Shoot organogenesis and plant regen

Shoot organogenesis and plant regeneration in Agave hybrid,No. 11648

Keywords:
Agave hybrid No. 11648
Callus induction
Shoot organogenesis
Plant regeneration

abstract
The effects of explant type and the combination and concentration of plant growth regulators on callusinduction and shoot regeneration in Agave hybrid No. 11648 were examined. Shoot tip and immature leafsegments were cultured on Murashige and Skoog (MS) medium supplied with different concentrationsof benzyladenine (BA), at 0.2–3.0 mg l−1, and -naphthalene acetic acid (NAA), at 0.1–1.0 mg l−1, or 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), at 0.2–2.0 mg l−1for callus induction. The highest rate of light yellow-green, compact and nodular-like calli was formed on the MS medium supplemented with 2.0 mg l−1BA in combination with 0.2 mg l−1NAA, with 93.2% of shoot tips producing a compact, light yellow-green and nodular-like callus. The calli derived from the different explants were subcultured on Schenkand Hildebrandt (SH) medium (300 mg l−1ammonium nitrate, 2267 mg l−1potassium nitrate, 353 mg l−1potassium dihydrogen phosphate, 3 mg l−1glycine, 1.0 mg l−1thiamine hydrochloride (B1), 1.0 mg l−1pyridoxine hydrochloride (B6), 1.0 mg l−1niacin, 200 mg l−1inositol) containing different concentrationsof BA, NAA and indole-3-butyric acid (IBA) for shoot induction. Shoot organogenesis was achieved whenthe callus tissue derived from shoot tips was transferred to SH medium. Maximum organogenesis wasobtained with 5.0 mg l−1BA in combination with 0.1 mg l−1NAA and 0.1 mg l−1IBA, yielding 98.0% shootinduction frequencies. Regenerated shoots were rooted on growth regulator-free MS medium, with anaverage number of 5.39 roots per shoot, and a length of 8.44 cm per root within 30 days, and acclimatizedin a greenhouse, with 98.57 ± 1.43% survival. This is the first report of plant regeneration from Agavehybrid No. 11648 shoot tips.

1. Introduction
Agave hybrid No. 11648 (H.11648) was obtained by Lock (1962)from a cross between Agave angustifolia × Agave amaniensis Treland Nowel and back-crossed with A. amaniensis in Tanzania dur-ing the first half of the 20th century. H.11648 was introduced toChina in 1963 (Xie, 1996) and became the only cultivated speciesfor 50 years, the planting area of H.11648 accounted for more than98% of the total area of sisl (Xiong, 2008) due to the fact that itcontains more fiber per leaf and produces more leaves per year than henequen
(Agave fourcroydes Lem.) and sisal (Agave sisalanaPerr.). Moreover, the leaves of H.11648 lack marginal spines, thus
facilitating harvesting. As a major source of hard fiber and apotential source of certain steroids, animal feed, saponins, pectinsand fertilizer, H.11648 is of considerable economic importance toChina.H.11648 is a semelparous plant, i.e., it dies after flowering;however its reproduction may be sexual, via seeds, or asexual,via offshoots from rhizomes or bulbils from the inflorescence.Because of the long juvenile period (15–20 years), sexual repro-duction through true seeds is usually inconvenient (Robert andHerrera, 1987). Therefore, the resulting absence of genetic variabil-ity has resulted in generation of cloned plants that are vulnerableto the occurrence of new and very destructive pathogens, whichcould result in diseases with great intensity over large geographicareas (Zhao et al., 2007). However, conventional plant breedingtechniques are generally slow, time consuming and may not nec-essarily address these problems. Hence, there is an urgent need toapply non-conventional methods for the improvement of H.11648.Indeed, genetic engineering tools may help to achieve the intro-duction of genetic variability to the crops, and plant regenerationfrom tissues or cultured cells is fundamental to these technologies.

During the last few years, plant tissue culture has emerged asa powerful tool for the effective propagation of agaves throughorganogenesis and embryogenesis from various explants, includ-ing seeds (Santacruz-Ruvalcaba et al., 1999), rhizomes (Das, 1992;Nikam, 1997), stems (Nikam, 1997; Martínez-Palacios et al., 2003;Valenzuela-Sánchez et al., 2006; bulbils (Powers and Backhaus,1989; Nikam et al., 2003), leaves (Das, 1992; Rodríguez-Garay et al.,1996; Nikam, 1997; Hazra et al., 2002), stolons (Binh et al., 1990;Das, 1992), shoot tips and cotyledons (Tejavathi et al., 2007). How-ever, no studies on plant regeneration of H.11648 have previouslybeen reported. The objective of this work was to establish an effi-cient regeneration system in H.11648 by shoot organogenesis forfurther use in genetic transformation protocols and germplasm innovation.

2. Materials and methods

2.1. Plant material
Plantlets were harvested from the laboratory of South Sub-tropical Crops Research Institute, Chinese Academy of TropicalAgriculture Sciences, originated through shoot proliferation fromsuckers (20–30 cm) of H.11648. Most of the leaves of the plantletswere removed, and only a columnar shoot tip (cut into 3–8 mmsegment) and 5–8 mm basal end of immature leaves were used asthe explants.

2.2. Basal medium and culture conditions
Murashige and Skoog (MS) (Murashige and Skoog, 1962) and SH(Gamborg et al., 1968) (300 mg l−1ammonium nitrate, 2267 mg l−1potassium nitrate, 353 mg l−1potassium dihydrogen phosphate,3 mg l−1glycine, 1.0 mg l−1B1, 1.0 mg l−1B6, 1.0 mg l−1niacin,200 mg l−1inositol) basal media containing 0.8% Gelrite (KI01-3A,JingFei) and 30 g l−1sucrose were used for callus formation andadventitious shoots regeneration, respectively. In all of the experi-ments, several plant growth regulator combinations were used. ThepH of the media was adjusted to 5.8 prior to autoclaving at 121◦Cand 1.1 kg cm−2for 20 min. The cultures were incubated at 26 ± 2◦Cwith a 12 h photoperiod under 2000 lux light intensity provided bycool-white fluorescent tubes.

2.3. Callus induction
The shoot tip (3–8 mm) and basal end of immature leaf(5–8 mm) explants from three to four-month-old plantlets werecultured on sterile MS medium (0.8% Gelrite and 30 g l−1sucrose) containing 6-benzyladenine (BA; 0.2–3.0 mg l−1) and2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D; 0.1–2.0 mg l−1) or -naphthalene acetic acid (NAA; 0.1–1 mg l−1) for callus induction. Allcultures were maintained in glass jars (60 mm × 90 mm) containing30 ml medium. Four explants were cultured per jar, and each treat-ment contained twenty explants. Every experiment was repeatedthree times. During the first few weeks, the cultures were incu-bated in the dark until callus was induced. The calli induced fromthe explants were then sub-cultured onto the same medium every 4weeks. Each callus was divided into 4–6 mm diameter pieces duringthe transfer and subcultured up to two to three times.

2.4. Plantregeneration from callus cultures
The calli subcultured on MS medium for 8–12 weeks was usedfor inducing adventitious shoots. Callus pieces (4–6 mm) were firsttransferred to SH medium supplemented with different concen-trations of 6-benzyladenine (BA; 1.0–5.0 mg l−1) in combinationwith -naphthalene acetic acid (NAA; 0.1–1.0 mg l−1) and indole-3-butyric acid (IBA; 0.1–1.0 mg l−1). Based on the first results, threeBA concentrations (2 mg l−1, 3 mg l−1and 5 mg l−1) in combinationwith 0.1 mg l−1NAA and 0.1 mg l−1IBA were tested. Shoot induc-tion was evaluated and expressed as the shooting frequency andnumber of shoots per callus after 8 weeks. Four calli were culturedper jar (containing 30 ml medium), and each treatment contained20 calli. Every experiment was repeated three times.

2.5. Rooting and acclimatization
The shoots generated from SH media containing 3.0 mg l−1BA in combination with 0.1 mg l−1IBA and 0.1 mg l−1NAA wereused for the rooting experiment. Regenerated shoots measur-ing approximately 5–8 cm in length were transferred to rootingmedium, which consisted of MS medium supplemented with dif-ferent concentrations of indole-3-butyric acid (IBA; 0–5 mg l−1) or -naphthalene acetic acid (NAA; 0–5 mg l−1) alone. After 4 weeks,rooting was evaluated and expressed as the rooting frequency, rootnumber and the root length per shoot. Four shoots were culturedper jar (containing 35 ml medium), each treatment contained 20explants, which were maintained in five replicate jars, and eachexperiment was repeated three times. The cultures were incubatedat 26 ± 2◦C with a 12 h photoperiod under 2000 lux light intensityprovided by cool-white fluorescent tubes.The rooted plantlets were transferred to garden soil mixed withsand and soil (1:1) in a shade shelter (approximately 75% shade)under natural conditions (26 ± 3◦C) with a 12 h photoperiod. Thesoil was treated with 1000 mg l−1antracol (PD20050192) one daybefore transfer. The plants with 6–8 pieces of leaves were trans-ferred to the field.

2.6. Statistical analysis
The treatments were arranged in a completely randomizeddesign (CRD) (callus induction and rooting) and an orthogonalexperimental design (plant regeneration). All experiments wererepeated three times, and each treatment contained twentyexplants. The data were subjected to analysis of variance (ANOVA),and a significance comparison among the means was performedusing Duncan’s multiple-range test; a P value of less than 0.05 wasconsidered significant.

3. Results
3.1. Callus induction
Immature leaf cultured on callus induction medium generatedcalli within 2 weeks while 4 weeks was required for the shoottip explants to generate calli (Table 1). Three types of calli wereobserved: type I calli were white and compact (Fig. 1a); type IIcalli were yellowish-green and soft (Fig. 1b); and type III calli wereyellowish-green, compact and nodular-like (Fig. 1c). The type of cal-lus depended on plant growth regulator type and the explant used.The callus derived from immature leaves was white and compact(type I) when 0.2 mg l−12,4-D or 0.2 mg l−1and 0.5 mg l−1NAA wasadded. As these conce

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ยิงเกิดของอวัยวะ และปลูกฟื้นฟูในไฮบริอากาเว่ 11648 หมายเลขคำสำคัญ:อากาเว่ไฮบริ 11648 หมายเลขเหนี่ยวนำให้ยิงเกิดของอวัยวะฟื้นฟูพืชบทคัดย่อThe effects of explant type and the combination and concentration of plant growth regulators on callusinduction and shoot regeneration in Agave hybrid No. 11648 were examined. Shoot tip and immature leafsegments were cultured on Murashige and Skoog (MS) medium supplied with different concentrationsof benzyladenine (BA), at 0.2–3.0 mg l−1, and -naphthalene acetic acid (NAA), at 0.1–1.0 mg l−1, or 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), at 0.2–2.0 mg l−1for callus induction. The highest rate of light yellow-green, compact and nodular-like calli was formed on the MS medium supplemented with 2.0 mg l−1BA in combination with 0.2 mg l−1NAA, with 93.2% of shoot tips producing a compact, light yellow-green and nodular-like callus. The calli derived from the different explants were subcultured on Schenkand Hildebrandt (SH) medium (300 mg l−1ammonium nitrate, 2267 mg l−1potassium nitrate, 353 mg l−1potassium dihydrogen phosphate, 3 mg l−1glycine, 1.0 mg l−1thiamine hydrochloride (B1), 1.0 mg l−1pyridoxine hydrochloride (B6), 1.0 mg l−1niacin, 200 mg l−1inositol) containing different concentrationsof BA, NAA and indole-3-butyric acid (IBA) for shoot induction. Shoot organogenesis was achieved whenthe callus tissue derived from shoot tips was transferred to SH medium. Maximum organogenesis wasobtained with 5.0 mg l−1BA in combination with 0.1 mg l−1NAA and 0.1 mg l−1IBA, yielding 98.0% shootinduction frequencies. Regenerated shoots were rooted on growth regulator-free MS medium, with anaverage number of 5.39 roots per shoot, and a length of 8.44 cm per root within 30 days, and acclimatizedin a greenhouse, with 98.57 ± 1.43% survival. This is the first report of plant regeneration from Agavehybrid No. 11648 shoot tips.1. บทนำอากาเว่ผสมหมายเลข 11648 (H.11648) ได้ โดยล็อค (ค.ศ. 1962) จากการข้ามระหว่างอากาเว่โรซื้ออากาเว่ amaniensis Treland Nowel และ ข้ามกลับ ด้วย amaniensis A. ในแทนซาเนีย dur-ing ครึ่งแรกของศตวรรษ 20 H.11648 นำ toChina ค.ศ. 1963 (เจีย 1996) และกลายเป็น speciesfor ปลูกเพียง 50 ปี พื้นที่ปลูกของ H.11648 บัญชีเพิ่มเติม than98% ของพื้นที่ทั้งหมดของ sisl (หยง 2008) เนื่องจากที่ itcontains ใยเพิ่มเติมต่อใบ และสร้างใบต่อปีมากกว่า henequen(อากาเว่ fourcroydes Lem) และศรนารายณ์ (อากาเว่ sisalanaPerr) นอกจากนี้ ใบไม้ H.11648 ขาดกำไร spines ดังนั้นอำนวยความสะดวกการเก็บเกี่ยว เป็นแหล่งสำคัญของเส้นใยยากและแหล่งบางสเตอรอยด์ อาหารสัตว์ saponins ปุ๋ย pectinsand apotential, H.11648 เป็นจำนวนมากทางเศรษฐกิจสำคัญ toChina.H.11648 เป็นพืช semelparous เช่น จะตายหลังจากดอก อย่างไรก็ตาม การสืบพันธุ์อาจ เพศ ผ่านเมล็ดพืช หรือ asexual, offshoots จากเหง้าหรือ bulbils จาก inflorescence ที่เนื่องจากระยะเวลายาวเยาวชน (15 – 20 ปี), อาคาร duction เพศผ่านเมล็ดจริงคือ มักจะถูกละเลย (โรเบิร์ต andHerrera, 1987) ดังนั้น ขาดผลของพันธุกรรม variabil-ity มีผลในรุ่นพืชโคลนที่ vulnerableto เกิดโรคใหม่ และทำลายมาก ผล whichcould โรค มีเข้มข้นมากผ่าน geographicareas ขนาดใหญ่ (เจียว et al., 2007) อย่างไรก็ตาม breedingtechniques พืชทั่วไปจะใช้เวลานาน ช้าโดยทั่วไป และอาจไม่ nec essarily ปัญหาเหล่านี้ ดังนั้น toapply ด่วนมีวิธีไม่ธรรมดาเพื่อพัฒนา H.11648.Indeed พันธุวิศวกรรมเครื่องมืออาจช่วยให้บทนำ-duction ความแปรผันทางพันธุกรรมการปลูก และพืช regenerationfrom เนื้อเยื่อหรือเซลล์อ่างเป็นรากฐานของเทคโนโลยีเหล่านี้ในช่วงไม่กี่ปีสุดท้าย เนื้อเยื่อพืชมีชุมนุม asa มือที่มีประสิทธิภาพสำหรับการเผยแพร่ผลของ agaves throughorganogenesis และการเกิดเอ็มบริโอจาก explants ต่าง ๆ เมล็ดกำลังรวม (Santacruz Ruvalcaba et al., 1999), เหง้า (Das, 1992Nikam, 1997), ลำต้น (Nikam, 1997 Martínez Palacios et al., 2003Al. ร้อยเอ็ด Sánchez Valenzuela, 2006 bulbils (อำนาจและ Backhaus, 1989 Nikam และ al., 2003), ใบ (Das, 1992 Rodríguez Garay et al., 1996 Nikam, 1997 Hazra et al., 2002), ยิง stolons (Binh และ al., 1990; Das, 1992), เคล็ดลับและ cotyledons (Tejavathi et al., 2007) วิธีเคย ไม่มีการศึกษาการฟื้นฟูโรงงานของ H.11648 มีรายงาน previouslybeen วัตถุประสงค์ของงานนี้คือการ สร้างระบบการฟื้นฟู effi cient ใน H.11648 โดยใช้ forfurther การเกิดของอวัยวะยิงในนวัตกรรม germplasm และโปรโตคอลการแปลงพันธุกรรม2. วัสดุและวิธีการ2.1. พืชวัสดุPlantlets ถูกเก็บเกี่ยวจากห้องปฏิบัติการของ สถาบันวิจัยพืชใต้เขตร้อนย่อย จีนสถาบัน TropicalAgriculture ศาสตร์ ต้นกำเนิดผ่านยิงขยาย fromsuckers (20 – 30 เซนติเมตร) ของ H.11648 ส่วนใหญ่ของ plantletswere เอา ใบไม้ และเฉพาะแนะนำยิงเรียงเป็นแนวตั้ง (ตัดเป็น mmsegment 3-8) และ 5 – 8 มิลลิเมตรปลายโรคใบไม้ immature ถูกใช้เป็น explants2.2. โรคสภาพปานกลางและวัฒนธรรมMurashige และ Skoog (MS) (Murashige และ Skoog, 1962) และดี (Gamborg et al., 1968) (300 mg l−1ammonium ไนเตรต ไนเตรต l−1potassium 2267 มิลลิกรัม 353 mg l−1potassium ไดไฮโดรเจนฟอสเฟต l−1glycine 3 มิลลิกรัม l−1B1 1.0 มิลลิกรัม l−1B6 1.0 มิลลิกรัม l−1niacin 1.0 มิลลิกรัม l−1inositol 200 mg) สื่อโรคประกอบด้วย 0.8% Gelrite (KI01 3A, JingFei) และ 30 g l−1sucrose ใช้สำหรับฟื้นฟูให้กำเนิด andadventitious ถ่ายภาพตามลำดับ ในทั้งหมด experi ments มีใช้ชุดควบคุมการเจริญเติบโตพืชหลาย ThepH สื่อถูกปรับ 5.8 ก่อน autoclaving ที่ cm−2for 121◦Cand 1.1 กิโลกรัม 20 นาที วัฒนธรรมถูก incubated ที่ 26 ± 2◦Cwith ชั่วโมง h 12 ต่ำกว่า 2000 ลักซ์ความเข้มแสงให้หลอดเรืองแสงขาว bycool2.3. ให้เหนี่ยวนำแนะนำยิง (3 – 8 mm) และโรคสิ้น explants ใบ immature (5 – 8 มิลลิเมตร) ที่ 3 อายุ 4 เดือน plantlets werecultured บนกอซ MS ปานกลาง (0.8% Gelrite และ 30 g l−1sucrose) ประกอบด้วย 6 benzyladenine (BA; 0.2-3.0 มิลลิกรัม l−1) and2 กรด 4-dichlorophenoxyacetic (2, 4-D; 0.1-2.0 l−1 มิลลิกรัม) หรือ - แนฟทาลีนกรดอะซิติก (NAA; 0.1 – 1 mg l−1) การเหนี่ยวนำให้ Allcultures ถูกจัดเก็บอยู่ในสื่อมลแก้วขวด (60 มม. × 90 mm) containing30 Explants สี่มีอ่างต่อขวด และแต่ละปฏิบัติติดขัดอยู่ explants ยี่สิบ การทดลองทุกครั้ง repeatedthree ได้ ในช่วงสองสามสัปดาห์แรก วัฒนธรรมได้ bated incu ในมืดจนกว่าจะมีเกิดแคลลัส Calli เกิดจาก explants ถูกแล้วย่อย cultured บนสื่อเดียวทุก 4 อาทิตย์ ให้แต่ละถูกแบ่งออกเป็น 4 – 6 มม.เส้นผ่าศูนย์กลางชิ้น duringthe โอน และ subcultured ขึ้นไปสองถึงสามครั้ง2.4. Plantregeneration จากวัฒนธรรมให้Calli subcultured บน MS กลาง 8 – 12 สัปดาห์ถูก usedfor inducing adventitious หน่อ Firsttransferred ปานกลางดีเสริม ด้วย concen trations แตกต่างกันของ 6-benzyladenine (BA; l−1 1.0-5.0 มิลลิกรัม) ใน combinationwith ชิ้นส่วนแคลลัส (4 – 6 มิลลิเมตร) -กรดแนฟทาลีนอะซิติก (NAA; 0.1 – 1.0 mg l−1) และกรดอินโดล-3-butyric (อิบา 0.1 – 1.0 mg l−1) ตามผลลัพธ์แรก threeBA ความเข้มข้น (2 mg l−1, l−1 3 mg l−1and 5 mg) ใน combinationwith มิลลิกรัม 0.1 0.1 มิลลิกรัมและ l−1NAA l−1IBA ถูกทดสอบ ยิง induc สเตรชันประเมิน และแสดงเป็น andnumber ความถี่ในการถ่ายภาพของถ่ายภาพต่อให้หลังจาก 8 สัปดาห์ Calli สี่ได้ (ประกอบด้วยปานกลาง 30 ml) ขวด culturedper และแต่ละ calli contained20 รักษา ทุกการทดลองถูกซ้ำสามครั้ง2.5. rooting acclimatization และถ่ายภาพสร้างขึ้นจากสื่อดีประกอบด้วย l−1BA 3.0 มิลลิกรัมร่วมกับ 0.1 mg l−1IBA wereused l−1NAA 0.1 มิลลิกรัมสำหรับทดลอง rooting สร้างยอด measur-ing ประมาณ 5 – 8 ซม.ความยาวถูกโอนย้ายไป rootingmedium ซึ่งประกอบด้วยสื่อ MS เสริมกับ dif ferent ความเข้มข้นของกรดอินโดล-3-butyric (อิบา 0 – 5 l−1 มิลลิกรัม) หรือ - แนฟทาลีนกรดอะซิติก (NAA; 0 – 5 mg l−1) เพียงอย่างเดียว หลังจาก 4 สัปดาห์ rooting ประเมิน และแสดงความถี่ rooting, rootnumber และความยาวรากต่อยิง 4 ถ่ายภาพได้ culturedper ขวด (มี 35 ml กลาง แต่ละ 20explants ประกอบด้วยการรักษา ซึ่งถูกเก็บรักษาในขวด 5 replicate และ eachexperiment ไม่ซ้ำกันสามครั้ง วัฒนธรรม 2◦C ± incubatedat 26 มีช่วงแสง 12 h เป็นภายใต้ intensityprovided แสง 2000 ลักซ์โดยหลอดเรืองแสงสีขาวเย็นได้Rooted plantlets ได้โอนย้ายไปสวนดินผสมดิน (1:1) ในที่ร่มกำบัง (ประมาณ 75% เงา) ภายใต้เงื่อนไขธรรมชาติ (26 ± 3◦C) และ withsand กับมีช่วงแสง 12 h Thesoil ได้รับ 1000 มิลลิกรัม l−1antracol โอน daybefore หนึ่ง (PD20050192) พืช มี 6-8 ชิ้นของใบ ferred ธุรกรรมในฟิลด์ได้2.6. สถิติวิเคราะห์การรักษาถูกจัดเป็นสมบูรณ์ randomizeddesign (CRD) (การเหนี่ยวนำแคลลัสและ rooting) และแบบ orthogonalexperimental (พืชฟื้นฟู) Wererepeated ทดลองทั้งหมดสามครั้ง และแต่ละทรีทเม้นต์อยู่ twentyexplants ข้อมูลถูกต้องวิเคราะห์ผลต่างของ (การวิเคราะห์ความแปรปรวน), และการเปรียบเทียบความสำคัญระหว่างวิธีถูก performedusing ดันแคนหลายช่วงทดสอบ ค่า P น้อยกว่า 0.05 wasconsidered ที่สำคัญ3. ผลลัพธ์3.1. ให้เหนี่ยวนำExplants ใบ immature อ่างในแคลลัสเหนี่ยวนำขนาดกลาง generatedcalli ภายใน 2 สัปดาห์ในขณะที่สัปดาห์ที่ 4 ที่ถูกต้องสำหรับการ shoottip สร้าง calli (ตาราง 1) Calli wereobserved สามชนิด: ชนิดฉัน calli มีสีขาวและมีขนาดกะทัดรัด (Fig. 1a); ชนิด IIcalli มีสีเขียวเหลืองและนุ่ม (Fig. 1b); พิมพ์ III calli wereyellowish เขียว ขนาดกะทัดรัด และ nodular เหมือน (Fig. 1 c) ชนิดของ cal lus ขึ้นอยู่กับชนิดการควบคุมการเจริญเติบโตพืชและ explant ที่ใช้แคลลัสที่ได้จากใบไม้ immature ถูกขาวและ compact(type I) เมื่อ 0.2 มิลลิกรัม l−12, 4-D หรือ 0.2 มิลลิกรัม l−1and 0.5 mg l−1NAA wasadded เป็น conce เหล่านี้

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ยิงอวัยวะและการฟื้นฟูพืชในไฮบริด Agave ไม่มี 11648 คำสำคัญ: Agave ไฮบริดที่ 11,648 แคลลัสเหนี่ยวนำยิงอวัยวะฟื้นฟูโรงงานนามธรรมผลกระทบของชนิดชิ้นส่วนและการรวมกันและความเข้มข้นของการเจริญเติบโตของพืชใน callusinduction และการฟื้นฟูถ่ายภาพในไฮบริด Agave ฉบับที่ 11648 ถูกตรวจสอบ ปลายยิงและ leafsegments อ่อนมาเพาะเลี้ยงในอาหารสูตร Murashige และ Skoog (MS) ที่ให้มาขนาดกลางที่มี benzyladenine concentrationsof แตกต่างกัน (BA) ที่ 0.2-3.0 มิลลิกรัมต่อลิตร-1, และกรดอะซิติก -naphthalene (NAA) ที่ 0.1-1.0 มิลลิกรัมต่อลิตร-1 หรือกรด 2,4-dichlorophenoxyacetic (2,4-D) ที่ 0.2-2.0 มิลลิกรัมต่อลิตร 1for เหนี่ยวนำแคลลัส อัตราสูงสุดของแสงสีเหลืองสีเขียวขนาดกะทัดรัดและแคลลัสเป็นก้อนกลมเหมือนถูกสร้างขึ้นในสื่อ MS ที่เติม 2.0 มิลลิกรัมต่อลิตร 1BA ร่วมกับ 0.2 มิลลิกรัมต่อลิตร 1NAA กับ 93.2% ของเคล็ดลับการถ่ายภาพการผลิตขนาดกะทัดรัดสีเหลืองแสง สีเขียวและเป็นก้อนกลมเหมือนแคลลัส แคลลัสที่ได้มาจากชิ้นส่วนที่แตกต่างกันได้รับเชื้อใน Schenkand Hildebrandt (SH) กลาง (300 มไนเตรต L-1ammonium, 2267 มิลลิกรัมไนเตรต L-1potassium, 353 มิลลิกรัมต่อลิตร 1potassium ไดไฮโดรเจนฟอสเฟต 3 มิลลิกรัมต่อลิตร 1glycine 1.0 มิลลิกรัมต่อลิตร 1thiamine ไฮโดรคลอไร (B1) 1.0 มิลลิกรัมต่อลิตร 1pyridoxine ไฮโดรคลอไร (B6) 1.0 มิลลิกรัมต่อลิตร 1niacin 200 มิลลิกรัมต่อลิตร 1inositol) ที่มี BA concentrationsof ที่แตกต่างกัน, NAA และ indole-3-butyric กรด (IBA) สำหรับการเหนี่ยวนำการถ่ายภาพ ยิงอวัยวะก็ประสบความสำเร็จ whenthe เนื้อเยื่อแคลลัสที่ได้มาจากปลายยอดถูกย้ายไปอยู่กลาง SH อวัยวะสูงสุด wasobtained กับ 5.0 มิลลิกรัมต่อลิตร 1BA ร่วมกับ 0.1 มิลลิกรัมต่อลิตร 1NAA และ 0.1 มิลลิกรัมต่อลิตร 1IBA ยอม 98.0% ความถี่ shootinduction หน่อสร้างใหม่มีรากบนอาหารสูตร MS ควบคุมการเจริญเติบโตของฟรีมีจำนวน anaverage 5.39 รากต่อการถ่ายและความยาวของ 8.44 เซนติเมตรต่อรากภายใน 30 วันและ acclimatizedin เรือนกระจกกับ 98.57 ± 1.43% อยู่รอด รายงานนี้เป็นรายงานแรกของการฟื้นฟูพืชจาก Agavehybrid ฉบับที่ 11648 เคล็ดลับการถ่าย. 1 บทนำAgave ไฮบริดที่ 11648 (H.11648) ได้โดยล็อค (1962) จากการผสมผสานกันระหว่าง Agave angustifolia × Agave amaniensis Treland Nowel และกลับข้ามกับ amaniensis A. ในแทนซาเนียเธไอเอ็นจีในช่วงครึ่งแรกของศตวรรษที่ 20 H.11648 ถูกนำ toChina ในปี 1963 (Xie, 1996) และกลายเป็นเพียงการปลูกฝัง speciesfor 50 ปีพื้นที่ปลูก H.11648 คิดเป็น than98% ของพื้นที่ทั้งหมดของ SISL (Xiong, 2008) เนื่องจากความจริงที่ว่า itcontains เส้นใยมากขึ้นต่อใบและผลิตใบต่อปีมากกว่า Henequen (Agave fourcroydes Lem.) และป่านศรนารายณ์ (Agave sisalanaPerr.) นอกจากนี้ใบของ H.11648 ขาดหนามเล็กน้อยจึงอำนวยความสะดวกในการเก็บเกี่ยว ในฐานะที่เป็นแหล่งสำคัญของเส้นใยหนักและแหล่งที่มาของเตียรอยด์บาง apotential, อาหารสัตว์, saponins, pectinsand ปุ๋ย H.11648 มีความสำคัญทางเศรษฐกิจมาก toChina.H.11648 เป็นพืช semelparous คือมันตายหลังดอกบานอย่างไรก็ตามการสืบพันธุ์ของมัน อาจจะเป็นทางเพศผ่านทางเมล็ดหรือกะเทยผ่านหน่อจากเหง้าหรือ bulbils จาก inflorescence.Because ของระยะเวลานานของเด็กและเยาวชน (15-20 ปี) Repro-duction ผ่านเมล็ดจริงทางเพศมักจะไม่สะดวก (โรเบิร์ andHerrera, 1987) ดังนั้นการขาดที่เกิดจากพันธุกรรม variabil-ity มีผลในการผลิตของพืชโคลนที่มี vulnerableto การเกิดขึ้นของเชื้อโรคใหม่ ๆ และการทำลายล้างมาก whichcould ส่งผลให้เกิดโรคที่มีความรุนแรงดีกว่า geographicareas ขนาดใหญ่ (Zhao et al., 2007) อย่างไรก็ตาม breedingtechniques พืชทั่วไปจะช้าโดยทั่วไปใช้เวลานานและอาจไม่ nec-essarily แก้ไขปัญหาเหล่านี้ จึงมีความจำเป็นเร่งด่วน toapply วิธีไม่ธรรมดาสำหรับการปรับปรุงของ H.11648.Indeed เครื่องมือพันธุวิศวกรรมอาจช่วยให้บรรลุ duction-บทนำของความแปรปรวนทางพันธุกรรมให้กับพืชและเนื้อเยื่อ regenerationfrom พืชหรือเซลล์เพาะเลี้ยงเป็นพื้นฐานของการ เทคโนโลยีเหล่านี้. ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมาเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชได้เกิดเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพ asa สำหรับการขยายพันธุ์ที่มีประสิทธิภาพของ Agaves throughorganogenesis และเอมบริจากชิ้นส่วนต่างๆเมล็ด includ ไอเอ็นจี (Santacruz-Ruvalcaba et al., 1999), เหง้า (ดา 1992 ; Nikam, 1997) ลำต้น (Nikam 1997; Martínez-Palacios et al, 2003;.. เอลลา-Sánchez et al, 2006; bulbils (พลังและ Backhaus 1989;. Nikam et al, 2003), ใบ (ดา 1992; Rodríguez-Garay, et al, 1996;. Nikam,. 1997; Hazra, et al, 2002), stolons (Binh, et ​​al, 1990;.. ดา, 1992), ยิงเคล็ดลับและใบเลี้ยง (Tejavathi et al, 2007) วิธีที่เคยศึกษาไม่เกี่ยวกับการฟื้นฟูโรงงาน H.11648 ได้ previouslybeen รายงาน. วัตถุประสงค์ของงานนี้คือการสร้างระบบการฟื้นฟู Effi-เพียงพอใน H.11648 โดยถ่ายอวัยวะใช้ forfurther ในโปรโตคอลการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมและนวัตกรรมเชื้อพันธุกรรม. 2 วัสดุและวิธีการ2.1 วัสดุปลูกต้นกล้าที่ได้จากการเก็บเกี่ยวในห้องปฏิบัติการของภาคใต้ของพืชเขตร้อนอนุกรรมการสถาบันวิจัยจีน Academy of Sciences TropicalAgriculture กำเนิดผ่านการงอกยิง fromsuckers (20-30 เซนติเมตร) H.11648 ส่วนใหญ่ของใบของ plantletswere ออกและเพียงปลายยอดเสา (หั่นเป็น 3-8 mmsegment) และ 5-8 มมปลายฐานของใบอ่อนถูกนำมาใช้ asthe ชิ้น. 2.2 สื่อพื้นฐานและวัฒนธรรมเงื่อนไขอาหารสูตร Murashige และ Skoog (MS) (อาหารสูตร Murashige และ Skoog, 1962) และ SH (Gamborg et al., 1968) (300 มไนเตรต L-1ammonium, 2267 มิลลิกรัมไนเตรต L-1potassium, 353 มิลลิกรัมต่อลิตร 1potassium ไดไฮโดรเจนฟอสเฟต 3 มิลลิกรัมต่อลิตร 1glycine 1.0 มิลลิกรัมต่อลิตร-1B1, 1.0 มิลลิกรัมต่อลิตร-1B6, 1.0 มิลลิกรัมต่อลิตร 1niacin 200 มิลลิกรัมต่อลิตร 1inositol) สื่อพื้นฐานที่มี 0.8% Gelrite (KI01-3A, JingFei) และ 30 GL-1sucrose อยู่ ที่ใช้สำหรับการสร้างแคลลัส andadventitious ยิงฟื้นฟูตามลำดับ ในทุกประสบ-ments, เจริญเติบโตของพืชหลายชุดที่ควบคุมการถูกนำมาใช้ ThepH ของสื่อที่มีการปรับเป็น 5.8 ก่อนที่จะนึ่งฆ่าเชื้อที่121◦Cand 1.1 กิโลกรัมเซนติเมตร 2for 20 นาที วัฒนธรรมที่ได้รับการบ่มที่อุณหภูมิ 26 ±2◦Cwithแสง 12 ชั่วโมงภายใต้ 2,000 ลักซ์ความเข้มของแสงให้เรืองแสง bycool ขาวหลอด. 2.3 แคลลัสเหนี่ยวนำปลายยอด (3-8 มิลลิเมตร) และสิ้นสุดฐานของใบที่ยังไม่บรรลุนิติภาวะ (5-8 มิลลิเมตร) ชิ้นส่วนจากสามถึงสี่ต้นเดือนเก่า werecultured บนอาหารสูตร MS หมัน (0.8% Gelrite และ 30 GL-1sucrose) ที่มี 6 -benzyladenine (BA; 0.2-3.0 มิลลิกรัม L-1) and2,4-dichlorophenoxyacetic กรด (2,4-D; 0.1-2.0 มิลลิกรัม L-1) หรือกรดอะซิติก -naphthalene (NAA; 0.1-1 มิลลิกรัม L-1) การชักนำแคลลัส Allcultures ถูกเก็บรักษาไว้ในขวดแก้ว (60 มิลลิเมตร× 90 มิลลิเมตร) containing30 มลกลาง สี่ชิ้นถูกเลี้ยงต่อขวดและแต่ละรักษา-ment มียี่สิบชิ้น ทุกการทดลองครั้ง repeatedthree ในช่วงสองสามสัปดาห์แรกวัฒนธรรมเป็น incu-ซึ้งน้อยลงในที่มืดจนถูกชักนำแคลลัส แคลลัสชักนำ fromthe ชิ้นได้แล้วย่อยที่เพาะเลี้ยงบนกลางเหมือนกันทุก 4 อาทิตย์ แคลลัสแต่ละคนได้แบ่งออกเป็น 4-6 มิลลิเมตรเส้นผ่าศูนย์กลางชิ้นระหว่างการถ่ายโอนและเชื้อได้ถึง 2-3 ครั้ง. 2.4 Plantregeneration จากวัฒนธรรมแคลลัสแคลลัสเชื้อบนอาหารสูตร MS 8-12 สัปดาห์ที่ได้รับการกระตุ้นให้เกิดการ usedfor หน่อบังเอิญ ชิ้นแคลลัส (4-6 มิลลิเมตร) ถูก firsttransferred เพื่อ SH เสริมกลางที่มีแตกต่างกันมุ่งเน้นให้ trations-6-benzyladenine (BA; 1.0-5.0 มิลลิกรัมต่อลิตร-1) ในกรดอะซิติก combinationwith -naphthalene (NAA; 0.1-1.0 มิลลิกรัมต่อลิตร-1 ) และ indole-3-butyric กรด (IBA; 0.1-1.0 มิลลิกรัม L-1) ขึ้นอยู่กับผลครั้งแรกความเข้มข้น threeBA (2 มิลลิกรัมต่อลิตร-1, 3 มิลลิกรัม L-1 และ 5 มิลลิกรัมต่อลิตร-1) ใน combinationwith 0.1 มิลลิกรัมต่อลิตร 1NAA และ 0.1 มิลลิกรัมต่อลิตร 1IBA ถูกทดสอบ ยิง INDUC-การได้รับการประเมินและแสดงเป็นความถี่ยิง andnumber ของหน่อต่อแคลลัสหลังจาก 8 สัปดาห์ สี่แคลลัสมีโถ culturedper (ที่มีขนาด 30 ml ขนาดกลาง) และแต่ละรักษา contained20 แคลลัส ทุกการทดลองซ้ำสามครั้ง. 2.5 รากและเคยชินกับสภาพหน่อที่เกิดจากสื่อ SH ที่มี 3.0 มิลลิกรัมต่อลิตร 1BA ร่วมกับ 0.1 มิลลิกรัมต่อลิตร 1IBA และ 0.1 มิลลิกรัมต่อลิตร 1NAA wereused สำหรับการทดลองราก หน่ออาศัยมาตรการไอเอ็นจีประมาณ 5-8 เซนติเมตรยาวถูกย้ายไป rootingmedium ซึ่งประกอบด้วย MS กลางเสริมด้วยความเข้มข้น dif-แตกของ indole-3-butyric กรด (IBA; 0-5 มิลลิกรัม L-1) หรืออะซิติก -naphthalene กรด (NAA; 0-5 มิลลิกรัม L-1) เพียงอย่างเดียว หลังจาก 4 สัปดาห์รากได้รับการประเมินและแสดงเป็นความถี่ราก, rootnumber และความยาวรากต่อการถ่ายภาพ สี่หน่อเป็น culturedper ขวด (ที่มี 35 มล. ขนาดกลาง), การรักษาแต่ละที่มี 20explants ซึ่งถูกเก็บรักษาไว้ในห้าขวดซ้ำและ eachexperiment ซ้ำสามครั้ง วัฒนธรรมเป็น incubatedat 26 ±2◦Cกับแสง 12 ชั่วโมงภายใต้ 2,000 ลักซ์แสง intensityprovided โดย tubes.The เรืองแสงเย็นสีขาวต้นรากถูกโอนไปยังสวนดินผสม withsand และดิน (1: 1) ในที่กำบังร่มเงา (ประมาณ 75 ร่มเงา%) ภายใต้สภาพธรรมชาติ (26 ±3◦C) กับช่วงแสง 12 ชั่วโมง Thesoil ได้รับการรักษาด้วย 1000 mg L-1antracol (PD20050192) หนึ่งวันก่อนการถ่ายโอน พืชที่มี 6-8 ชิ้นส่วนของใบที่ถูกทรานส์ ferred ไปที่สนาม. 2.6 การวิเคราะห์สถิติการรักษาที่ถูกจัดให้อยู่ใน randomizeddesign สมบูรณ์ (CRD) (เหนี่ยวนำแคลลัสและราก) และการออกแบบ orthogonalexperimental (การฟื้นฟูโรงงาน) การทดสอบทั้งหมด wererepeated สามครั้งและการรักษาแต่ละที่มี twentyexplants ข้อมูลที่ถูกยัดเยียดให้การวิเคราะห์ความแปรปรวน (ANOVA) และเปรียบเทียบอย่างมีนัยสำคัญในหมู่วิธีที่ถูก performedusing ดันแคนทดสอบหลายช่วง; ค่า P น้อยกว่า 0.05 wasconsidered อย่างมีนัยสำคัญ. 3 ผล3.1 แคลลัสเหนี่ยวนำใบอ่อนเลี้ยงชักนำแคลลัส generatedcalli กลางภายใน 2 สัปดาห์ในขณะที่ 4 สัปดาห์ที่จำเป็นสำหรับ shoottip ชิ้นส่วนในการสร้างแคลลัส (ตารางที่ 1) สามประเภทของแคลลัส wereobserved: ชนิดของแคลลัสที่ผมเป็นสีขาวและมีขนาดกะทัดรัด (รูปที่ 1a.); พิมพ์ IIcalli เป็นสีเหลืองสีเขียวและอ่อนนุ่ม (รูปที่ 1 ข.); และประเภทที่สามแคลลัส wereyellowish สีเขียวขนาดกะทัดรัดและเป็นก้อนกลมเหมือน (รูป. 1c) ประเภทของ Cal-Lus ขึ้นอยู่กับชนิดของสารควบคุมการเจริญเติบโตของพืชและแคลลัส used.The ชิ้นที่ได้มาจากใบอ่อนเป็นสีขาวและมีขนาดกะทัดรัด (ชนิด I) เมื่อ 0.2 มิลลิกรัมต่อลิตร 12.4-D หรือ 0.2 มิลลิกรัมต่อลิตร-1 และ 0.5 มิลลิกรัมต่อลิตร -1NAA wasadded ในฐานะที่เป็นคอนเสิร์ตเหล่านี้

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ยิงแกโนเจเนซีสและการฟื้นฟูโรงงานในต้นลูกผสม ไม่ 11648

คำสำคัญ :
ต้นลูกผสมไม่ 11648


แกโนเจเนซีสลัสเหนี่ยวยิงต้นใหม่

นามธรรม
ผลของต่อชนิดและการใช้สารควบคุมการเจริญเติบโตของพืช callusinduction และยิงใหม่ในต้นลูกผสมไม่ 11648 ตรวจร่างกายยอดอ่อนและ leafsegments เพาะเลี้ยงบนอาหารสูตร Murashige และ Skoog ( MS ) ซึ่งมาพร้อมกับแตกต่างกันโดย benzyladenine ( BA ) 0.2 – 3.0 mg L − 1 และ - acetic acid ( NAA ) แนพทาลีน ที่ 0.1 – 1.0 mg L − 1 หรือครู ( 2 ) 0.2 – 2.0 มิลลิกรัมต่อลิตร −เนื่องจาก callus induction อัตราสูงสุดของแสงสีเขียวขนาดกะทัดรัดและเป็นเช่นแคลลัสที่ก่อตั้งขึ้นบนอาหารสูตร MS ที่มี 2.0 มิลลิกรัมต่อลิตร 1ba − 0.2 มิลลิกรัมต่อลิตร ร่วมกับ บริษัท เวสเทิร์น 1naa กับห้องปฏิบัติการของยิงเคล็ดลับการผลิตขนาดเล็ก สีเหลืองอ่อน และสีเขียวกลม เช่น แคลลัส ระดับที่ได้จากเนื้อเยื่อที่ต่างกัน subcultured บน schenkand ฮิลดีเบรินต์ ( SH ) ขนาดกลาง ( 300 mg L − 1ammonium ที่สุด mg L − 1potassium ไนเตรต ไนเตรท353 mg L − 1potassium dihydrogen ฟอสเฟต 3 mg L − 1glycine 1.0 mg L − 1thiamine ไฮโดรคลอไรด์ ( B1 ) , 1.0 mg L − 1pyridoxine ไฮโดรคลอไรด์ ( B6 ) , 1.0 mg / L −− 1niacin 200 มิลลิกรัม 1inositol ) ที่มี NAA และ BA ที่แตกต่างกันโดย , Increase ( IBA ) สำหรับการยิง ยิงแกโนเจเนซีสสําเร็จ เมื่อเนื้อเยื่อแคลลัสที่ได้จากปลายยอดโอนกลาง SH .แกโนเจเนซีส 5.0 มิลลิกรัมต่อลิตรสูงสุดโดย บริษัท เวสเทิร์น 1ba ร่วมกับ 0.1 mg / L −− 1naa และ 0.1 มก. 1iba 98.0 % , ความถี่ shootinduction ยวบยาบ ได้เกิดรากบนอาหารสูตร MS ที่มีการควบคุมฟรี , จำนวนเฉลี่ย จำนวนรากต่อต้น และความยาวของ 8.44 ซม. ต่อรากภายใน 30 วัน และ acclimatizedin เรือนกระจก ด้วย 98.57 ± 1.43 % การอยู่รอดนี่คือรายงานแรกของต้นใหม่จากเคล็ดลับยิงไม่ 11648 agavehybrid

1 บทนำ
ต้นลูกผสมไม่ 11648 ( h.11648 ) โดยนำล็อค ( 1962 ) จากข้ามระหว่างต้น 5 ×ต้น amaniensis treland nowel และกลับข้ามกับ . amaniensis ในแทนซาเนียผ่านช่วงครึ่งแรกของศตวรรษที่ 20 h.11648 แนะนำ tochina ในปี 1963 ( เซี่ย1996 ) และกลายเป็นเพียงปลูก speciesfor 50 ปี พื้นที่ปลูก h.11648 คิดเป็น % than98 มากขึ้นของพื้นที่ทั้งหมดของ sisl ( เซี่ยง , 2551 ) เนื่องจากลับมากกว่าเส้นใยต่อใบ และผลิตมากขึ้นกว่าใบต่อปี henequen
( ต้น fourcroydes LEM ) และป่านศรนารายณ์ ( ต้น sisalanaperr ) . นอกจากนี้ใบของ h.11648 ขาดขอบหนามจึง
เอื้อต่อการเก็บเกี่ยวในฐานะที่เป็นแหล่งของเส้นใยแข็งและแหล่งศักยภาพบางโค อาหารสัตว์ ปุ๋ย pectinsand h.11648 saponins , , เป็น tochina.h.11648 ความสำคัญทางเศรษฐกิจมากเป็น semelparous พืช เช่น ตายหลังดอก แต่อาจจะมีของการสืบพันธุ์ทางเพศผ่านทางเมล็ด หรือ ไม่มีเพศ ผ่าน offshoots จากเหง้าหรือ bulbils จากช่อดอกเพราะช่วงวัยรุ่นยาว ( 15 – 20 ปี ) , ทางเพศ repro duction ผ่านเมล็ดจริงมักจะไม่สะดวก ( โรเบิร์ต andherrera , 1987 ) ดังนั้น ส่งผลให้ขาด variabil ity พันธุกรรมมีผลในรุ่นของโคลนพืชที่ vulnerableto เกิดใหม่และอันตรายมากเชื้อโรค ,สามารถส่งผลให้โรคมีความรุนแรงที่ดีกว่า geographicareas ขนาดใหญ่ ( จ้าว et al . , 2007 ) อย่างไรก็ตาม breedingtechniques พืชปกติทั่วไปจะช้า เสียเวลา และอาจไม่ช่วย essarily ที่อยู่ปัญหาเหล่านี้ จึงมีความจําเป็นเร่งด่วน toapply ไม่ใช่วิธีปกติสำหรับการปรับปรุง h.11648.indeed ,เครื่องมือวิศวกรรมทางพันธุกรรมอาจช่วยให้บรรลุ Intro duction ของการผันแปรทางพันธุกรรมกับพืช และพืชเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อหรือเซลล์ regenerationfrom เป็นพื้นฐานของเทคโนโลยีเหล่านี้

ช่วงไม่กี่ปีสุดท้าย , การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชได้กลายเป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพสำหรับการอาสาที่มี throughorganogenesis Agaves เพาะจากเนื้อเยื่อต่าง ๆเมล็ดไอเอ็นจี includ ( ซางตาครู้ส ruvalcaba et al . , 1999 ) , เหง้า ( Das , 1992 ; nikam , 1997 ) , ก้าน ( nikam , 1997 ; มาร์ตีเนซ Palacios et al . , 2003 ; valenzuela-s . kgm nchez et al . , 2006 ; bulbils ( อำนาจและ backhaus , 1989 ; nikam et al . , 2003 ) ใบ ( Das , 1992 ; ลุยส์โรดรีเกซ มาร์ติน กาเรย์ et al . , 1996 ; nikam , 1997 ; hazra et al . , 2002 ) , stolons ( Binh et al . , 1990 ; DAS , 1992 ) , ยิงเคล็ดลับและการแสดงออก ( tejavathi et al . ,2007 ) แล้วที่เคย ไม่มีการศึกษาในพืชการ h.11648 มี previouslybeen รายงาน วัตถุประสงค์ของงานนี้คือการสร้างระบบในการ effi cient h.11648 โดยยิงแกโนเจเนซีสอมาใช้ในโพรโทคอลการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมและนวัตกรรมกรรม

2 วัสดุและวิธีการ

2.1 .
วัสดุพืชต้นเป็น harvested จากห้องปฏิบัติการของสถาบันวิจัยพืชเขตร้อนย่อยใต้ , จีน Academy of tropicalagriculture วิทยาศาสตร์ มาผ่านการยิง fromsuckers ( 20 – 30 ซม. ) ของ h.11648 . ที่สุดของใบของ plantletswere ออก เพียงมียอด ( ตัดเป็น 3 – 8 mmsegment ) และ 5 – 8 มม. ปลายใบฐานอ่อนใช้เป็นอาหาร

2.2 .พื้นฐานวัฒนธรรมอาหารขนาดกลางและเงื่อนไข
and Skoog ( MS ) ( อาหารสูตร Murashige and Skoog , 1962 ) และ SH ( Gamborg et al . , 1968 ) ( 300 mg L − 1ammonium ไนเตรต ที่สุดมก. L − 1potassium ไนเตรต , 353 mg L − 1potassium dihydrogen ฟอสเฟต 3 mg L −− 1b1 1glycine 1.0 mg L , 1.0 mg / L −− 1b6 1.0 มิลลิกรัม 1niacin 200 มิลลิกรัม L − 1inositol ) สื่อพื้นฐานที่ร้อยละ 0.8 ( ki01-3a gelrite ,jingfei ) และ 30 กรัมต่อลิตร บริษัท เวสเทิร์น 1sucrose นำมาแคลลัสเกิด andadventitious หน่อใหม่ ตามลำดับ ในทั้งหมดของประสบการ ments , หลายชุดควบคุมการเจริญเติบโตพืชใช้ theph ของสื่อคือการปรับฐานก่อนอัตราส่วนโฟกัสที่ 121 ◦และ 1.1 กก. cm − 2 เพราะอีก 20 นาทีวัฒนธรรมที่อุณหภูมิ 26 ± 2 ◦ cwith 12 H ภายใต้ความเข้มแสงลักซ์แสง 2000 ให้ bycool สีขาวหลอด fluorescent .

2.3 การชักนำแคลลัส
ยอด ( 3 - 8 มม. ) และสิ้นสุด ( ใบอ่อน ( 5 - 8 มม. ) อาหารจากสามถึงสี่เดือนเก่าต้นหมัน werecultured บน MS ( gelrite 0.8% และ 30 g L − 1sucrose ) ที่มี 6-benzyladenine ( b ; 0.2 – 3.0 mg L − 1 ) 2 ,4-dichlorophenoxyacetic acid ( 2 , 4-D 0.1 - 2.0 มิลลิกรัมต่อลิตร ; − 1 ) หรือกรดแนฟทาลีน ( NAA 0.1 มิลลิกรัมต่อลิตร ( ; 1 − 1 ) ชักนำ . allcultures ถูกเก็บรักษาไว้ในขวดแก้ว ( × 60 มม. 90 มม. ) containing30 มลกลาง สี่อาหารเพาะเลี้ยงต่อขวด และแต่ละรักษา ment ที่มีอยู่ยี่สิบชิ้นส่วน . ทุกการทดลอง repeatedthree ครั้ง ในช่วงสองสามสัปดาห์แรกวัฒนธรรมเป็น incu ลดในที่มืดจนถูกชักนำแคลลัส . ระดับกระตุ้นจากเนื้อเยื่อเพาะเลี้ยงแล้วซบลงบนกลางเดียวกันทุก 4weeks . แต่ละแคลลัสแบ่งออกเป็น 4 – 6 มม. เส้นผ่าศูนย์กลางชิ้นในการโอนและ subcultured ถึงสองถึงสามครั้ง . . . .

2.4 . วัฒนธรรม
เพาะเลี้ยงแคลลัสแคลลัสบนอาหารสูตร MS ที่ subcultured 8 – 12 สัปดาห์พบว่ากระตุ้นยอดปากดี . ชิ้นส่วนแคลลัส ( 4 – 6 มม. ) firsttransferred ไป SH เติมแตกต่างกัน concen trations ของ 6-benzyladenine ( b ; 1.0 – 5.0 มิลลิกรัมต่อลิตรร่วมกับ− 1 ) - เนฟทาลีนกรดน้ำส้ม ( NAA 0.1 1.0 mg L ; ( − 1 ) และ Increase ( IBA ) ; 0.1 1.0 mg L − 1 ) บนพื้นฐานของผลแรกthreeba ความเข้มข้น ( 2 mg L − 1 , − 3 มิลลิกรัมต่อลิตรและ 5 มิลลิกรัมต่อลิตรร่วมกับ− 1 ) 0.1 mg L และ L −− 1naa 0.1 มิลลิกรัม 1iba ถูกทดสอบ ยิง induc tion คือการประเมินและแสดงเป็นยิงยอดต่อแคลลัสของความถี่ andnumber หลังจาก 8 สัปดาห์ 4 ขวด ( culturedper แคลลัสที่มีขนาดกลาง ) 30 มิลลิลิตร และการรักษาแต่ละ contained20 เปอร์เซ็นต์ . ทุกครั้งที่ทำการทดลองซ้ำ 3 ครั้ง

2.5รากและใซ้
หน่อที่เกิดจากสื่อที่มี 3.0 มิลลิกรัมต่อลิตร SH − 1ba ร่วมกับ 0.1 mg / L −− 1iba และ 0.1 มก. 1naa รากและการทดลอง มาตรการที่ได้ยิงไอเอ็นจีประมาณ 5 – 8 ซม. ยาวถูกย้าย rootingmedium ซึ่งประกอบด้วย MS ferent dif ( Increase ( และอื่น ๆ ;0 – 5 mg L − 1 ) หรือกรดแนฟทาลีน ( NAA 0 – 5 mg L − 1 ) คนเดียว หลังจาก 4 สัปดาห์ รากและการประเมินผลแสดงเป็นราก rootnumber ความถี่และความยาวราก / หน่อ สี่ยอด culturedper จาร์ ( ที่มีขนาดกลาง 35 ml ) แต่ละวิธีมี 20explants ซึ่งถูกเก็บรักษาไว้ในขวด eachexperiment ห้าลอกเลียนแบบและทำซ้ำ 3 ครั้งวัฒนธรรมเป็น 26 incubatedat ± 2 ◦ C 12 ชั่วโมงภายใต้แสงลักซ์แสง 2000 intensityprovided โดยเย็นหลอดเรืองแสงสีขาว รากต้นที่ถูกโอนไปยังสวน ดินผสม ดิน withsand ( 1 : 1 ) ในร่มเงาพักพิง ( ประมาณ 75% เฉด ) ภายใต้เงื่อนไขของธรรมชาติ ( 26 ± 3 ◦ C ) ที่มีช่วงแสง 12 H .และพบถูกปฏิบัติด้วย 1000 mg L − 1antracol ( pd20050192 ) โอน daybefore . พืชกับ 6 – 8 ชิ้นส่วนของใบทราน ferred ไปยังสนาม

2.6 การวิเคราะห์ทางสถิติ
วิธีจัด randomizeddesign สมบูรณ์ ( CRD ) ( ชักนำและราก ) และการออกแบบ ( orthogonalexperimental ฟื้นฟูโรงงาน ) wererepeated การทดลองทั้งหมด 3 ครั้งและการรักษาแต่ละที่มีอยู่ twentyexplants . ข้อมูลที่ถูกต้องในการวิเคราะห์ความแปรปรวน ( ANOVA ) และการเปรียบเทียบระหว่างวิธีการเป็นสำคัญ performedusing Multiple Range test ดันแคน ; ค่า P น้อยกว่า 0.05 ) อยู่

3 ผลลัพธ์
3.1 . การชักนำแคลลัส
ใบอ่อนบนอาหารสูตรชักนำสื่อ generatedcalli ภายใน 2 สัปดาห์ 4 สัปดาห์ที่จำเป็นสำหรับ shoottip เลี้ยงเพื่อสร้างแคลลัส ( ตารางที่ 1 ) สามชนิด : ชนิดของแคลลัส wereobserved แคลลัสสีขาวและมีขนาดกะทัดรัด ( รูปที่ 1A ) ; ประเภท iicalli เป็นสีเขียวเหลืองอ่อน ( รูปที่ 1A ) ; และชนิดที่ 3 โตแซนแคลลัสสีเขียวขนาดเล็กและกลมเหมือน ( ภาพที่ 1c )ประเภทของแคลลัสขึ้นอยู่กับควบคุมการเจริญเติบโตพืชชนิดและชิ้นส่วนพืชที่ใช้ อาหารที่ได้มาจากใบอ่อนเป็นสีขาวและมีขนาดกะทัดรัด ( ประเภท ) เมื่อ 0.2 mg L − 0.2 มิลลิกรัมต่อลิตร 12,4-d หรือ−และ 0.5 mg L − 1naa wasadded . เป็นแนวคิดเหล่านี้