Materials and methods Growth of mic

Materials and methods Growth of microorganism
Kluyveromyces marxianus IMB3 was maintained on malt extract agar at 45°C. The organism was grown in submerged culture in shake-flasks containing yeast growth medium as described previ- 0us1y,~ except that sucrose was replaced by lactose [2% (w/v)]. Flasks were incubated in an orbital shaker at 45°C.
Extraction of P-galactosidase
Cells were harvested by centrifugation at 36 h and washed in 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 7.0. Cells were homogenized in 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 7.0, using a Braun homoge- nizer together with glass beads as described previously.’ Homoge- nates were clarified by centrifugation at 10,000 g for 30 mins and concentrated by passage through a 100,000 KDa cutoff ultrafiltra- tion membrane. The extract was stored at - 20°C.
@Galactosidase assay
Activity was determined by assay at 30°C using the substrate o-ni- trophenyl-P-D-galactoside in 50 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0. Enzyme activity is expressed as kmoles a-nitrophenol pro- duced per minute per milliliter of sample. Protein concentration was determined using a previously described method.8 Using lac- tose as substrate, reactions consisted of the relevant concentration of substrate in 50 mu sodium phosphate buffer, pH 7.0. Assays were performed at 3O”C, after which the concentration of glucose produced was determined using the glucose oxidase-peroxidase kit produced by Boehringer Mannheim, GmbH (Germany) in ac- cordance with the manufacturer’s instructions.
Nondenaturing pofyacrylamide gradient gel electrophoresis
Polyacrylamide gradient gel electrophoresis (PAGGE) was per- formed essentially as described previously.9 Electrophoresis was carried out using 4-15% gels at 200 V for IO min following application of the sample. Subsequently, running conditions were changed to 150 V and electrophoresis was allowed to continue for 1.5 h.
P-Galactosidase zymogram staining procedure
Gels to be stained were placed in substrate solution (5 mu meth- ylumbelliferyl-P-D-galactoside in 50 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0) and incubated for 2 to 5 h at room temperature.
Determination of ethanol
Samples harvested from fermentations were analyzed for ethanol content using a gas chromatograph (GLC 8410; Perkin Elmer) as described previously.6
Results Production of P-galactosidase during growth of K. marxianus IMB3 on glucose and lactose-containing media
The organism was grown on media containing 2% (w/v) lactose and glucose, and samples harvested at various times were analyzed for cell associated P-galactosidase activity. The results are shown in Figure 1. The organism was shown to produce maximum amounts of enzyme at 20 to 25 h, both on glucose- and lactose-containing media. In the case of enzyme production by the organism in glucose-containing media, the amount of enzyme was low but significant. These results suggest that the organism is capable of pro- ducing low, constitutive amounts of activity in the presence of glucose. No activity was detected in extracellular culture supematants. When grown on 2% (w/v) glucose, the organisms pro- duced a maximum concentration of 8.5 g l- 1 ethanol (Fig- ure 2), which represented 83% of the maximum theoretical yield. When the organism was grown on media containing 2% (w/v) lactose, the maximum amount of ethanol pro- duced was found to be 4 g l-l, which represented 39% of the maximum theoretical yield. In view of the latter finding we decided to isolate and further characterize the P-galac- tosidase activity produced by the organism during growth on lactose-containing media.
Figure 1 Production of p-galactosidase activity during growth of Kluyveromyces marxianus IMB3 on glucose (0) and lactose (0) containing media. Samples were harvested at the indicated times and cells were homogenized as described in ME

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วัสดุและวิธีการเจริญเติบโตของจุลินทรีย์
marxianus Kluyveromyces IMB3 มีอยู่ในข้าวมอลต์สกัด agar ที่ 45 องศาเซลเซียส สิ่งมีชีวิตที่ถูกปลูกในวัฒนธรรมน้ำท่วมน้ำปั่นที่ประกอบด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อยีสต์เป็นอธิบาย previ-0us1y, ~ ยกเว้นว่าซูโครสถูกแทนที่ ด้วยแล็กโทส [2% (w/v)] น้ำถูก incubated ในเชคเกอร์การโคจรที่ 45 องศาเซลเซียส
สกัด P galactosidase
เซลล์เก็บเกี่ยว โดย centrifugation ที่ 36 h และล้างใน 0.1 M โซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ ค่า pH 7.0 เซลล์ถูก homogenized เป็นกลุ่มใน 0.1 M โซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ ค่า pH 7.0 ใช้ homoge-nizer เป็น Braun พร้อมลูกปัดแก้วตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ' ขึ้ โดย centrifugation ที่ 10000 g 30 นาที และเข้มข้น โดยเส้นทางผ่าน 100, Homoge-natesเยื่อตัดยอด ultrafiltra-สเตรชัน KDa 000 การดึงข้อมูลถูกเก็บไว้ที่ - 20 องศาเซลเซียส ทดสอบ
@Galactosidase
กิจกรรมกำหนด โดยวิเคราะห์ที่ 30° C ใช้พื้นผิว o-ni-trophenyl-P-D-galactoside 50 mM โซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ ค่า pH 7.0 เอนไซม์จะแสดงเป็น kmoles เป็น nitrophenol pro-duced ต่อนาทีละ milliliter ของตัวอย่าง กำหนดความเข้มข้นของโปรตีนโดยใช้ method.8 อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ใช้ tose ลัคเป็นพื้นผิว ปฏิกิริยาประกอบด้วยสมาธิที่เกี่ยวข้องของพื้นผิวในหมู่ 50 โซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ ค่า pH 7.0 Assays ดำเนินที่ 3O "C หลังจากที่ความเข้มข้นของกลูโคสที่ผลิตได้กำหนดใช้ชุด oxidase peroxidase กลูโคสที่ผลิต โดย Boehringer มา GmbH (เยอรมนี) ใน ac-cordance คำแนะนำของผู้ผลิต
Electrophoresis ไล่ระดับสีเจ nondenaturing pofyacrylamide
Polyacrylamide electrophoresis เจลไล่ระดับสี (PAGGE) ถูกต่อ - รูปแบบอธิบายเป็นหลัก previously.9 Electrophoresis ทำออกใช้เจ 4-15% 200 V min IO ต่อแอพลิเคชันของตัวอย่าง ในเวลาต่อมา มีการเปลี่ยนแปลงเงื่อนไขการ 150 V และ electrophoresis ได้รับอนุญาตให้ต่อ 1.5 h.
zymogram P-Galactosidase กระบวนการย้อมสี
เจจะมีสีอยู่ในพื้นผิวโซลูชัน (หมู่ที่ 5 จาก-ylumbelliferyl-P-D-galactoside ใน 50 mM โซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ ค่า pH 7.0) และ incubated สำหรับ 2-5 h ที่อุณหภูมิห้อง
ความมุ่งมั่นของเอทานอล
ตัวอย่างที่เก็บเกี่ยวผลผลิตจากการหมักแหนมได้วิเคราะห์เนื้อหาเอทานอลโดยใช้ chromatograph ก๊าซ (GLC 8410 เพอร์เอลเมอ) เป็น previously.6 อธิบาย
ผลิตผลของ P-galactosidase ในระหว่างการเจริญเติบโตของคุณ marxianus IMB3 กลูโคสและแล็กโทสประกอบด้วยสื่อ
สิ่งมีชีวิตที่ถูกปลูกในสื่อประกอบด้วย 2% (w/v) แล็กโทสและกลูโคส และตัวอย่างที่เก็บเกี่ยวในช่วงเวลาต่าง ๆ ที่วิเคราะห์สำหรับ P-galactosidase กิจกรรมเชื่อมโยงเซลล์ ผลลัพธ์จะแสดงในรูปที่ 1 สิ่งมีชีวิตที่ถูกแสดงในการผลิตเอนไซม์ที่ 20 ถึง 25 h สูงสุดยอดทั้งในสื่อที่ประกอบด้วยกลูโคส และแล็กโทส ในกรณีของการผลิตเอนไซม์จากสิ่งมีชีวิตในน้ำตาลกลูโคสประกอบด้วยสื่อ จำนวนเอนไซม์ต่ำ แต่ที่สำคัญ ผลลัพธ์เหล่านี้แนะนำว่า สิ่งมีชีวิตที่มีความสามารถในโป ducing ต่ำ ขึ้นยอดของกิจกรรมในต่อหน้าของกลูโคส กิจกรรมไม่พบในวัฒนธรรม extracellular supematants เมื่อปลูกในกลูโคส 2% (w/v) ที่สิ่งมีชีวิตโป-duced ความเข้มข้นสูงสุดของ 8.5 g l 1 เอทานอล (ฟิก-ure 2), ซึ่งแสดงถึง 83% ของค่าสูงสุดที่ทฤษฎีผลผลิต เมื่อสิ่งมีชีวิตที่ถูกปลูกในสื่อประกอบด้วยแล็กโทส 2% (w/v) ยอดสูงสุดของเอทานอลโปร-duced พบเป็น 4 g l-l ซึ่งแสดงถึง 39% ของผลผลิตทางทฤษฎีสูงสุด มุมมองการค้นหาหลัง เราตัดสินใจที่จะแยก และเพิ่มเติม ลักษณะกิจกรรม P-galac-tosidase ที่ผลิตในระหว่างการเจริญเติบโตบนประกอบด้วยแล็กโทส โดยสิ่งมีชีวิตที่สื่อ
คิดผลิต 1 p-galactosidase กิจกรรมในระหว่างการเจริญเติบโตของ Kluyveromyces marxianus IMB3 (0) กลูโคสและแล็กโทส (0) ประกอบด้วยสื่อ ตัวอย่างถูกเก็บเกี่ยวในการระบุเวลา และเซลล์ถูก homogenized เป็นกลุ่มตามที่อธิบายไว้ในผม

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วัสดุและวิธีการเจริญเติบโตของจุลินทรีย์
kluyveromyces marxianus imb3 malt extract agar คือ รักษาที่อุณหภูมิ 45 องศา สิ่งมีชีวิตที่ถูกเพาะแช่ในขวดเขย่าที่มีขนาดกลางการเจริญเติบโตของยีสต์ตามที่อธิบายไว้ previ - 0us1y ~ ยกเว้นซูโครสถูกแทนที่โดยแล็กโตส [ 2 % ( w / v ) ] ถูกบ่มในขวดเขย่า วงโคจรที่ 45 องศา p-galactosidase

การสกัดเซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวโดยการปั่นเหวี่ยงที่ 36 ชั่วโมงและล้างใน 0.1 M ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ พีเอช 7.0 . เซลล์มีการบดใน 0.1 โมลาร์โซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 7.0 ใช้บร homoge - nizer ด้วยกันกับลูกปัดแก้วตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ . ' homoge - บั้นท้ายได้ชี้แจงโดยการเหวี่ยงแยกที่ 10 , 000 G สำหรับ 30 นาที และเข้มข้น โดยผ่าน 100 ,000 ดาลตันตัด ultrafiltra , เมมเบรน สารสกัดที่ถูกเก็บไว้ที่ - 20 ° C (

@ galactosidase กิจกรรม กำหนดโดยวิธีที่ 30 องศา C โดยใช้พื้นผิว o-ni - trophenyl-p-d-galactoside 50 มิลลิเมตรโซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 7.0 . กิจกรรมของเอนไซม์จะแสดงเป็น kmoles a-nitrophenol Pro - duced ต่อนาทีต่อมิลลิลิตรของตัวอย่างความเข้มข้นของโปรตีนถูกกำหนดโดยใช้วิธีการที่อธิบายก่อนหน้านี้ 8 ใช้ครั่ง - tose เป็นสับสเตรท ปฏิกิริยาประกอบด้วยความเข้มข้นของสารอาหารที่เกี่ยวข้องใน 50 หมู่ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ พีเอช 7.0 . จำนวนที่พบ 30 " C , หลังจากที่ความเข้มข้นของกลูโคสที่ผลิตได้ถูกกำหนดโดยใช้เอนไซม์ กลูโคสชุดผลิตโดย Boehringer Mannheim ,GmbH ( เยอรมัน ) ใน AC - คอร์แดนซ์กับคำแนะนำของผู้ผลิต

เมื่อ pofyacrylamide ลาดเจลอะคริลาไมด์เจลสี ( pagge ) คือต่อ - รูปแบบหลักตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ คือ 9 electrophoresis โดยใช้ 4-19 % เจลที่ 200 V สำหรับ IO มินตามการตัวอย่าง ต่อมาการใช้เงื่อนไขเปลี่ยนไป 150 V และ electrophoresis ได้รับอนุญาตต่อ 1.5 ชม.

p-galactosidase ทดลองย้อมสีขั้นตอนเจลจะเปื้อนอยู่ในหลากหลายโซลูชั่น ( 5 หมู่เมท - ylumbelliferyl-p-d-galactoside 50 มิลลิเมตรโซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 7.0 ) และบ่มเป็นเวลา 2 ถึง 3 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง การหาปริมาณเอทานอล

ตัวอย่างจากการเก็บเกี่ยว fermentations วิเคราะห์ปริมาณเอทานอลโดยใช้แก๊สโครมาโตกราฟ ( glc 8410 ; เพอร์กินเอลเมอร์ ) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ 6
ผลการผลิต p-galactosidase ในระหว่างการเจริญเติบโตของ K . imb3 marxianus ในกลูโคสและแล็กโตสที่มีสื่อ
สิ่งมีชีวิตโตในสื่อที่มี 2 % ( w / v ) แลคโตส และกลูโคสและตัวอย่างที่เก็บเกี่ยวในช่วงเวลาต่าง ๆ วิเคราะห์เซลล์ที่เกี่ยวข้อง p-galactosidase กิจกรรม ผลลัพธ์ที่ได้จะแสดงในรูปที่ 1 สิ่งมีชีวิตที่ถูกแสดงเพื่อผลิตปริมาณของเอนไซม์สูงสุดที่ 20 ถึง 25 ชั่วโมง ทั้งใน และ แลคโตส ที่มีสื่อ ในกรณีของการผลิตเอนไซม์โดยสิ่งมีชีวิตในกลูโคสที่มีสื่อ , ปริมาณของเอนไซม์ต่ำ แต่ที่สำคัญผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าสิ่งมีชีวิตสามารถ Pro ducing ต่ำ , และปริมาณของกิจกรรมในการแสดงตนของกลูโคส ไม่มีกิจกรรมที่ตรวจพบในวัฒนธรรมและ supematants . เมื่อปลูกใน 2 % ( w / v ) กลูโคส สิ่งมีชีวิต Pro - duced สูงสุด 8.5 กรัมต่อลิตรความเข้มข้นของเอทานอล ( มะเดื่อ - ที่มี - 1 2 ) ซึ่งแสดง 83 % ของทฤษฎีสูงสุด ผลผลิตเมื่อสิ่งมีชีวิตถูกปลูกในสื่อที่มี 2 % ( w / v ) แลคโตส ยอดสูงสุดของเอทานอล Pro - duced ถูกพบว่าเป็นฉัน - 4 กรัม ซึ่งแสดงถึง 39% ของทฤษฎีสูงสุด ผลผลิต ในมุมมองของหลังหาเราตัดสินใจที่จะแยกและเพิ่มเติมลักษณะ p-galac - กิจกรรม tosidase ที่ผลิตโดยสิ่งมีชีวิตในระหว่างการเจริญเติบโตในภาวะที่มีสื่อ
รูปที่ 1 การผลิตกิจกรรม p-galactosidase ในระหว่างการเจริญเติบโตของ kluyveromyces marxianus imb3 กลูโคส ( 0 ) และแลคโตส ( 0 ) ที่มี สื่อ จำนวนที่พบเวลาเก็บเกี่ยวและเซลล์เป็นโฮโมตามที่อธิบายไว้ในผม