2.4. Real time quantitative PCRTota

2.4. Real time quantitative PCR
Total RNA was isolated from six alpaca skin samples (3 white, 3 brown). 1 μg DNase-treated RNA was converted to cDNA using PrimeScript RT reagent kit mix (TakaRa, Japan). The cDNA was then used for real time PCR quantification of mRNAs using the gene specific forward and reverse primers (Slc7a11-R-F, Slc7a11-R-R, 10 μM). β-actin was served as an endogenous control (primers listed in Table 1). Quantitative Real-Time PCR was performed in triplicate on the Stratagene Mx3005P system. The 25 μL PCR reaction included 12.5 μL SYBR Premix Ex TaqTM II (TaKaRa, Dalian, China), 1.0 μL of each specific forward and universal primers, 0.5 μL of ROX reference dye, 1.0 μL of diluted (8 times) cDNA and 9 μL of water. The following cycling parameters were used for real time PCR: 95 °C held for 30 s followed by 40 cycles of 95 °C for 5 s, 56 °C for 20 s and 72 °C for 15 s. Melting curve analyses were performed following amplifications. Quantification of Slc7a11 transcript abundance was performed using the comparative threshold cycle (CT) method established by Livak et al. ( Livak and Schmittgen, 2001) ( Suppl. Table 1).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.4 PCR ประมาณเวลาจริงอาร์เอ็นเอทั้งหมดถูกแยกต่างหากจากตัวอย่างผิวอัลปากาหก (3 สีขาว 3 สีน้ำตาล) 1 μg DNase ถือว่าอาร์เอ็นเอถูกแปลงเป็น cDNA ที่ใช้ PrimeScript RT รีเอเจนต์ชุดผสม (TakaRa ญี่ปุ่น) CDNA ได้จากนั้นใช้สำหรับนับ PCR เวลาจริงของ mRNAs ที่ยีนเฉพาะไปข้างหน้า และย้อนกลับไพรเมอร์ (Slc7a11-R-F, Slc7a11 R R, 10 μM) โดยใช้ Βแอกตินทำหน้าที่เป็นตัวควบคุม endogenous (ไพรเมอร์ที่แสดงในตารางที่ 1) เชิงปริมาณ Real-Time PCR ที่ดำเนินการใน triplicate บนระบบ Stratagene Mx3005P ปฏิกิริยา PCR 25 μL รวม 12.5 μL ผสม Premix SYBR Ex TaqTM II (TaKaRa ต้าเหลียน จีน), μL 1.0 ของไพรเมอร์ไปข้างหน้า และสากลแต่ละเฉพาะ μL 0.5 ของ ROX อ้างอิงย้อม μL 1.0 ของ cDNA (8 เท่า) และ μL 9 น้ำ พารามิเตอร์ต่อไปนี้ขี่จักรยานใช้เวลาจริง PCR: 95 ° C จัดขึ้น 30 s ตามวงจร 40 95 องศาเซลเซียสสำหรับ 5 s, 56 ° C สำหรับ 20 s และ 72 ° C สำหรับวิเคราะห์โค้งหลอมเหลว s ได้ 15 ดำเนินต่อ amplifications นับของ Slc7a11 เสียงบรรยายความทำโดยใช้วิธี (CT) ของวงจรเปรียบเทียบขีดจำกัดก่อตั้งขึ้นโดย Livak et al. (Livak และ Schmittgen, 2001) (Suppl. ตารางที่ 1)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.4 . เวลาจริงปริมาณ RNA PCR
รวมได้หกอัลปาก้าผิวตัวอย่าง ( 3 ขาว 3 สีน้ำตาล ) 1 μ G ตรวจหา ADNase รักษา RNA ถูกเปลี่ยนไปใช้ชุดผสม 3 สายพันธุ์ primescript RT ( Takara , ญี่ปุ่น ) วิธีคือใช้สำหรับเวลาจริงและปริมาณของรหัสโดยใช้ยีนเฉพาะที่ไปข้างหน้าและย้อนกลับ PCR ( slc7a11-r-f slc7a11-r-r , 10 , μ M )บีตา - actin ถูกเสิร์ฟเป็นควบคุมภายนอก ( ชนิดที่ระบุไว้ในตารางที่ 1 ) Real Time PCR เชิงปริมาณแสดงทั้งสามใบในระบบ mx3005p stratagene . 25 μ L เพื่อตรวจหารวม 12.5 μฉัน SYBR รวมอดีต taqtm II ( Takara , Dalian , จีน ) , 1.0 μผมของแต่ละหน้า และสากล ไพรเมอร์ , 0.5 μ L สีอ้างอิง Rox 1.0 ลิตรμเจือจาง ( ครั้งที่ 8 ) cDNA และ 9 μลิตรของน้ำต่อไปนี้จักรยานค่าใช้ Real Time PCR : 95 องศา C จัดขึ้นสำหรับ 30 วินาทีตามด้วย 40 รอบ 95 องศา C เป็นเวลา 5 วินาที , 56 ° C เป็นเวลา 20 และ 72 ° C เป็นเวลา 15 วินาที โดยมีการปฏิบัติตาม amplifications ละลายโค้ง . ปริมาณของ slc7a11 หลักฐานมากมายแสดงโดยใช้วงจรเปรียบเทียบ ( CT ) โดยใช้เกณฑ์ที่จัดตั้งขึ้นโดย livak et al . ( livak และ schmittgen , 2001 ) ( Suppl .ตารางที่ 1 )