Recombinant proteins overexpressed

Recombinant proteins overexpressed in and purified from Escherichia coli contain impurities that are toxic in biological assays. The application of affinity purification procedures is often not sufficient to remove these toxic components. We here describe a simple and fast, one-step protocol to remove these impurities highly efficiently. Four recombinant proteins were overexpressed in E. coli as His-tagged fusion proteins and purified by immobilized metal chelate affinity chromatography on Ni–NTA beads. Depending on the protein, the composition of the lysis buffer, and the washing protocol, various impurities appeared to be present in the purified protein preparations. Here we show how the use of 60% isopropanol during washing steps removed most of these contaminants from the end products. In addition to the removal of proteins that aspecifically adhere to the beads or to the tagged protein, this procedure was particularly useful in removing endotoxins. Moreover, we show that detergents such as NP-40, that are necessarily employed during lysis, are also efficiently removed. Finally, we show that proteins are able to refold correctly after isopropanol treatment. Thus, the resulting end products contain significantly less contaminating E. coli proteins, endotoxins, and detergents.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

Recombinant โปรตีน overexpressed ใน และบริสุทธิ์จาก Escherichia coli ประกอบด้วยสิ่งสกปรกที่มีพิษใน assays ชีวภาพ การประยุกต์ขั้นตอนการฟอกความสัมพันธ์คือมักจะไม่เพียงพอที่จะเอาส่วนประกอบเหล่านี้เป็นพิษ ที่นี่เราอธิบายโพรโทคอลขั้นตอนเดียวง่าย และรวด เร็ว เอาสิ่งสกปรกเหล่านี้ได้อย่างมีประสิทธิภาพสูง สี่ recombinant โปรตีนถูก overexpressed ใน E. coli เป็นโปรตีนของแท็กฟิวชั่น และบริสุทธิ์ โดย chromatography เอนไซม์ความสัมพันธ์แอซิดโลหะบนลูกปัด Ni – NTA ขึ้นอยู่กับส่วนประกอบของบัฟเฟอร์ lysis และโพรโทคอลซักผ้า โปรตีน สิ่งสกปรกต่าง ๆ ปรากฏ อยู่ในเตรียมโปรตีนบริสุทธิ์ ที่นี่เราแสดงวิธีใช้ 60% isopropanol ในระหว่างขั้นตอนการซักผ้าเอาส่วนใหญ่ของสารปนเปื้อนเหล่านี้จากผลิตภัณฑ์สิ้นสุด นอกจากการกำจัดโปรตีน ที่ aspecifically ตามเม็ด หรือ โปรตีนติดแท็ก กระบวนการนี้มีประโยชน์ในการเอา endotoxins นอกจากนี้ เราแสดงว่า ผงซักฟอกเช่น NP-40 ที่จำเป็นต้องว่าจ้างระหว่าง lysis จะลบออกยังมีประสิทธิภาพ สุดท้าย เราแสดงว่า โปรตีนจะ refold อย่างถูกต้องหลังจากรักษา isopropanol ดังนั้น ผลิตภัณฑ์สุดท้ายได้ มีอย่างมีนัยสำคัญน้อยขยะโปรตีน E. coli, endotoxins ผงซักฟอก

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

โปรตีน overexpressed และบริสุทธิ์จากเชื้อ Escherichia coli มีสิ่งเจือปนที่เป็นพิษในการวิเคราะห์ทางชีวภาพ การประยุกต์ใช้ขั้นตอนการทำให้บริสุทธิ์สัมพันธ์ที่ใกล้ชิดมักจะไม่เพียงพอที่จะเอาส่วนประกอบที่เป็นพิษเหล่านี้ ที่นี่เราอธิบายที่ง่ายและรวดเร็วโปรโตคอลขั้นตอนหนึ่งที่จะเอาสิ่งสกปรกเหล่านี้ได้อย่างมีประสิทธิภาพสูง สี่โปรตีนถูก overexpressed ในเชื้อ E. coli เป็นโปรตีนของเขาที่ติดแท็กและบริสุทธิ์โดยคีเลตโลหะตรึงโคสัมพันธ์ที่ใกล้ชิดในลูกปัด Ni-NTA ทั้งนี้ขึ้นอยู่กับโปรตีนองค์ประกอบของบัฟเฟอร์สลายและโปรโตคอลล้างสิ่งสกปรกต่าง ๆ ที่ดูเหมือนจะอยู่ในการเตรียมโปรตีนบริสุทธิ์ ที่นี่เราแสดงให้เห็นว่าการใช้ isopropanol 60% ในช่วงขั้นตอนการซักผ้าเอาออกส่วนใหญ่ของการปนเปื้อนเหล่านี้จากผลิตภัณฑ์ที่สิ้นสุด นอกจากนี้ในการกำจัดของโปรตีนที่ aspecifically เป็นไปตามลูกปัดหรือโปรตีนที่ติดแท็ก, ขั้นตอนนี้เป็นประโยชน์อย่างยิ่งในการลบ endotoxins นอกจากนี้เราแสดงให้เห็นว่าผงซักฟอกเช่น NP-40 ที่มีการจ้างงานในช่วงที่จำเป็นต้องสลายนอกจากนี้ยังเอาออกได้อย่างมีประสิทธิภาพ สุดท้ายเราแสดงให้เห็นว่าโปรตีนสามารถที่จะ Refold อย่างถูกต้องหลังการรักษา isopropanol ดังนั้นผลิตภัณฑ์ที่สิ้นสุดมีผลอย่างมีนัยสำคัญน้อยกว่าการปนเปื้อนเชื้อ E. coli โปรตีน endotoxins และผงซักฟอก

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

กับโปรตีนรีคอมบิแนนท์บริสุทธิ์จากเชื้อ Escherichia coli มีสิ่งเจือปนที่เป็นพิษในทางชีวภาพ . การประยุกต์ใช้วิธีการบำบัดความสัมพันธ์มักจะไม่เพียงพอที่จะเอาองค์ประกอบที่เป็นพิษเหล่านี้ เรานี่อธิบายง่ายและรวดเร็วขั้นตอนหนึ่งขั้นตอนที่เอาสิ่งสกปรกเหล่านี้สูงได้อย่างมีประสิทธิภาพ รีคอมบิแนนท์โปรตีนเป็นสี่กับ E( เป็นแท็กฟิวชั่นโปรตีนบริสุทธิ์โดยตรึงโลหะคีเลตขี้รังแคบนผมและ NTA ลูกปัด ขึ้นอยู่กับโปรตีน องค์ประกอบของการสลายบัฟเฟอร์ และล้างสิ่งสกปรกต่างๆโปรโตคอล ปรากฏอยู่ในโปรตีนที่เตรียมการที่นี่เราแสดงให้เห็นว่าการใช้ 60% ไอโซโพรพานอลในระหว่างขั้นตอนการล้างออกส่วนใหญ่ของสารปนเปื้อนเหล่านี้จากผลิตภัณฑ์ที่สิ้นสุด นอกจากการกำจัดโปรตีนที่ aspecifically ยึดติดกับลูกปัดหรือไปยังแท็กโปรตีน กระบวนการนี้มีประโยชน์โดยเฉพาะอย่างยิ่งในการถือเซลล์ . นอกจากนี้เราพบว่าผงซักฟอกเช่น np-40 ที่ต้องใช้ในการสลาย ,ยังมีภาพลบ สุดท้ายเราแสดงให้เห็นว่าโปรตีนสามารถ refold ไอโซโพรพานอลได้อย่างถูกต้องหลังจากการรักษา ดังนั้น จึงส่งผลให้ผลิตภัณฑ์มีมากน้อยกว่าการปนเปื้อน Escherichia coli โปรตีน สารเอนโดทอกซิน และผงซักฟอก