปริมาณโปรตีนที่ถูกตัดสินใจโดยเซ็นต์ ตามลำดับ เฉยๆของการสกัดโปรตีน ( ประมาณ 30 มิลลิกรัม เลน ) เป็น separed ตามบน SDS-PAGE น้ำหนักโมเลกุลโมโนมิติ 10% ( สำหรับ beclin akt p70s6k , , และ 12 % ( สำหรับ lc3 แคสเปสและ 3 ) และได้มีการโอนไนโตรเซลลูโลสเมมเบรน ไม่เฉพาะเจาะจงรวมเว็บไซต์ที่ถูกบล็อกด้วย 5 % ( w / v ) ไม่อ้วนนมหรือในน้ำเกลือ ( pH 7.6 ) ที่ประกอบด้วย 0.1% ( v / v ) Tween 20 , 1 ที่อุณหภูมิห้อง ไนโตรเซลลูโลสเมมเบรนแยกแอนติบอดีประถมศึกษา ( แคสเปส 3 , lc3 beclin 1 , ต่อต้าน , ฟอสฟอรีเลเตตและรวมและรูปแบบของ akt p70s6k ) ค้างคืนที่ 4 C . gapdh ถูกใช้เป็นการควบคุม หลังจากเพิ่มระยะเวลาการบ่มด้วยรองช - คู่แอนติบอดีสำหรับ 1 ที่อุณหภูมิห้อง , ไม้ถูกพัฒนาโดยนโยบายแรงงานโดยใช้ระบบการทดสอบและวัดได้โดยการสแกน densitometry ( un-scan-it เจล 6.1 )