2.2.2. Quantitative and nested PCR

2.2.2. Quantitative and nested PCR assays
Specific real-time quantitation of DNA viruses (HAdV and JCPyV)
by qPCR or an RNA virus (NoV GGII) by quantitative reverse transcription
PCR (qRT-PCR) was performed as previously described
(Table 1) using TaqMan® Universal PCR Master Mix and the RNA
UltraSense™ One-Step qRT-PCR System, respectively (Invitrogen,
Carlsbad, CA, USA) (Hernroth et al., 2002; Kageyama et al., 2003;Loisy et al., 2005; Pal et al., 2006). Undiluted and log10 dilutions
of the nucleic acid extracts were analysed in duplicate. The equivalence
of 35 mL for DNA viruses and 17.5 mL for the RNA virus were
tested from river and seawater, whereas 1.7 mL and 0.9 mL,
respectively, were tested fromwastewater. All qPCRs included more
than one non-template control (NTC) to demonstrate that the mix
did not produce fluorescence due to contamination. Quantitation
was performed with an MX3000P sequence detector system
(Stratagene, La Jolla, CA, USA).
The amplification conditions of the HEV nested RT-PCR (nRTPCR)
methods used for qualitative detection were described elsewhere
(Erker et al., 1999). Primers are described in Table 1. The
reverse transcription of the extracted RNA was performed with a
one-step RT-PCR Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) and the nRT-PCR
was performed with AmpliTaq™ Gold DNA polymerase (Applied
Biosystems Foster City, CA, USA).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.2.2 การเชิงปริมาณ และซ้อน assays PCRเฉพาะเวลาจริงการวิเคราะห์หาปริมาณของดีเอ็นเอไวรัส (HAdV และ JCPyV)โดย qPCR การไวรัสอาร์เอ็นเอ (NoV GGII) โดย transcription ย้อนกลับเชิงปริมาณทำ PCR (qRT-PCR) อธิบายไว้ว่า ก่อนหน้านี้(ตารางที่ 1) ใช้ผสมหลักสากล PCR ® TaqMan และอาร์เอ็นเอUltraSense ™ในขั้นตอนเดียวระบบ qRT PCR ตามลำดับ (Invitrogenคาร์ลส CA, USA) (Hernroth และ al., 2002 Al. Kageyama ร้อยเอ็ด 2003 Loisy et al., 2005 พาลและ al., 2006) หัว และ log10 dilutionsของกรดนิวคลีอิก โครงถูก analysed ซ้ำ ที่เทียบเท่า35 มิลลิลิตรสำหรับ DNA ไวรัสและ 17.5 mL ในไวรัสอาร์เอ็นเอมีทดสอบจากแม่น้ำและทะเล ในขณะที่ 1.7 mL และ 0.9 mLตามลำดับ fromwastewater ผ่านการทดสอบได้ รวมทั้งหมด qPCRs เพิ่มเติมกว่าหนึ่งไม่แม่ควบคุม (NTC) แสดงที่ผสมผสานไม่ได้สร้าง fluorescence เนื่องจากปนเปื้อน การวิเคราะห์หาปริมาณทำกับระบบตรวจจับลำดับ MX3000P(Stratagene, La Jolla, CA, USA)เงื่อนไขการขยายของ HEV ที่ซ้อน RT-PCR (nRTPCR)มีอธิบายวิธีที่ใช้ตรวจคุณภาพอื่น ๆ(Erker et al., 1999) ไพรเมอร์ไว้ในตารางที่ 1 ที่ทำ transcription กลับของอาร์เอ็นเอที่แยกโดยการชุด RT-PCR ขั้นตอนเดียว (Qiagen, Valencia, CA, USA) และ nRT PCRทำกับ™ AmpliTaq ทองดีเอ็นเอพอลิเมอเรส (ประยุกต์Biosystems ฟอสเตอร์ซิตี้ CA สหรัฐอเมริกา)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.2.2 เชิงปริมาณและการตรวจ PCR ที่ซ้อนกัน
เฉพาะปริมาณเรียลไทม์ของไวรัสดีเอ็นเอ (HAdV และ JCPyV)
โดย qPCR หรืออาร์เอ็นเอไวรัส (GGII พ.ย. ) โดยปริมาณการถอดความกลับ
PCR (qRT-PCR) ได้ดำเนินการตามที่ระบุไว้ก่อนหน้านี้
(ตารางที่ 1) โดยใช้TaqMan® ยูนิเวอร์แซ PCR โทผสมและอาร์เอ็นเอ
UltraSense ™ขั้นตอนเดียว qRT-PCR ระบบตามลำดับ (Invitrogen,
Carlsbad, CA, USA) (Hernroth, et ​​al., 2002; ยามะ et al, 2003;. Loisy et al, 2005;. Pal et al., 2006) ไม่เจือปนและ log10 เจือจาง
ของสารสกัดจากกรดนิวคลีอิกวิเคราะห์ในที่ซ้ำกัน ความเท่าเทียมกัน
ของ 35 มิลลิลิตรเพื่อหาไวรัส DNA และ 17.5 มิลลิลิตรไวรัสอาร์เอ็นเอที่ถูก
ทดสอบจากแม่น้ำและน้ำทะเลในขณะที่ 1.7 มิลลิลิตรและ 0.9 มิลลิลิตร
ตามลำดับมีการทดสอบ fromwastewater qPCRs ทั้งหมดรวมมากขึ้น
กว่าหนึ่งในการควบคุมที่ไม่ใช่แม่แบบ (กทช) เพื่อแสดงให้เห็นว่าการผสม
ไม่ได้ผลิตเรืองแสงเกิดจากการปนเปื้อน ปริมาณ
ได้ดำเนินการกับระบบตรวจจับลำดับ MX3000P
(Stratagene, La Jolla, CA, USA).
เงื่อนไขการขยายของ HEV ซ้อน RT-PCR (nRTPCR)
วิธีการที่ใช้สำหรับการตรวจสอบคุณภาพถูกอธิบายอื่น ๆ
(Erker et al., 1999) ไพรเมอร์ได้อธิบายไว้ในตารางที่ 1
การถอดรหัสย้อนกลับของอาร์เอ็นเอที่สกัดได้ดำเนินการกับ
ขั้นตอนเดียว RT-PCR Kit (Qiagen, วาเลนเซีย, CA, USA) และ NRT-PCR
ได้ดำเนินการกับ AmpliTaq ™ดีเอ็นเอโพลิเมอร์ทอง (Applied
Biosystems ฟอสเตอร์ซิตี, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.2.2 . เชิงปริมาณและวิธี PCR แบบเรียลไทม์ที่ซ้อนกัน )
เฉพาะเซลล์ของดีเอ็นเอของไวรัส ( hadv และ jcpyv )
โดย qpcr หรืออาร์เอ็นเอไวรัส ( พ.ย. ggii ) โดยปริมาณ reverse transcription
PCR ( ข้าพเจ้า PCR ) ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้
( ตารางที่ 1 ) การใช้ taqman ®สากลต้นแบบผสมและ RNA PCR
ultrasense ™ข้าพเจ้าหนึ่งก้าว โดยระบบตามลำดับ ( Invitrogen
Carlsbad , CA , USA ) ( hernroth et al . , 2002 ;คาเงยาม่า et al . , 2003 ; loisy et al . , 2005 ; พัล et al . , 2006 ) เจือปน และ LN เจือจาง
ในการสกัดกรดนิวคลีอิกวิเคราะห์ในที่ซ้ำกัน สมมูล
35 ml ไวรัสดีเอ็นเอและยีนของไวรัสเป็น 17.5 ml
ทดสอบจากแม่น้ำและน้ำทะเล และ 1.7 มล. และ 0.9 ml
ตามลำดับการทดสอบ fromwastewater . ทั้งหมดรวมมากกว่า
qpcrsมากกว่าหนึ่งไม่ใช่แม่แบบการควบคุม ( กทช. ) เพื่อแสดงให้เห็นว่าผสม
ไม่ผลิตสารเนื่องจากมลภาวะ เซลล์
แสดงด้วยระบบตรวจจับลำดับ mx3000p
( stratagene , La Jolla , CA , USA )
( เงื่อนไขของยานพาหนะไฟฟ้าไฮบริดที่ซ้อนกันต่อ ( nrtpcr ) วิธีการที่ใช้ในการตรวจสอบคุณภาพ

ถูกอธิบายไว้ที่อื่น ( erker et al . , 1999 ) ไพรเมอร์ที่อธิบายไว้ในตารางที่ 1
ย้อนกลับของ mRNA ทำการสกัด RNA ด้วยวิธี one-step
ชุด ( เพิ่ม , Valencia , CA , USA ) และ NRT PCR
แสดงกับดีเอ็นเอ amplitaq ™ทองการประยุกต์
Biosystems Foster City , CA , USA )