Sperm, egg, and embryo cryopreserva

Sperm, egg, and embryo cryopreservation are desirable tools for conservation of commercially important and endangered fish species, ensuring a stable supply for the aquaculture industry, and storage of genetic materials for future study and use. Cryopreservation of fish sperm is well established and fish gene banks (based on sperm) are in operation in several countries. Conversely, although tremendous efforts have been undertaken in the past decades, there has been limited progress in cryopreservation of fish eggs and embryos. This failure has been attributed to insufficient cryoprotectant (CPA) permeation before cooling [1], [2], [3] and [4]. In that regard, the large size of fish embryos results in a low surface area to volume ratio and reduces the total amount of CPA that can be taken up [5] and [6]. Consequently, insufficient internal CPA concentrations cause physical damage to embryos, because of formation of intra- and extracellular ice crystals, particularly during slow cooling and thawing [7], [8] and [9]. Vitrification, which can be achieved by ultrarapid cooling of biological materials in combination with high internal concentrations of CPAs, might overcome ice crystal formation. However, for this purpose, innovative methods must be developed to achieve fast and uniform permeation of the CPA into the various compartments of fish embryos while concurrently minimizing CPA toxicity.

Membrane electropermeabilization (or electroporation) is useful for introduction of membrane-impermeable xenomolecules (e.g., drugs, hormones, proteins, plasmids, etc.) into living cells, and the controlled release of intracellular substances [10] and [11]. Electropermeabilization is based on the temporary increase of membrane permeability caused by reversible electrical breakdown of the plasma membrane on application of external high-intensity but very short duration field pulses [12]. Because this approach was used to incorporate trehalose into mouse myeloma cells (Sp2 line) for cryopreservation [13], perhaps electroporation could improve the rate of CPA permeation into fish embryos. However, this has apparently never been reported.

The objective of the present study was to determine the relative efficiency of electroporation for impregnation of CPA into embryos of Japanese whiting (Sillago japonica), a model marine fish used in our previous studies of fish embryo cryopreservation [14] and [15]. Thus, we determined the effects of electroporation conditions (voltage, number of pulses, pre- and posttreatment exposure to CPA, and CPA concentrations) on embryo survival and the internal concentrations of CPA in embryos. Dimethyl sulfoxide (DMSO) was chosen as the cryoprotectant for this study, because it is relatively nontoxic to whiting embryos compared with other CPAs [15] and because its concentration in embryos can be accurately measured by high performance liquid chromatography [16]. In addition, we also compared the suitability of two embryonic developmental stages (somites and tail elongation stages) for electroporation-mediated CPA impregnation and performed a preliminary cryopreservation trial using the best conditions determined in this study.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

เครื่องมือที่ต้องการอนุรักษ์พันธุ์ปลาใกล้สูญพันธุ์ และสำคัญในเชิงพาณิชย์ บริการจัดหาที่มั่นคงสำหรับอุตสาหกรรมเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำ และการจัดเก็บวัสดุพันธุกรรมสำหรับการศึกษาในอนาคตและใช้ cryopreservation สเปิร์ม ไข่ และตัวอ่อนได้ Cryopreservation อสุจิปลาจะดีขึ้น และธนาคารยีนปลา (ตามสเปิร์ม) อยู่ในการดำเนินงานในหลายประเทศ ในทางกลับกัน แม้ว่าจะมีการดำเนินความพยายามอย่างมากในทศวรรษ มีได้จำกัดความคืบหน้าใน cryopreservation ไข่ปลาและโคลน มีการบันทึกความล้มเหลวนี้ซึมพอ cryoprotectant (CPA) ก่อนที่จะระบายความร้อน [1], [2], [3] และ [4] ในสัมมาคารวะที่ ขนาดใหญ่ของปลาโคลนผลอัตราส่วนปริมาตรพื้นที่ต่ำ และลดยอดเงินรวมของ CPA ที่มีค่า [5] [6] ดังนั้น CPA ไม่เพียงพอภายในความเข้มข้นทำให้โคลน เนื่องจากการก่อตัวของอินทราและผลึกน้ำแข็ง extracellular โดยเฉพาะในช่วงเย็นช้าและ thawing [7], [8] และ [9] Vitrification ซึ่งสามารถทำได้ โดย ultrarapid ระบายความร้อนของวัสดุชีวภาพร่วมกับความเข้มข้นภายในสูงของ CPAs อาจเอาชนะการก่อตัวของผลึกน้ำแข็ง อย่างไรก็ตาม สำหรับวัตถุประสงค์นี้ วิธีการนวัตกรรมต้องได้รับการพัฒนาให้รวดเร็ว และสม่ำเสมอซึม CPA ลงในช่องต่าง ๆ ของโคลนปลาในขณะที่ลดความเป็นพิษของ CPA พร้อมElectropermeabilization เมมเบรน (หรือ electroporation) ใช้สำหรับการแนะนำผ่านเมมเบรนของ xenomolecules (เช่น ยา ฮอร์โมน โปรตีน plasmids ฯลฯ ลงในเซลล์ที่นั่งเล่น), และปล่อยควบคุมของ intracellular สาร [10] [11] Electropermeabilization ตั้งอยู่ชั่วคราวเพิ่ม permeability เยื่อที่เกิดจากการแบ่งตัวอย่างไฟฟ้าของเยื่อพลาสมาในแอพลิเคชันภายนอกสูงความเข้มแต่กะพริบฟิลด์ระยะเวลาที่สั้นมาก [12] เนื่องจากวิธีการนี้ถูกใช้เพื่อรวม trehalose เป็นเมาส์ myeloma เซลล์ (Sp2 บรรทัด) สำหรับ cryopreservation [13], ที electroporation สามารถเพิ่มอัตราการซึมผ่าน CPA เป็นโคลนปลา อย่างไรก็ตาม นี้เห็นได้ชัดว่าไม่ได้รายงานการวัตถุประสงค์ของการศึกษาปัจจุบันมีการ ตรวจสอบประสิทธิภาพสัมพัทธ์ของ electroporation ในทำให้มีขึ้นของ CPA เป็นโคลนของญี่ปุ่น whiting (Sillago japonica), ปลาทะเลจำลองใช้ในการศึกษาของเราก่อนหน้านี้ปลา cryopreservation อ่อน [14] และ [15] ดังนั้น เรากำหนดผลของเงื่อนไข electroporation (แรงดันไฟฟ้า จำนวนพัลส์ สัมผัสก่อน และ posttreatment CPA และความเข้มข้นของ CPA) อ่อนรอดตายและความเข้มข้นภายในของ CPA ในโคลน Dimethyl sulfoxide (DMSO) ถูกเลือกเป็น cryoprotectant สำหรับการศึกษานี้ เนื่อง จากเป็นพิษทั้งค่อนข้างที่จะโคลน whiting เทียบกับ CPAs อื่น ๆ [15] และเนื่อง จากความเข้มข้นในโคลนสามารถถูกต้องวัด โดย chromatography เหลวประสิทธิภาพสูง [16] นอกจากนี้ เรายังเปรียบเทียบความเหมาะสมของสองตัวอ่อนพัฒนาขั้น (somites และระยะหาง elongation) สำหรับ electroporation mediated CPA ทำให้มีขึ้น และดำเนินการทดลอง cryopreservation เบื้องต้นที่ใช้เงื่อนไขดีที่สุดที่กำหนดในการศึกษานี้

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

อสุจิไข่ตัวอ่อนและเก็บรักษาเครื่องมือที่พึงประสงค์สำหรับการอนุรักษ์เชิงพาณิชย์ที่สำคัญและใกล้สูญพันธุ์ปลาเพื่อให้มั่นใจอุปทานที่มั่นคงสำหรับอุตสาหกรรมการเพาะเลี้ยงและการจัดเก็บสารพันธุกรรมเพื่อการศึกษาและการใช้งานในอนาคต เก็บรักษาของตัวอสุจิปลาจะดีขึ้นและธนาคารยีนปลา (ขึ้นอยู่กับสเปิร์ม) ในการทำงานในหลาย ๆ ประเทศ ในทางกลับกันแม้ว่าจะพยายามอย่างมากที่ได้รับการดำเนินการในทศวรรษที่ผ่านมามีความคืบหน้าในการเก็บรักษาที่ จำกัด ของไข่และตัวอ่อนปลา ความล้มเหลวนี้ได้รับการบันทึกให้เพียงพอ cryoprotectant (CPA) การซึมผ่านก่อนที่จะระบายความร้อน [1], [2], [3] และ [4] ในเรื่องที่ขนาดใหญ่ของปลาผลตัวอ่อนในพื้นที่ผิวในระดับต่ำเมื่อเทียบกับอัตราส่วนและลดจำนวนของ CPA ที่สามารถนำมาขึ้น [5] และ [6] ดังนั้นความเข้มข้นไม่เพียงพอ CPA ภายในทำให้เกิดความเสียหายทางกายภาพเพื่อตัวอ่อนเพราะการก่อตัวของผลึกน้ำแข็ง intra- และนอกโดยเฉพาะในช่วงการระบายความร้อนช้าและละลาย [7] [8] และ [9] การแช่แข็งซึ่งสามารถทำได้โดยการระบายความร้อนของวัสดุ ultrarapid ทางชีวภาพในการรวมกันที่มีความเข้มข้นสูงของภายใน CPAs อาจเอาชนะการก่อตัวของผลึกน้ำแข็ง อย่างไรก็ตามสำหรับวัตถุประสงค์นี้วิธีการใหม่ที่จะต้องได้รับการพัฒนาเพื่อให้เกิดการซึมผ่านได้อย่างรวดเร็วและสม่ำเสมอของ CPA ลงในช่องต่างๆของตัวอ่อนปลาในขณะเดียวกันก็ลดความเป็นพิษของ CPA. เมมเบรน electropermeabilization (หรือ electroporation) จะเป็นประโยชน์สำหรับการแนะนำของ xenomolecules เมมเบรนผ่านไม่ได้ (เช่น ยาฮอร์โมนโปรตีนพลาสมิด ฯลฯ ) ลงในเซลล์ที่มีชีวิตและควบคุมการปลดปล่อยของสารภายในเซลล์ [10] และ [11] Electropermeabilization จะขึ้นอยู่กับการเพิ่มขึ้นชั่วคราวของการซึมผ่านเยื่อหุ้มเซลล์ที่เกิดจากการสลายไฟฟ้าย้อนกลับของเมมเบรนพลาสม่าในการประยุกต์ใช้ความเข้มสูงภายนอก แต่ระยะเวลาที่สั้นมากพัลส์สนาม [12] เพราะวิธีการนี้ถูกนำมาใช้เพื่อรวมทรีฮาโลเข้าสู่เซลล์ myeloma เมาส์ (สาย SP2) สำหรับเก็บรักษา [13] บางที electroporation สามารถปรับปรุงอัตราการซึมผ่านเข้าไปในตัวอ่อน CPA ปลา แต่นี้ยังเห็นได้ชัดว่าไม่เคยได้รับรายงาน. วัตถุประสงค์ของการศึกษานี้คือเพื่อตรวจสอบประสิทธิภาพญาติของ electroporation สำหรับการทำให้การสอบบัญชีรับอนุญาตเข้าไปในตัวอ่อนของไวทิงญี่ปุ่น (เห็ด japonica) เป็นรูปแบบปลาทะเลที่ใช้ในการศึกษาก่อนหน้านี้ของเราของตัวอ่อนปลาแช่แข็ง [14] และ [15] ดังนั้นเราจึงมุ่งมั่นที่ผลกระทบของสภาพ electroporation (แรงดันจำนวนของพัลส์เปิดรับก่อนและ posttreatment การสอบบัญชีรับอนุญาตและความเข้มข้นของ CPA) ในการอยู่รอดของตัวอ่อนและความเข้มข้นภายในของ CPA ในตัวอ่อน dimethyl sulfoxide (DMSO) ได้รับเลือกเป็น cryoprotectant สำหรับการศึกษานี้เพราะมันค่อนข้างปลอดสารพิษที่จะไวทิงตัวอ่อนเมื่อเทียบกับ CPAs อื่น ๆ [15] และเพราะความเข้มข้นในตัวอ่อนสามารถวัดได้อย่างถูกต้องโดยโคของเหลวสมรรถนะสูง [16] นอกจากนี้เรายังเปรียบเทียบความเหมาะสมของสองขั้นตอนการพัฒนาตัวอ่อน (ไขสันหลังและขั้นตอนการยืดหาง) สำหรับการทำให้ CPA electroporation พึ่งและดำเนินการทดลองเบื้องต้นเก็บรักษาโดยใช้เงื่อนไขที่ดีที่สุดที่กำหนดไว้ในการศึกษาครั้งนี้

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

อสุจิ ไข่และตัวอ่อนเนื่องจากเป็นเครื่องมือที่พึงปรารถนาเพื่อการอนุรักษ์เชิงพาณิชย์ที่สำคัญและสายพันธุ์ปลาที่ใกล้สูญพันธุ์ มั่นใจอุปทานคงที่สำหรับอุตสาหกรรมการเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำ และการจัดเก็บวัสดุทางพันธุกรรมเพื่อการศึกษาในอนาคต และใช้ การเก็บรักษาน้ำเชื้อปลาเป็นที่ยอมรับและปลาธนาคารยีน ( ขึ้นอยู่กับสเปิร์ม ) ในการดำเนินงานในหลายประเทศ ในทางกลับกันแม้ว่าความพยายามมหาศาล มีการแลก ในทศวรรษที่ผ่านมา มีการ จำกัด ความคืบหน้าในการเก็บรักษาไข่ตัวอ่อนและปลา . ความล้มเหลวนี้ได้ถูกว่าน้ำยาไม่เพียงพอ ( CPA ) การซึมผ่านความร้อนก่อน [ 1 ] , [ 2 ] , [ 3 ] และ [ 4 ] ที่นบนอบขนาดใหญ่ ขนาดของปลาที่เพาะเลี้ยงผลในพื้นที่ผิวปริมาตรต่ำ เพื่อช่วยลดปริมาณรวมของบัญชีที่สามารถนำขึ้น [ 5 ] [ 6 ] ดังนั้น ปริมาณไม่เพียงพอ ก่อให้เกิดความเสียหายทางกายภาพกับ CPA ภายในอ่อน เพราะการก่อตัวของภายในและภายนอกผลึกน้ำแข็ง โดยเฉพาะในช่วงเย็นและละลายช้า [ 7 ] , [ 8 ] และ [ 9 ] การ ,ซึ่งสามารถทำได้โดยการใช้สารชีวภาพในการรวมกันกับ ultrarapid สูงภายในปริมาณการใช้งาน อาจเอาชนะการเกิดผลึกน้ำแข็ง อย่างไรก็ตาม สำหรับวัตถุประสงค์นี้ วิธีการนวัตกรรมจะต้องได้รับการพัฒนาเพื่อให้บรรลุผ่านอย่างรวดเร็ว และเครื่องแบบของ CPA เข้าไปในช่องต่างๆของตัวปลาขณะที่จาก CPA

ลดความเป็นพิษเยื่อ electropermeabilization ( electroporation ) เป็นประโยชน์ในเบื้องต้นของเยื่อที่ไม่ได้ xenomolecules ( เช่นยา , ฮอร์โมน , โปรตีน , พลาสมิด , ฯลฯ ) เป็นเซลล์ที่มีชีวิต และควบคุมการปลดปล่อยของสารที่เซลล์ [ 10 ] และ [ 11 ]electropermeabilization ขึ้นอยู่กับเพิ่มการซึมผ่านเมมเบรนแบบชั่วคราวที่เกิดจากไฟฟ้าของเยื่อหุ้มเซลล์ในรายละเอียดการใช้สนามภายนอก แต่ระยะเวลาสั้นมากกะพริบ [ 12 ] เพราะวิธีการนี้ถูกใช้เพื่อรวมการเป็นเมาส์มากในเซลล์ ( SP2 ) สำหรับผู้ป่วย [ 13 ]บางที electroporation สามารถปรับปรุงอัตราการซึมผ่านเป็น CPA เลี้ยงปลา อย่างไรก็ตาม มันก็เห็นได้ชัดว่าไม่เคยมีรายงาน .

มีวัตถุประสงค์เพื่อหาประสิทธิภาพสัมพัทธ์ของ electroporation เพื่อเคลือบของ CPA ในตัวอ่อนของปลาญี่ปุ่น ( Sillago จาป )แบบจำลองที่ใช้ในการศึกษาก่อนหน้านี้ปลาทะเลปลาตัวอ่อนก่อน [ 14 ] และ [ 15 ] ดังนั้นเราจึงตัดสินใจผลของเงื่อนไข electroporation ( แรงดัน จำนวนพัลส์ , Pre - รักษาแสง CPA , CPA ในการอยู่รอดและความเข้มข้น ) ตัวอ่อนและความเข้มข้นภายในของ CPA ในตัว . ไดเมทิลซัลฟอกไซด์ ( DMSO ) ได้รับเลือกให้เป็นน้ำยาสำหรับการศึกษานี้เพราะมันค่อนข้างปลอดสารพิษเพื่อประสิทธิภาพการใช้งานอื่น ๆเมื่อเทียบกับ [ 15 ] และเพราะความเข้มข้นของในตัวที่สามารถวัดได้อย่างถูกต้องโดยวิธีโครมาโทกราฟีของเหลวสมรรถนะสูง [ 16 ] นอกจากนี้เราเปรียบเทียบความเหมาะสมของทั้งสองขั้นตอนการพัฒนาตัวอ่อน ( somites ยืดหางและขั้นตอน ) electroporation โดย CPA เคลือบและดำเนินการทดลองเชื้อเบื้องต้นโดยใช้เงื่อนไขที่ดีที่สุดมุ่งมั่นในการศึกษา .