Isolation of mitochondrial and cyto

Isolation of mitochondrial and cytosolic extracts
Mitochondrial extracts were isolated harvesting
P19 cells by trypsinization and by spinning them down
at 1, 000 g. Pellets were washed once in cold PBS and
centrifuged again (1,000 g) at 4ºC. The cell suspension
was then resuspended in 0.5 ml of ice cold sucrose buffer
(250 mM sucrose, 20 mM K+ Hepes pH 7.5, 10 mM
KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.1 mM EDTA, 1 mM EGTA)
supplemented right before use with 1 mM DTT, 0.1 mM
PMSF and protease inhibitor cocktail containing 1 μg/
ml of leupeptin, antipain, chymostatin and pepstatin.
The cell suspension was then incubated on ice for 20 to
30 minutes. After incubation, cells were transferred to a
pre-cooled tissue homogenizer and homogenized 30 times
using a tight pestle, while keeping the homogenizer on
ice. Progress was monitored every 20 to 30 strokes under
a phase contrast microscope and was stopped when more
than 90% of cells were burst.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

แยกยลและสารสกัดจาก cytosolic
ยลสารสกัดที่แยกได้เก็บเกี่ยว
เซลล์ P19 โดย trypsinization และโดยการปั่นพวกเขาลง
วันที่ 1, 000 กรัม เม็ดถูกล้างครั้งเดียวในพีบีเอสที่หนาวเย็นและ
ปั่นอีกครั้ง (1,000 กรัม) ที่4ºC เซลล์แขวนลอย
ถูก resuspended แล้ว 0.5 มล. ของน้ำแข็งบัฟเฟอร์ซูโครสเย็น
(250 มิลลิซูโครส 20 มิลลิ k + HEPES พีเอช 7.5, 10 มิลลิ
KCl 1.5 มิลลิ MgCl2, EDTA 0.1 มิลลิ 1 มิลลิ EGTA)
เสริมที่เหมาะสมก่อนการใช้งาน 1 มิลลิ DTT 0.1 มิลลิ
PMSF และยับยั้งเอนไซม์โปรติเอค๊อกเทลที่มี 1 ไมโครกรัม /
มิลลิลิตร leupeptin, antipain, chymostatin และ pepstatin.
เซลล์แขวนลอยถูกบ่มแล้วบนน้ำแข็งสำหรับ 20 ถึง
30 นาที หลังจากการบ่มเซลล์ถูกย้ายไป
homogenizer เนื้อเยื่อก่อนเย็นและปั่นครั้งที่ 30
โดยใช้สากแน่นขณะที่การรักษา homogenizer บน
น้ำแข็ง ความคืบหน้าคือการตรวจสอบทุก 20 ถึง 30 จังหวะภายใต้
กล้องจุลทรรศน์คมชัดขั้นตอนและหยุดเมื่อมากขึ้น
กว่า 90% ของเซลล์ที่ถูกระเบิด

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การแยกสารสกัดและสารสกัดจาก cytosolic ยลยล

p19 เก็บเกี่ยวแยกเซลล์โดย trypsinization และปั่นลง
1 , 000 กรัม เม็ดถูกล้างครั้งเดียวใน PBS หนาว
ระดับอีกครั้ง ( 1000 กรัม ) ที่ 4 º C เซลล์แขวนลอย
แล้ว resuspended ใน 0.5 ml เย็น
( ซูโครส กันชน 250 มม. 20 มม. โดย K ฮีเปส pH 7.5 , 10 mm
. 1.5 มม. ชุด 0.1 mM EDTA , ,หน่วย 1 มม. )
เสริมก่อนใช้ด้วย 1 mM DTT 0.1 mm
PMSF และ protease inhibitor ค็อกเทลที่ประกอบด้วย 1 μ g /
4 antipain ลูเพปติน , และ , chymostatin pepstatin .
เซลล์ถูกระงับแล้วบ่มแข็ง 20

30 นาที หลังจากบ่มเซลล์ที่ถูกย้ายไปยังเนื้อเยื่อและบดด้วยเครื่องปั่นก่อน

30 ครั้งใช้สากแน่นในขณะที่เก็บบน
เครื่องปั่นน้ำแข็ง ความคืบหน้าการติดตามทุก ๆ 20 ถึง 30 ครั้ง ภายใต้การต่างระดับกล้องจุลทรรศน์และหยุดเมื่อมากขึ้น
กว่า 90% ของเซลล์มีระเบิด