Amplification assays used 100 ng of

Amplification assays used 100 ng of template DNA,
25 ll of a master mix (BioMix, Bioline Ltd., London,
UK) – this including reaction buffer, dNTPs, MgCl2 and
Taq DNA polymerase, – PCR water (Genaxis, Montigny
le Bretonneaux, France) and 25 pmol of each primer, to
achieve a final volume of 50 ll. Amplification conditions
were as follows: a previous denaturing step at 94 C for
1 min 30 s was coupled to 35 cycles of denaturation
(94 C for 20 s), annealing (temperature gradient: 51–
55 C for 20 s), and extension (72 C for 30 s), and with a
final extension at 72 C for 15 min. All PCR assays were
performed on a MyCycler thermocycler (BioRad, Hercules,
CA, USA).
The restriction profiles of the PCR products were investigated
using the endonucleases AluI, TaqI and HinfI, all of
them from Sigma. Restriction assays were carried out for
2 h at 37 C or 65 C in a final volume of 20 ll. Species
identification was achieved by comparing the number and
sizes of the restriction fragments obtained with the commercial
products with respect to the restriction patterns
of the reference specimens compiled in Table 2.
2.4. Electrophoresis and image analysis
PCR products were processed in 2.5% horizontal agarose
(MS-8, Pronadisa, Madrid, Spain) electrophoresis.
PCR-RFLP analyses were carried out with agarose electrophoresis
in 2.5% gels and with SDS–PAGE in 15% ExcelGel
homogeneous gels (GE Healthcare) at 15 C in a
Multiphor II electrophoresis unit (Amersham Biosciences,
Uppsala, Sweden). The latter gels were stained using a
standard silver staining protocol (Amersham Biosciences).
When required, PCR products were purified from the agarose
gels by means of the MinElute Gel Extraction kit
(QIAGEN). Image analysis was carried out by means of
the 1-D Manager software (TDI, Madrid, Spain). DNA
sequencing was performed as described below.
2.5. DNA sequencing and genetic analysis
Prior to sequencing, the PCR products were purified by
means of the ExoSAP-IT kit (GE Healthcare, Uppsala,
Sweden). Direct sequencing was performed with the BigDye
Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems).
The same primers used for PCR were used for
the sequencing of both strands of the PCR products,
respectively. Sequencing reactions were analyzed in an
automatic sequencing system (ABI 3730XL DNA Analyser,
Applied Biosystems) provided with the POP-7 system.
SNP events in DNA sequences were reviewed with
the Chromas software. Alignment of sequences was accomplished
using the CLUSTALW software (Thompson, Higgins,
& Gibson, 1994). The homologies of the nucleotide
sequences were searched with the BLAST tool (NCBI).
Phylogenetic and molecular evolutionary analyses were
conducted with the MEGA software (Kumar, Tamura,
Jakobsen, & Nei, 2001) using the neighbour-joining
Table

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ขยาย assays ใช้ 100 ฉบับของแม่ดีเอ็นเอ25 ll ของส่วนผสมหลัก (BioMix, Bioline จำกัด ลอนดอนสหราชอาณาจักร) – รวมปฏิกิริยาบัฟเฟอร์นี้ dNTPs, MgCl2 และTaq DNA พอลิเมอเรส – น้ำ PCR (Genaxis, Montignyle Bretonneaux ฝรั่งเศส) และ pmol ที่ 25 ของแต่ละสีรองพื้น การให้ได้เสียงที่ดีสุดท้ายของ 50 จะขยายเงื่อนไขมีดังนี้: denaturing ก่อนหน้าขั้นตอนที่ 94 C สำหรับ1 นาที 30 วินาทีถูกควบคู่ไปกับรอบ 35 ของแปรสภาพ(94 C เป็นเวลา 20 s), หลอม (อุณหภูมิ: 51 –55 C 20 s), และส่วนขยาย (72 C 30 s), และมีการนามสกุลสุดท้าย 72 c เป็นเวลา 15 นาที Assays PCR ทั้งหมดได้ดำเนินการในเครื่อง thermocycler MyCycler (BioRad ดาวCA, USA)มีการตรวจสอบโพรไฟล์จำกัดผลิตภัณฑ์ PCRใช้ endonucleases AluI อัลฮิลาลีย์ และ HinfI ทั้งหมดพวกเขาจากซิกม่า Assays จำกัดดำเนินการสำหรับ2 ชม. ที่ 37 C หรือ C 65 ในโวลุ่ม 20 สุดท้ายจะสายพันธุ์รหัสสำเร็จ โดยเปรียบเทียบจำนวน และขนาดของบางส่วนของข้อจำกัดที่ได้รับจากการพาณิชย์ผลิตภัณฑ์เกี่ยวกับรูปแบบจำกัดตัวอย่างการอ้างอิงที่รวบรวมตารางที่ 22.4. อิและการวิเคราะห์ภาพผลิตภัณฑ์ PCR ถูกประมวลผลใน 2.5% agarose แนวนอน(MS-8, Pronadisa มาดริด สเปน) อิPCR-RFLP วิเคราะห์ดำเนินการ ด้วย agarose อิในเจล 2.5% และ มี SDS – หน้า 15% ExcelGelเหมือนเจ (GE สุขภาพ) ที่ 15 C ในการหน่วยอิ Multiphor II (ออก Amershamอุปซาลา สวีเดน) ภาพเจหลังใช้เป็นเงินมาตรฐานที่ย้อมสีโพรโทคอล (Amersham ออก)เมื่อจำเป็น ผลิตภัณฑ์ PCR ได้บริสุทธิ์จากการ agaroseโดยชุดดูด MinElute เจเจ(QIAGEN) วิเคราะห์รูปภาพถูกดำเนินการโดยวิธีของ1 D ซอฟต์แวร์จัดการ (TDI มาดริด สเปน) ดีเอ็นเอลำดับได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง2.5. ลำดับดีเอ็นเอและการวิเคราะห์ทางพันธุกรรมก่อนลำดับ ผลิตภัณฑ์ PCR ได้บริสุทธิ์โดยวิธีการของชุด ExoSAP-มัน (สุขภาพ GE อุปซาลาสวีเดน) ดำเนินการจัดลำดับโดยตรงกับ BigDyeเทอร์มิเนเตอร์ v3.1 รอบจัดลำดับชุด (ใช้ศาสตร์เชิงชีวภาพ)ไพรเมอร์เดียวกันที่ใช้สำหรับ PCR ถูกนำมาใช้สำหรับลำดับของทั้งสองสายของผลิตภัณฑ์ PCRตามลาดับ ลำดับปฏิกิริยาถูกวิเคราะห์ในการระบบอัตโนมัติลำดับ (ABI 3730XL วิเคราะห์ดีเอ็นเอศาสตร์เชิงชีวภาพใช้) ให้กับระบบ POP-7สอบทานกิจกรรม SNP ในลำดับดีเอ็นเอด้วยซอฟต์แวร์ Chromas จัดลำดับที่ทำสำเร็จโดยใช้ซอฟต์แวร์ CLUSTALW (ทอมป์สัน ฮิกกินส์และกิบสัน 1994) Homologies ของนิวคลีโอไทด์ลำดับถูกค้นหา ด้วยเครื่องมือระเบิด (NCBI)มีการวิเคราะห์วิวัฒนาการทาง และโมเลกุลดำเนินการกับซอฟต์แวร์ล้าน (Kumar ทาJakobsen และเล่ง 2001) การใช้เพื่อนบ้านร่วมตาราง

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ตรวจ Amplification ใช้ 100 NG ดีเอ็นเอแม่แบบ
25 LL ส่วนผสมหลัก (BioMix, Bioline จำกัด , ลอนดอน,
สหราชอาณาจักร) - นี้รวมทั้งกันชนปฏิกิริยา dNTPs, MgCl2 และ
Taq DNA Polymerase - น้ำ PCR (Genaxis, Montigny
Le Bretonneaux, ฝรั่งเศส) และ 25 pmol ของแต่ละไพรเมอร์เพื่อ
ให้บรรลุเล่มสุดท้าย 50 LL เงื่อนไขการขยาย
มีดังนี้ขั้นตอนขั้นเปลี่ยนก่อนหน้านี้ที่ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา
1 นาที 30 วินาทีเป็นคู่ถึง 35 รอบของการสูญเสียสภาพธรรมชาติ
(94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 20 s), อบอ่อน (อุณหภูมิลาด: 51-
55 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 20 s), และการขยาย ( 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาที) และมี
การขยายสุดท้ายที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 15 นาที การตรวจ PCR ทั้งหมดถูก
ดำเนินการบน thermocycler MyCycler (BioRad ดาว,
CA, USA)
โปรไฟล์ข้อ จำกัด ของผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ถูกตรวจสอบ
โดยใช้ endonucleases AluI, Taqi และ HinfI ทั้งหมดของ
พวกเขาจากซิกม่า การวิเคราะห์ข้อ จำกัด ได้ดำเนินการสำหรับ
2 ชั่วโมงที่ 37 C หรือ 65 C ในปริมาณสุดท้ายของ 20 LL สายพันธุ์
ประจำตัวประชาชนก็ประสบความสำเร็จโดยการเปรียบเทียบจำนวนและ
ขนาดของชิ้นส่วนข้อ จำกัด ที่ได้รับกับการค้า
ผลิตภัณฑ์ที่เกี่ยวกับรูปแบบข้อ จำกัด
ของตัวอย่างอ้างอิงที่รวบรวมในตารางที่ 2
2.4 electrophoresis และการวิเคราะห์ภาพ
ผลิตภัณฑ์ PCR ที่ถูกประมวลผลใน 2.5% agarose แนวนอน
(MS-8 Pronadisa, มาดริด, สเปน) electrophoresis
PCR-RFLP วิเคราะห์ได้ดำเนินการกับอิเล็ก agarose
ในเจล 2.5% และระบบ SDS-หน้า 15% ExcelGel
เจลเนื้อเดียวกัน (GE Healthcare) ที่ 15 C ใน
หน่วย electrophoresis Multiphor ii (Amersham ชีววิทยาศาสตร์,
Uppsala, สวีเดน) เจลหลังมีการย้อมโดยใช้
โปรโตคอลมาตรฐานการย้อมสีเงิน (Amersham ชีววิทยาศาสตร์)
เมื่อจำเป็นต้องใช้ผลิตภัณฑ์พีซีอาร์มีบริสุทธิ์จาก agarose
เจลโดยวิธีการของชุด MinElute เจลสกัด
(QIAGEN) การวิเคราะห์ภาพได้ดำเนินการโดยวิธีการของ
ซอฟต์แวร์ผู้จัดการ 1-D (TDI, มาดริด, สเปน) ดีเอ็นเอ
ลำดับได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง
2.5 ลำดับดีเอ็นเอและการวิเคราะห์ทางพันธุกรรม
ก่อนที่จะมีการจัดลำดับผลิตภัณฑ์ PCR ถูกทำให้บริสุทธิ์โดย
วิธีการของชุด ExoSAP-IT (GE Healthcare, Uppsala,
สวีเดน) ลำดับโดยตรงได้ดำเนินการกับ BigDye
Terminator Kit v3.1 วงจรลำดับ (Applied Biosystems)
ไพรเมอร์เดียวกับที่ใช้สำหรับ PCR ถูกนำมาใช้สำหรับ
การจัดลำดับของทั้งสองเส้นของผลิตภัณฑ์ PCR ที่
ตามลำดับ ปฏิกิริยา Sequencing ถูกนำมาวิเคราะห์ใน
ระบบลำดับอัตโนมัติ (ABI 3730XL ดีเอ็นเอ Analyser,
Applied Biosystems) ให้กับระบบ POP-7
เหตุการณ์ SNP ในลำดับดีเอ็นเอทานกับ
ซอฟต์แวร์ chromas การจัดตำแหน่งของลำดับก็ประสบความสำเร็จ
โดยใช้ซอฟต์แวร์ ClustalW ( ธ อมป์สัน, ฮิกกินส์
และกิบสัน, 1994) homologies ของเบส
ลำดับถูกค้นด้วยเครื่องมือระเบิด (NCBI)
วิวัฒนาการและโมเลกุลวิเคราะห์วิวัฒนาการถูก
ดำเนินการกับซอฟแวร์เมกะ (มาร์ทามูระ
Jakobsen และ Nei, 2001) โดยใช้เพื่อนบ้านเข้า
ตาราง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

( พยายามใช้ 100 นาโนดีเอ็นเอแม่แบบ25 จะเป็น Master Mix ( biomix bioline , จำกัด , ลอนดอนสหราชอาณาจักร ) –นี้รวมถึงปฏิกิริยาบัฟเฟอร์ dntps ชุด , และดีเอ็นเอพอลิเมอเรส ทัค ( PCR , น้ำ ( genaxis ออนไลน์ ,เลอ bretonneaux , ฝรั่งเศส ) และ 25 pmol ของแต่ละคู่ ,บรรลุปริมาตรสุดท้ายของ 50 จะ เงื่อนไขการขยายมีดังนี้ ก่อนหน้าี่ขั้นตอนที่ 94 C สำหรับ1 นาที 30 วินาทีเป็นคู่ 35 ( รอบ( 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 20 วินาที ) , การอบอุณหภูมิสี ( : 51 )55 C 20 ) และนามสกุล ( 72 C 30 ) และกับการขยายสุดท้ายที่ 72 องศาเซลเซียสนาน 15 นาที วิธี PCR คือดำเนินการใน mycycler เทอร์มอไซเคล ์ ( biorad , Hercules ,แคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา )จำกัด รูปแบบ ของผลิตภัณฑ์ PCR พบว่าการจะ taqi hinfi สงบเงียบ , และทั้งหมดจาก Sigma จำกัด ) ได้ทดลองสำหรับ2 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส หรือ 65 ในเล่มสุดท้ายของ 20 จะ ชนิดการทำโดยการเปรียบเทียบจำนวนและข้อ จำกัด ขนาดของชิ้นส่วนที่ได้รับกับพาณิชย์ผลิตภัณฑ์ที่มีการจำกัดรูปแบบตัวอย่างของการอ้างอิงไว้ในรางที่ 22.4 . การวิเคราะห์เรส และภาพลักษณ์ผลิตภัณฑ์ทั้งหมดจะถูกประมวลผลใน 2.5% , แนวนอน( ms-8 pronadisa , มาดริด , สเปน ) เรสวิเคราะห์ว่าได้ทดลองกับกระต่าย ,ใน 2.5 % และเจลด้วย SDS – 15 % excelgel หน้าเป็นเจล ( GE Healthcare ) ที่ 15 C ในหน่วยที่ 2 ( วิธี multiphor ชีววิทยาอุปซอลา , สวีเดน ) เจลหลังการเปรอะเปื้อนเงินมาตรฐานโปรโตคอล ( ติดที่ Biosciences )เมื่อต้องใช้ ผลิตภัณฑ์ทั้งหมดจะถูกแยกจากโรสเจลโดยวิธีของ minelute เจลสกัด ชุด( เพิ่ม ) การวิเคราะห์ภาพที่ถูกนำออกโดยวิธีการของภายในซอฟต์แวร์ที่จัดการ ( TDI , มาดริด , สเปน ) ดีเอ็นเอการกระทำตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง2.5 ดีเอ็นเอและการวิเคราะห์พันธุกรรมก่อนลำดับ ผลิตภัณฑ์ทั้งหมดจะถูกทำให้บริสุทธิ์ด้วยวิธีการของ exosap มัน Kit ( GE Healthcare อุปซอลาสวีเดน ) การกระทำโดยตรงด้วย bigdyeคนเหล็ก v3.1 รอบลำดับชุด ( Applied Biosystems )เดียวกันใช้ PCR ไพรเมอร์ที่ใช้สำหรับอายุของทั้งสองเส้นของผลิตภัณฑ์ PCR ,ตามลำดับ ปฏิกิริยาในการวิเคราะห์ระบบติดตามอัตโนมัติ ( ABI 3730xl วิเคราะห์ดีเอ็นเอ ,Applied Biosystems ) ให้กับระบบ pop-7 .SNP ในลำดับดีเอ็นเอทบทวนกับเหตุการณ์Chromas ซอฟต์แวร์ การเรียงตัวของลำดับได้การใช้ซอฟต์แวร์ ( clustalw ทอมสัน ฮิกกินส์& Gibson , 1994 ) การ homologies ของยีนที่ลำดับถูกตรวจค้นด้วยเครื่องมือระเบิด ( ncbi )วิวัฒนาการและโมเลกุลวิเคราะห์วิวัฒนาการคือดำเนินการกับซอฟต์แวร์ที่เมกา ( คูมาร์ ทามูระจาคอบเซ่น และเนย , 2001 ) การใช้เพื่อนบ้านเข้าร่วมตาราง