Cultured keratinocytes grown in six

Cultured keratinocytes grown in six-well plates were transiently transfected with the STAT3-responsive plasmid pLucTKS3 (a generous gift of Prof. J. Turkson, University of Central Florida, Orlando, FL) or pGASLuc plasmid by using Lipofectin reagent (InVitrogen), according to the manufacturer's instructions. At 24 h post-transfection cells were pretreated with 12.5 µM of DCE, CS and HCS for 1 h and then stimulated with IL-22 or IFN-γ for 8 h. After cell lysis in an appropriate buffer (Promega Italia, Milan, Italy), Firefly luciferase activity was measured using Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega). To normalize the transfection efficiency, pRL-null plasmid encoding the Renilla luciferase was included in each transfection. Luciferase activity was further normalized by total cellular protein content assayed using Bradford (Sigma-Aldrich, Milan, Italy).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

Keratinocytes อ่างปลูกดีหกแผ่นก็ transiently transfected กับ pLucTKS3 plasmid STAT3 ตอบสนอง (ความกว้างของขวัญศาสตราจารย์ J. Turkson มหาวิทยาลัยฟลอริดากลาง ออร์แลนโด FL) หรือ pGASLuc plasmid โดยใช้รีเอเจนต์ Lipofectin (InVitrogen), ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ใน 24 ชม หลัง transfection เซลล์ถูก pretreated กับ µM 12.5 ของ DCE CS แล้ว HCS 1 h แล้วขาวกระตุ้น IL-22 หรือ IFN-γสำหรับ 8 h หลังจากเซลล์การ lysis ในบัฟเฟอร์ที่เหมาะสม (Promega เลีย มิลาน อิตาลี), กิจกรรม luciferase หิ่งห้อยถูกวัดโดยใช้ระบบวิเคราะห์ Luciferase Glo คู่ (Promega) จะทำให้ปกติประสิทธิภาพ transfection, plasmid pRL เป็น null รหัส Renilla luciferase ถูกรวมใน transfection แต่ละ กิจกรรม luciferase ถูกต่อไปตามปกติ โดยรวมเซลลูลาร์โปรตีน assayed ใช้แบรดฟอร์ด (Aldrich ซิก มิลาน อิตาลี)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

keratinocytes เพาะปลูกในแผ่นหกดีถูก transfected transiently กับ STAT3 ตอบสนองพลาสมิด pLucTKS3 (ของขวัญของศเจ Turkson, มหาวิทยาลัยเซ็นทรัลฟลอริดา, Orlando, FL) หรือ pGASLuc พลาสมิดโดยใช้ Lipofectin สาร (Invitrogen) ตาม คำแนะนำของผู้ผลิต เวลา 24 ชั่วโมงเซลล์โพสต์-transfection ถูกปรับสภาพกับ 12.5 ไมโครโมลาร์ของ DCE, CS และ HCS เป็นเวลา 1 ชั่วโมงและจากนั้นกระตุ้นด้วย IL-22 หรือ IFN-γ 8 ชั่วโมง หลังจากที่สลายเซลล์ในบัฟเฟอร์ที่เหมาะสม (Promega Italia, มิลาน, อิตาลี), กิจกรรม luciferase หิ่งห้อยถูกวัดโดยใช้แบบ Dual-Glo luciferase Assay System (Promega) ที่จะปรับประสิทธิภาพ transfection, Prl โมฆะพลาสมิดเข้ารหัส luciferase Renilla ถูกรวมอยู่ในแต่ละ transfection กิจกรรม luciferase เป็นปกติต่อไปโดยมีปริมาณโปรตีนของเซลล์ทั้งหมด assayed ใช้ Bradford (Sigma-Aldrich, มิลาน, อิตาลี)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เลี้ยงคีราติโนไซต์เติบโตในหกดีแผ่นมีบุคคลหรือสิ่งที่อยู่ชั่วคราว transfected กับ stat3 ตอบสนองพลาส pluctks3 ( ของขวัญล้ำค่าของ ศาสตราจารย์ เจ turkson มหาวิทยาลัย Central Florida , Orlando , FL ) หรือ pgasluc สายพันธุ์โดยใช้ lipofectin Reagent ( Invitrogen ) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต โพสต์ใน 24 ชั่วโมงสำหรับเซลล์มีผ่านกับµ dce 12.5 เมตร ,และ CS HCS เป็นเวลา 1 ชั่วโมง จากนั้นกระตุ้นด้วย il-22 หรือ IFN - γ 8 ชั่วโมงหลังจากการสลายเซลล์ในบัฟเฟอร์ที่เหมาะสม ( promega อิตาลี , มิลาน , อิตาลี ) , กิจกรรมเอนไซม์ลูซิเฟอเรสหิ่งห้อยถูกวัดโดยใช้ระบบวิเคราะห์เอนไซม์ลูซิเฟอเรสฯคู่ ( promega ) ให้มาตรฐานสำหรับประสิทธิภาพในการ renilla ลูซิเฟอเรสติน ในการเข้ารหัสถูกรวมอยู่ในแต่ละค .กิจกรรมเอนไซม์ลูซิเฟอเรสยังปกติ โดยเนื้อหาของเซลล์โปรตีนทั้งหมด ปริมาณการใช้ แบรดฟอร์ด ( ซิกม่า Aldrich , มิลาน , อิตาลี )