The isolated protoplasts were filte

The isolated protoplasts were filtered through a 100 μm nylon mesh (Millipore, Durham, UK) and centrifuged at 1,000 rpm for 5 min. Pellets were resuspended in 0.5 M sucrose with 1 mM MES, overlaid with 2 ml of W5 salt solution (Menczel et al. 1981), and centrifuged for 10 min at 1,200 rpm. Protoplasts, now localized in the interphase between two solutions, were collected into a new tube with addition of W5 solution, and centrifuged at 1,000 rpm for 5 min. The protoplast pellet was then resuspended in culture medium, and protoplast yield was counted using a hemocytometer. Density of cultured protoplasts was adjusted to 8× 105 per milliliter of culture medium. The protocol of Damm and Willmitzer (1988) with modification of Grzebelus et al. (2012) for protoplast immobilization in a calcium alginate layer was employed. A suspension of protoplast and alginate solution consisting of 2.8% (w/v) Na-alginate and 0.4 M mannitol was prepared by gentle mixing in equal volumes to obtain a final density of protoplasts in the culture of 4×105 ml−1. Approximately 0.5 ml of protoplast–alginate mixture was gently spread onto 1% (w/v) agar containing
266 KIEŁKOWSKA AND ADAMUS
20 mM CaCl2. After 1 h incubation at room temperature, alginate disks with immobilized protoplasts were formed. The disks were transferred to the 6 cm Petri dish containing 4 ml of culture medium.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

โปแยกกรองผ่านตาข่ายเป็นไนล่อน 100 μm (มาก เดอแรม สหราชอาณาจักร) และ centrifuged ที่ 1000 rpm 5 นาทีขี้ถูก resuspended ในซูโครส 0.5 M กับ 1 มม. MES, overlaid กับ 2 ml ของ W5 เกลือ (Menczel et al. 1981), และ centrifuged สำหรับ 10 นาทีที่ 1200 rpm โป ตอนนี้ เป็นภาษาท้องถิ่น interphase ระหว่างสองโซลูชั่น ได้รวบรวมเป็นหลอดใหม่มีเพิ่มโซลูชัน W5 และ centrifuged ที่ 1000 rpm สำหรับ 5 นาที เม็ด protoplast เป็น resuspended แล้วในวัฒนธรรม และผลผลิต protoplast ถูกนับโดยใช้การ hemocytometer ความหนาแน่นของโปอ่างปรับปรุง 8 × 105 ต่อ milliliter ของสื่อวัฒนธรรม โพรโทคอลอยู่และ Willmitzer (1988) มีการปรับเปลี่ยนของ Grzebelus et al. (2012) สำหรับตรึงโป protoplast ในชั้นแอลจิเนตแคลเซียมถูกจ้าง ระงับ protoplast และแอลจิเนตโซลูชั่นที่ประกอบด้วยแอลจิเนตนาและ 0.4 M mannitol 2.8% (w/v) ถูกเตรียม โดยอ่อนโยนผสมในปริมาณที่เท่ากันเพื่อให้ได้ความหนาแน่นที่สุดท้ายของโปในวัฒนธรรมของ 4 × 105 ml−1 ประมาณ 0.5 ml ของ protoplast – แอลจิเนตผสมค่อย ๆ กระจายไปลง 1% (w/v) agar ที่ประกอบด้วย266 KIEŁKOWSKA และ ADAMUS20 มม. CaCl2 หลังจาก 1 h บ่มที่อุณหภูมิห้อง มีรูปดิสก์แอลจิเนตที่ มีเอนไซม์โป ดิสก์ถูกโอนย้ายไป 6 ซม.ประกอบด้วย 4 ml ของวัฒนธรรมกลางจานเพาะเชื้อ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

protoplasts แยกถูกกรองผ่าน 100 ไมโครเมตรตาข่ายไนลอน (คเดอร์แฮมสหราชอาณาจักร) และหมุนเหวี่ยงที่ 1,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 5 นาที เม็ดที่ถูก resuspended ใน 0.5 M ซูโครส 1 มิลลิ MES, บุด้วย 2 มิลลิลิตรของสารละลายเกลือ W5 (Menczel et al. 1981) และปั่นเป็นเวลา 10 นาทีที่ 1,200 รอบต่อนาที protoplasts หน่วงขณะนี้อยู่ในระหว่างเฟสระหว่างสองการแก้ปัญหาที่ถูกเก็บลงในหลอดใหม่ที่มีการเพิ่มของการแก้ปัญหา W5 และหมุนเหวี่ยงที่ 1,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 5 นาที เม็ดโปรโตพลาถูก resuspended แล้วในสื่อวัฒนธรรมและผลผลิตโปรโตพลานับโดยใช้ hemocytometer ความหนาแน่นของโปรโตพลาเลี้ยงปรับ 8 × 105 มิลลิลิตรต่อของกลางวัฒนธรรม โปรโตคอลของ Damm และ Willmitzer (1988) ที่มีการปรับเปลี่ยนของ Grzebelus et al, (2012) สำหรับการตรึงโปรโตพลาในชั้นแคลเซียมอัลจิเนตเป็นลูกจ้าง ระงับของโปรโตพลาอัลจิเนตและการแก้ไขปัญหาประกอบด้วย 2.8% (w / v) ณ อัลจิเนตและ 0.4 M แมนนิทอลได้รับการจัดทำขึ้นโดยการผสมอ่อนโยนในปริมาณที่เท่ากันเพื่อให้ได้ความหนาแน่นของโปรโตพลาสุดท้ายในวัฒนธรรมของ 4 × 105 มล. -1 ประมาณ 0.5 มิลลิลิตรผสมโปรโตพลา-อัลจิเนตกระจายเบา ๆ ลงบน 1% (w / v) วุ้นที่มี
266 KIEŁKOWSKAและ Adamus
20 มิลลิ CaCl2 หลังจากการบ่ม 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องดิสก์อัลจิเนตที่มีโปรโตพลาตรึงกำลังก่อตัวขึ้น ดิสก์ถูกย้ายไป 6 ซม. จานเลี้ยงเชื้อที่มี 4 มล. ของกลางวัฒนธรรม