5.2 Multiplex FISHThe ability to la

5.2 Multiplex FISH
The ability to label probes with different fluorophores enables the detection of several pathogens at the same time. Multiplex FISH (mFISH) requires the same optimization steps like multiplexing PCR. Therefore, the design of the FISH probes has to be performed in a way that the same hybridization temperatures and stringency conditions can be employed. Furthermore, the used probes should show as little mutual complementarity as possible. This sometimes tedious process is easier than the establishment of a multiplex PCR assay where for each amplification process two primers (instead of one FISH probe) have to be adapted to other primer pairs. Sequential FISH-stainings instead of simultaneous hybridization steps are also possible (Almstrand et al., 2013). mFISH has been used intensively in the field of genetics for the differential visualization of chromosomes, sometimes termed ‘chromosome painting’, by using combinatorial labelling of a probe with a set of different fluorophores (Liehr et al., 2004 and Liehr et al., 2013). Accordingly, mFISH should be able to simultaneously detect more than ten different pathogenic species. However, as ordinary fluorescence microscopes have only a limited set of filters (often broadband filters) and the optical equipment is not always sufficient to distinguish between closely-related fluorophores with similar emission spectra, the feasibility of the selective detection of a vast number of different species has to be estimated with caution. Therefore, many FISH approaches in microbiology target only two or three different species (Almeida et al., 2011, Almstrand et al., 2013 and Yamaguchi et al., 2012). Alternatively, it is conceivable that probes targeting different pathogens are labelled with the same fluorophore and are applied as a mixture. Although this method lacks the resolution capacity to specify the kind of contamination, which is possible with mFISH using differentially labelled probes, it is sufficient to rather unspecifically detect a broad range of pathogenic bacteria. This might also be a saving of time on the long term because no channel switch is needed during microscopic evaluation. The improvement of fluorescence microscopy and the price decline of corresponding equipment will also foster the feasibility of mFISH. Up to now, only a few mFISH approaches in food microbiology have been described (Oliveira et al., 2004 and Yamaguchi et al., 2012), not counting studies where the actual probe targeting a certain species was used in combination with an unspecific probe for Eubacteria as a control or to quantify the total amount of bacteria in the sample. Takada and colleagues showed that the simultaneous detection of seven different Bifidobacterium spp. in human faeces in one FISH test is possible (Takada et al., 2004), demonstrating the general feasibility of mFISH. Interestingly, Oliveira et al. have shown that mFISH in sheep milk is also possible with Gram-positive and Gram-negative bacteria like L. monocytogenes and Salmonella spp. (Oliveira et al., 2004) although Gram-positive and Gram-negative bacteria in general might require different permeabilization conditions, and for a combined detection specifically adapted protocols for the permeabilization have to be employed (Ercolini et al., 2006). An interesting extension to mFISH might be the simultaneous use of nucleotide probes together with antibody stainings and specific dyes, providing general information about the overall viability, metabolic state or the respiratory activity of the observed cells like it was shown for Pseudomonas spp. (Kitaguchi et al., 2005). This additional data might be extremely useful to judge the viability and thus potential perilousness of a bacterial contamination.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

5.2 ปลา multiplexป้ายคลิปปากตะเข้กับ fluorophores แตกต่างกันสามารถช่วยให้การตรวจพบโรคทั้งหลายในเวลาเดียวกัน ปลา multiplex (mFISH) ต้องมีขั้นตอนเพิ่มประสิทธิภาพเดียวกันเช่นการมัลติเพล็กซ์แบบ PCR ดังนั้น คลิปปากตะเข้ปลาออกแบบได้ดำเนินการในลักษณะที่เดียว hybridization อุณหภูมิและเงื่อนไข stringency สามารถทำงาน นอกจากนี้ คลิปปากตะเข้ใช้ควรแสดงเป็น complementarity ซึ่งกันและกันน้อยที่สุด กระบวนการนี้บางครั้งน่าเบื่อได้ง่ายขึ้นกว่าการจัดตั้งการ multiplex PCR assay ซึ่งแต่ละกระบวนการขยาย ไพรเมอร์สอง (แทนปลาหนึ่งโพรบ) ต้องปรับให้คู่รองพื้นอื่น ๆ ปลา stainings ลำดับแทนขั้นตอนการ hybridization พร้อมกันก็ได้ (Almstrand et al., 2013) mFISH ใช้ intensively ด้านพันธุศาสตร์สำหรับการแสดงภาพประกอบเพลงส่วนที่แตกต่างของ chromosomes บางครั้งเรียกว่า "โครโมโซมสี' โดยปัญหาฉลากของโพรบที่ มีชุดของ fluorophores แตกต่างกัน (Liehr et al., 2004 และ Liehr et al., 2013) ตาม mFISH ควรสามารถตรวจหาสายพันธุ์ pathogenic ต่าง ๆ มากกว่าสิบพร้อมกัน อย่างไรก็ตาม เป็นกล้องจุลทรรศน์ธรรมดา fluorescence มีเฉพาะจำกัดชุดของตัวกรอง (กรองมักบรอดแบนด์) และอุปกรณ์ออปติคอลมักจะไม่เพียงพอที่จะแยกระหว่าง fluorophores ที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับแรมสเป็คตราเล็ดรอดคล้าย ความเป็นไปได้ของการตรวจพบจำนวนสายพันธุ์ต่าง ๆ มากมายเลือกได้ที่จะประเมิน ด้วยความระมัดระวัง ดังนั้น วิธีปลาหลายในจุลเป้าหมายเพียงสอง หรือสามสายพันธุ์ต่าง ๆ (Almeida et al., 2011, Almstrand et al., 2013 และ Yamaguchi et al., 2012) หรือ ได้หลากหลายว่า คลิปปากตะเข้กำหนดเป้าหมายโรคแตกต่างกันคือมัน มี fluorophore เดียวกัน และใช้เป็นส่วนผสม แม้ว่าวิธีนี้ไม่มีกำลังการผลิตที่ละเอียดเพื่อระบุชนิดของการปนเปื้อน ซึ่งเป็นไปได้กับ mFISH ใช้คลิปปากตะเข้มัน differentially ก็เพียงพอแต่ unspecifically ตรวจหาแบคทีเรีย pathogenic ที่หลากหลาย นี้ยังอาจจะประหยัดเวลาในระยะยาวเนื่องจากสลับช่องไม่จำเป็นต้องใช้ในระหว่างการประเมินผลด้วยกล้องจุลทรรศน์ ปรับปรุง fluorescence microscopy และการลดลงของราคาของอุปกรณ์ที่เกี่ยวข้องจะยังส่งเสริมความเป็นไปได้ของ mFISH ถึงตอนนี้ เฉพาะกี่ mFISH วิธีในจุลชีววิทยาอาหารได้อธิบาย (al. Oliveira ร้อยเอ็ด 2004 และ Yamaguchi et al., 2012) , ไม่นับที่โพรบจริงที่กำหนดเป้าหมายบางชนิดใช้ร่วมกับโพรบการ unspecific สำหรับ Eubacteria เป็นตัวควบคุม หรือกำหนดปริมาณจำนวนแบคทีเรียในตัวอย่างศึกษา Takada และเพื่อนร่วมงานพบว่าการตรวจพบพร้อมโอ Bifidobacterium ต่าง ๆ เจ็ดใน faeces มนุษย์หนึ่งปลาทดสอบได้ (Takada et al., 2004), เห็นความเป็นไปได้ทั่วไปของ mFISH เป็นเรื่องน่าสนใจ Oliveira et al. ได้แสดงที่ mFISH นมแกะก็สามารถทำได้กับแบคทีเรียแบคทีเรียแกรมบวก และแบคทีเรียแกรมลบเช่น L. monocytogenes และโอซัล (Oliveira et al., 2004) แม้ว่าแบคทีเรียแกรมบวก และแบคทีเรียแบคทีเรียแกรมลบโดยทั่วไปอาจต้องใช้เงื่อนไขอื่น permeabilization และตรวจรวม ดัดแปลงเฉพาะโปรโตคอลสำหรับ permeabilization ที่ได้เป็น เจ้าของ (Ercolini และ al., 2006) นามสกุลที่น่าสนใจเพื่อ mFISH อาจใช้พร้อมกันของนิวคลีโอไทด์คลิปปากตะเข้กับแอนติบอดี stainings และสีเฉพาะ การให้ข้อมูลทั่วไปเกี่ยวกับชีวิตโดยรวม เผาผลาญรัฐ หรือกิจกรรมการหายใจของเซลล์ที่พบเช่นมีแสดงสำหรับโอลี (คิตากูชิ et al., 2005) ข้อมูลเพิ่มเติมอาจจะมีประโยชน์อย่างมากที่จะตัดสินชีวิต จึง perilousness เป็นไปได้ของการปนเปื้อนของแบคทีเรีย

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

5.2 ปลา Multiplex
ความสามารถในการติดป้ายโพรบกับ fluorophores ที่แตกต่างกันจะช่วยให้การตรวจสอบของเชื้อโรคหลายอย่างในเวลาเดียวกัน ปลา Multiplex (mFISH) ต้องทำตามขั้นตอนการเพิ่มประสิทธิภาพเช่นเดียวกับวิธี PCR มัลติ ดังนั้นการออกแบบของยานสำรวจปลาที่จะต้องมีการดำเนินการในทางที่อุณหภูมิพันธุ์เดียวกันและเงื่อนไขเข้มงวดสามารถจ้าง นอกจากนี้ยานสำรวจที่ใช้ควรแสดง complementarity ร่วมกันเล็ก ๆ น้อย ๆ เท่าที่จะทำได้ กระบวนการนี้น่าเบื่อบางครั้งเป็นเรื่องง่ายกว่าการจัดตั้งทดสอบ PCR multiplex ที่กระบวนการขยายแต่ละสองไพรเมอร์ (แทนหนึ่งสอบสวนปลา) จะต้องมีการปรับให้เข้ากับคู่ไพรเมอร์อื่น ๆ ลำดับ FISH-ย้อมสีแทนขั้นตอนการผสมข้ามพันธุ์พร้อมกันนี้ยังมีความเป็นไปได้ (Almstrand et al., 2013) mFISH ถูกนำมาใช้อย่างเข้มงวดในด้านพันธุศาสตร์เพื่อการมองเห็นความแตกต่างของโครโมโซมบางครั้งเรียกว่าภาพวาดโครโมโซม 'โดยใช้การติดฉลาก combinatorial ของหัวกับชุดของ fluorophores ที่แตกต่างกัน (Liehr et al., 2004 และ Liehr et al., 2013) ดังนั้น mFISH ควรจะสามารถตรวจสอบไปพร้อม ๆ กันกว่าสิบชนิดที่ทำให้เกิดโรคที่แตกต่างกัน แต่เป็นกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงสามัญมีเพียงชุด จำกัด ของตัวกรอง (มักกรองบรอดแบนด์) และอุปกรณ์แสงมักจะไม่เพียงพอที่จะแยกแยะความแตกต่างระหว่าง fluorophores อย่างใกล้ชิดที่เกี่ยวข้องกับสเปกตรัมการปล่อยก๊าซที่คล้ายกันเป็นไปได้ของการตรวจสอบการคัดเลือกจำนวนมากมายของที่แตกต่างกัน สายพันธุ์ที่จะต้องมีการประมาณด้วยความระมัดระวัง ดังนั้นวิธีการที่ปลาจำนวนมากในเป้าหมายจุลชีววิทยาเพียงสองหรือสามสายพันธุ์ที่แตกต่างกัน (ไมย์ et al., 2011, Almstrand et al., 2013 และยามากูชิ et al., 2012) หรืออีกทางหนึ่งก็เป็นไปได้ว่ายานสำรวจกำหนดเป้าหมายที่แตกต่างกันเชื้อโรคที่ถูกกำกับด้วยสารเรืองแสงที่เหมือนกันและถูกนำมาใช้เป็นส่วนผสม แต่วิธีนี้ขาดความจุความละเอียดเพื่อระบุชนิดของการปนเปื้อนที่เป็นไปได้ด้วย mFISH ใช้ฟิวส์ที่มีข้อความแตกต่างกันก็จะเพียงพอที่จะค่อนข้าง unspecifically ตรวจสอบความหลากหลายของเชื้อแบคทีเรียก่อโรค นอกจากนี้ยังอาจจะมีการประหยัดเวลาในระยะยาวเพราะสวิทช์ช่องไม่จำเป็นต้องใช้ในช่วงการประเมินผลด้วยกล้องจุลทรรศน์ การปรับปรุงของกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงและการลดลงของราคาของอุปกรณ์ที่เกี่ยวข้องนอกจากนี้ยังจะส่งเสริมให้เกิดความเป็นไปได้ของ mFISH ถึงตอนนี้มีเพียงไม่กี่ mFISH วิธีทางจุลชีววิทยาอาหารได้รับการอธิบาย (Oliveira et al., 2004 และยามากูชิ et al., 2012) ไม่นับการศึกษาที่การสอบสวนที่เกิดขึ้นจริงการกำหนดเป้าหมายบางชนิดถูกนำมาใช้ร่วมกับการสอบสวน unspecific สำหรับ Eubacteria เป็นตัวควบคุมปริมาณหรือจำนวนของแบคทีเรียในตัวอย่าง ทาคาดะและเพื่อนร่วมงานแสดงให้เห็นว่าการตรวจสอบพร้อมกันของเอสพีพี Bifidobacterium ที่แตกต่างกันเจ็ด ในอุจจาระของมนุษย์ในการทดสอบปลาเป็นไปได้ (Takada et al., 2004) แสดงให้เห็นถึงความเป็นไปได้ทั่วไปของ mFISH ที่น่าสนใจ Oliveira et al, แสดงให้เห็นว่า mFISH ในนมแกะยังเป็นไปได้ด้วยแบคทีเรียแกรมบวกและแกรมลบเช่น L. monocytogenes และ Salmonella spp (Oliveira et al., 2004) แม้ว่าแกรมบวกและแบคทีเรียแกรมลบโดยทั่วไปอาจต้องมีเงื่อนไขที่แตกต่างกัน permeabilization และสำหรับการตรวจสอบรวมโปรโตคอลดัดแปลงมาโดยเฉพาะสำหรับ permeabilization จะต้องมีการจ้างงาน (Ercolini et al., 2006) เป็นส่วนที่น่าสนใจเพื่อ mFISH อาจจะมีการใช้งานพร้อมกันของยานสำรวจเบื่อหน่ายร่วมกับแอนติบอดีย้อมและสีย้อมเฉพาะการให้ข้อมูลทั่วไปเกี่ยวกับการมีชีวิตโดยรวมของรัฐการเผาผลาญหรือกิจกรรมทางเดินหายใจของเซลล์สังเกตเห็นเช่นนั้นก็แสดงให้เห็นสำหรับ Pseudomonas spp (Kitaguchi et al., 2005) ข้อมูลเพิ่มเติมนี้อาจจะมีประโยชน์อย่างมากในการตัดสินความมีชีวิตและความเสี่ยงภัยที่อาจเกิดขึ้นจึงของการปนเปื้อนของเชื้อแบคทีเรีย

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

5.2 แบบปลา
ความสามารถป้ายวัดกับ fluorophores แตกต่างกันสามารถตรวจหาเชื้อโรคหลายในเวลาเดียวกัน มัลติปลา ( mfish ) ต้องเดียวกันเพิ่มประสิทธิภาพขั้นตอนเหมือนกับการมัลติเพล็กซ์พีซีอาร์ . ดังนั้น การออกแบบของปลาจึงต้องดำเนินการในลักษณะที่อุณหภูมิเดียวกัน ( และเงื่อนไข stringency สามารถจ้าง นอกจากนี้ที่ใช้จึงควรแสดงเป็นเพียงข้อมูลซึ่งกันและกันมากที่สุด นี้บางครั้งน่าเบื่อกระบวนการง่ายกว่าสถานประกอบการของการทดสอบ PCR มัลติเพล็กซ์ ( สองที่แต่ละกระบวนการ PCR ( แทนหนึ่งปลาสอบสวน ) ต้องปรับให้เข้ากับคู่สีอื่น ๆ ย้อมแบบปลาแทนขั้นตอนทำพร้อมกันยังเป็นไปได้ ( almstrand et al . , 2013 )mfish ถูกใช้อย่างในสาขาพันธุศาสตร์ ค่าการแสดงผลของโครโมโซม บางครั้งเรียกว่า ' ระบายสี ' โครโมโซม โดยการใช้ฉลากของตัวชุด fluorophores แตกต่างกัน ( liehr et al . , 2004 และ liehr et al . , 2013 ) ดังนั้น mfish น่าจะพร้อมกันได้มากกว่า 10 ชนิดก่อโรคที่แตกต่างกัน อย่างไรก็ตามเป็นกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์ธรรมดามีเพียงจำนวนชุดของตัวกรอง ( กรองบ่อยๆ บรอดแบนด์ ) และอุปกรณ์แสงมักจะไม่เพียงพอที่จะแยกแยะระหว่างความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับการปล่อยสเปกตรัม fluorophores คล้ายกัน ความเป็นไปได้ของการเลือกของจํานวนของสายพันธุ์ที่แตกต่างกันจะต้องประเมินด้วยความระมัดระวัง ดังนั้นวิธีการหลายปลาเป้าหมายจุลชีววิทยาในเพียงสองหรือสามชนิดที่แตกต่างกัน ( อัลเมด้า et al . , 2011 , almstrand et al . , 2013 และ Yamaguchi et al . , 2012 ) อีกวิธีหนึ่งคือ มันเป็นไปได้ว่าเป้าหมายและเชื้อโรคต่างๆมีข้อความกับ fluorophore เดียวกันและมีการใช้เป็นส่วนผสม ถึงแม้ว่าวิธีนี้ขาดความละเอียดสามารถระบุชนิดของการปนเปื้อน ,ซึ่งเป็นไปได้กับ mfish labelled probes ที่ใช้ต่างกัน มันก็เพียงพอที่จะค่อนข้างตรวจสอบความหลากหลายของเชื้อแบคทีเรีย unspecifically . นี่อาจเป็นบันทึกของเวลาในระยะยาว เพราะไม่มีช่องทางสลับเป็นสิ่งจำเป็นในการประเมิน ด้วยกล้องจุลทรรศน์การพัฒนากล้องจุลทรรศน์เรืองแสงและราคาที่ลดลงของอุปกรณ์ที่เกี่ยวข้องก็จะสร้างความเป็นไปได้ของ mfish . ถึงตอนนี้ เพียงไม่กี่ mfish วิธีทางจุลชีววิทยาอาหารได้รับการอธิบาย ( Oliveira et al . , 2004 และ Yamaguchi et al . , 2012 )ไม่นับที่จริงเล็งศึกษาสอบสวนบางชนิดถูกใช้ในการรวมกันกับการค้นหา unspecific Eubacteria เป็นควบคุม หรือปริมาณปริมาณแบคทีเรียทั้งหมดในตัวอย่าง ทาคาดะ และ เพื่อนร่วมงาน พบว่า การตรวจหาชนิดบิฟิโดแบคทีเรียที่แตกต่างกันพร้อมกันเจ็ดในมนุษย์อุจจาระในการทดสอบหนึ่งปลาที่เป็นไปได้ ( ทาคาดะ et al . , 2004 )แสดงให้เห็นถึงความเป็นไปได้ ทั่วไป ของ mfish . ที่น่าสนใจ , Oliveira et al . ได้แสดงให้เห็นว่า mfish ในนมแกะยังเป็นไปได้กับแกรมบวกและแกรมลบ เช่น แบคทีเรีย . monocytogenes Salmonella spp . ( Oliveira et al . , 2004 ) แม้ว่าแบคทีเรียแกรมบวกและแกรมลบทั่วไปอาจต้องมีเงื่อนไข permeabilization แตกต่างกันและการตรวจสอบรวมเฉพาะดัดแปลงโปรโตคอลสำหรับ permeabilization ต้องใช้ ( ercolini et al . , 2006 ) ส่วนขยายที่น่าสนใจ mfish อาจจะมีการใช้งานพร้อมกันของนิวคลีโอไทด์โพรบร่วมกับย้อมย้อมติดเฉพาะแอนติบอดี และการให้ข้อมูลทั่วไปเกี่ยวกับชีวิตโดยรวมรัฐสลายหรือกิจกรรมสังเกตการหายใจของเซลล์ เหมือนมันเป็น Pseudomonas spp . ( kitaguchi et al . , 2005 ) ข้อมูลเพิ่มเติมนี้อาจเป็นประโยชน์อย่างยิ่งที่จะตัดสินชีวิตและดังนั้นจึงอาจ perilousness ของการปนเปื้อนแบคทีเรีย