Protoplast isolation and culturePro

Protoplast isolation and culture
Protoplasts were isolated from two types of organs, leaves with
petioles from 3 to 4 week-old carrot plantlets and hypocotyls
from 2 week-old seedlings using the protocol of Baranski et al.
(2007), but with some modifications. In details, about 1 g of
tissue was placed in a glass Petri dish with 8 ml of preplasmolysis
solution (0.5 M mannitol), cut into fine pieces and then
incubated for 1 h in the dark at 26 ± 2C. Tissue digestion
was performed overnight at 26 ± 2C with gently shaking
(30 rpm) in enzyme mixture consisting of 1% (w/v) cellulase
Onozuka R-10 (Duchefa), 0.1% (w/v) pectolyase Y-23
(Duchefa), 20 mM 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid
(MES, Sigma), 5 mM CaCl2, and 0.6 M mannitol (Sigma), pH
5.6, filter-sterilized (0.22 lm, Millipore). The released protoplasts
were separated from undigested tissue by filtration
through a 80 lm nylon sieve (Millipore) and centrifuged at
100 g for 5 min. The pellet was resuspended in 8 ml of 0.5 M
sucrose with 1 mM MES and overlaid with 2 ml of W5 medium
(Menczel et al. 1981). After centrifugation at 145 g for
10 min the purified protoplasts were localized in the interphase
between the two solutions. The collected protoplasts were
washed in W5 solution and then in the culture medium, and
centrifuged at 100 g for 5 min after each washing.
After purification, protoplast yield was determined by
counting, using Fuchs Rosenthal hemocytometer chamber.
The working density of protoplasts was adjusted to 8 9 105
protoplasts per ml. Culture system with protoplast embedding
in a thin calcium alginate layer (Ca-alginate) was used,
based on a slightly modified protocol of Damm et al. (1989).
Equal volumes of protoplast suspension in the culture medium
and 2.8% (w/v) alginic acid sodium salt (Sigma) in
0.4 M mannitol solution were mixed carefully. Aliquots
(app. 300 ll) of protoplasts/alginate mixture were spread
onto 1% (w/v) agar (Biocorp) containing 20 mM CaCl2,
0.4 M mannitol in 6 cm Petri dishes. By circular movement
of the Petri dish protoplast suspension was forced to form a
thin layer. After 1 h incubation at room temperature polymerization
occurred and alginate layers with embedded
protoplasts as a solid sheets were carefully transferred with
the fine forceps from the agar plates to 4 ml of the liquid
culture medium in 6 cm Petri dishes. The final density of
embedded protoplasts was 4 9 105 per ml. Protoplast culture
medium was based on the CPP medium (Dirks et al.
1996) and consisted of macro-, micro-elements and organic
acids according to Kao and Mychayluk (1975), vitamins
according to B5 medium (Gamborg et al. 1968), 74 g l-1
glucose, 250 mg l-1 casein enzymatic hydrolysate (Sigma),
0.1 mg l-1 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), and
0.2 mg l-1 zeatin (pH 5.6, filter-sterilized). Protoplast cultures
were incubated in the dark at 26 ± 2C. After 10 days
of culture, the medium was replaced by a fresh one.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

แยก protoplast และวัฒนธรรมพลาสต์ที่แยกได้จากอวัยวะ ใบมีสองชนิดpetioles จาก 3 ถึง 4 สัปดาห์เก่าแครอท plantlets hypocotylsจาก 2 สัปดาห์อายุกล้าใช้โพรโทคอของ Baranski et al(2007), แต่ มีการเปลี่ยนแปลงบางอย่าง รายละเอียด ประมาณ 1 กรัมเนื้อเยื่อที่ถูกวางไว้ในแก้วจานเพาะเชื้อกับ 8 ml preplasmolysisโซลูชัน (0.5 ม. mannitol), ตัดเป็นชิ้นดีแล้วได้รับการกก 1 ชั่วโมงในมืดที่ 26 ± c. 2 การย่อยอาหารเนื้อเยื่อทำค้างคืนที่ 26 ± 2C ด้วยการสั่นเบา ๆ(30 รอบต่อนาที) ส่วนผสมเอนไซม์ cellulase 1% (w/v) ประกอบด้วยOnozuka R-10 (Duchefa), 0.1% (w/v) pectolyase Y-23กรด ethanesulfonic (Duchefa), 20 มม. 2- (N-Morpholino)(MES, Sigma), ค่า pH CaCl2 และ mannitol 0.6 ม. (Sigma), 5 mM5.6 กรองฆ่าเชื้อ (0.22 lm มิลลิพอร์) พลาสต์ออกมาถูกแยกออกจากเนื้อเยื่อไม่ได้แยกแยะ ด้วยการกรองผ่านเป็นไนล่อน lm 80 ตะแกรง (มิลลิพอร์) และเหวี่ยงที่100 กรัมสำหรับ 5 นาที เม็ดถูก resuspended ใน 0.5 ม. 8 มล.ซูโครสกับ 1 มม. MES และวางทับ ด้วย 2 มล. W5 ปานกลาง(Menczel et al. 1981) หลังจากหมุนเหวี่ยงที่ 145 กรัมสำหรับพลาสต์บริสุทธิ์ถูกแปลใน interphase ใน 10 นาทีระหว่างสองวิธีแก้ไข พลาสต์รวบรวมได้ล้าง ในโซลูชัน W5 แล้ว ใน กลางวัฒนธรรม และเหวี่ยงได้ที่ 100 กรัม 5 นาทีหลังจากซักผ้าแต่ละหลังจากฟอก ผล protoplast ถูกกำหนดโดยนับ ใช้ห้อง hemocytometer Fuchs โรเซนธอลปรับปรุงความหนาแน่นการทำงานของพลาสต์ไป 8 9 105พลาสต์ต่อ ml. ระบบวัฒนธรรม protoplast ฝังแอลจิเนตแคลเซียมบาง ๆ เป็นชั้น (Ca-แอลจิเนต) ถูกใช้ตามโพรโทคอเปลี่ยนของ Damm et al. (1989)ปริมาณเท่าของ protoplast ระงับในสื่อวัฒนธรรมและเกลือโซเดียมกรด alginic 2.8% (w/v) (Sigma) ใน0.4 M mannitol โซลูชันถูกผสมอย่างระมัดระวัง Aliquots(ประมาณ 300 ll) ของพลาสต์/แอลจิเนต ที่มีการแพร่กระจายไปส่วนผสมลงบนอาหาร 1% (w/v) (Biocorp) ที่ประกอบด้วยขนาด 20 มม. CaCl20.4 M mannitol ใน Petri 6 ซม. โดยการเคลื่อนที่แบบวงกลมของ protoplast จานเพาะ ระงับบังคับแบบฟอร์มชั้นบาง ๆ หลังจาก 1 ชั่วโมงบ่มที่อุณหภูมิห้องจำนวนเกิดขึ้น และฝังชั้นแอลจิเนตด้วยพลาสต์เป็นแผ่นแข็งได้มีการโอนย้ายอย่างระมัดระวังด้วยหนีบดีจากจานอาหารไป 4 ml ของของเหลวสื่อวัฒนธรรมอาหาร Petri 6 ซม. ความหนาแน่นที่สุดของ4 9 105 ต่อ ml. วัฒนธรรม Protoplast ถูกฝังพลาสต์ปานกลางตามสื่อ CPP (Dirks et alปี 1996) และประกอบด้วยการแมโคร- องค์ประกอบของไมโคร และอินทรีย์กรดตามเขาและ Mychayluk (1975), วิตามินไปตามกลาง B5 (Gamborg et al. 1968), l-1 74 gกลูโคส 250 มก.ฉีดเค l-1 เอนไซม์ (ซิกม่า),กรด 2, 4-dichlorophenoxyacetic l-1 0.1 มก. (2, 4-D), และ0.2 มิลลิกรัม l-1 ซีเอติน (ค่า pH 5.6 กรองฆ่าเชื้อ) วัฒนธรรม protoplastได้รับการกกในมืดที่ 26 ± c. 2 หลังจาก 10 วันวัฒนธรรม สื่อถูกแทนที่ด้วยใหม่

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การแยกโปรโตพลาและวัฒนธรรม
protoplasts
แยกได้จากทั้งสองประเภทของอวัยวะใบมีก้านใบ3-4 ต้นแครอทสัปดาห์เก่าและ hypocotyls
จากต้นกล้า 2 สัปดาห์อายุโดยใช้โปรโตคอลของ Baranski et al.
(2007) แต่มีการปรับเปลี่ยนบางอย่าง ในรายละเอียดประมาณ 1
กรัมของเนื้อเยื่อที่ถูกวางไว้ในแก้วจานเลี้ยงเชื้อที่มี8 มิลลิลิตร preplasmolysis
การแก้ปัญหา (0.5 M mannitol)
หั่นเป็นชิ้นที่ดีและจากนั้นบ่มเป็นเวลา1 ชั่วโมงในที่มืดที่ 26 ± 2C การย่อยอาหารเนื้อเยื่อได้ดำเนินการค้างคืนที่ 26 ± 2C กับเบา ๆ เขย่า (30 รอบต่อนาที) ในส่วนผสมของเอนไซม์ที่ประกอบด้วย 1% (w / v) เซลลูOnozuka R-10 (Duchefa) 0.1% (w / v) pectolyase Y-23 (Duchefa ) 20 มิลลิ 2- (N-Morpholino) กรด ethanesulfonic (MES ซิกม่า) 5 มิลลิ CaCl2 และ 0.6 M แมนนิทอล (ซิกม่า), พีเอช5.6, กรองฆ่าเชื้อ (0.22 ไมครอน, ค) protoplasts ปล่อยออกมาถูกแยกออกจากเนื้อเยื่อที่ไม่ได้แยกแยะโดยการกรองผ่าน80 LM ตะแกรงไนลอน (ค) และหมุนเหวี่ยงที่100 กรัมเป็นเวลา 5 นาที เม็ดที่ถูก resuspended 8 มล. 0.5 M ซูโครส 1 มิลลิ mes และบุด้วย 2 มิลลิลิตรของกลาง W5 (Menczel et al. 1981) หลังจากการหมุนเหวี่ยงที่ 145 กรัมสำหรับ10 นาที protoplasts บริสุทธิ์ได้รับการแปลเป็นภาษาท้องถิ่นในระหว่างเฟสระหว่างสองโซลูชั่น protoplasts เก็บรวบรวมถูกล้างในการแก้ปัญหาW5 แล้วในสื่อวัฒนธรรมและหมุนเหวี่ยงที่100 กรัมเป็นเวลา 5 นาทีหลังจากที่แต่ละซักผ้า. หลังจากที่บริสุทธิ์ผลผลิตโปรโตพลาถูกกำหนดโดยการนับโดยใช้ Fuchs โรเซนธาล hemocytometer ห้อง. ความหนาแน่นของการทำงานของโปรโตพลามีการปรับ 8 9 105 protoplasts ต่อมิลลิลิตร ระบบการเลี้ยงที่มีโปรโตพลาฝังในแคลเซียมอัลจิเนตชั้นบาง ๆ (Ca-อัลจิเนต) ถูกนำมาใช้บนพื้นฐานของโปรโตคอลการแก้ไขเล็กน้อยของDamm et al, (1989). ปริมาณที่เท่าเทียมกันของการระงับโปรโตพลาในสื่อวัฒนธรรมและ 2.8% (w / v) เกลือโซเดียมกรด alginic (ซิกม่า) ใน 0.4 การแก้ปัญหา M แมนนิทอลถูกผสมอย่างระมัดระวัง aliquots (app. 300 LL) ของโปรโตพลา / สารผสมอัลจิเนตกระจายลง1% (w / v) วุ้น (Biocorp) ที่มี 20 มิลลิ CaCl2, 0.4 M แมนนิทอล 6 ซม. จานเลี้ยงเชื้อ โดยการเคลื่อนไหวเป็นวงกลมของการระงับจานเลี้ยงเชื้อโปรโตพลาถูกบังคับให้รูปแบบชั้นบางๆ หลังจากบ่ม 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องพอลิเมอที่เกิดขึ้นและชั้นอัลจิเนตที่มีการฝังตัวโปรโตพลาเป็นแผ่นแข็งถูกย้ายอย่างระมัดระวังด้วยคีมชั้นดีจากจานอาหารเลี้ยงเชื้อ4 มิลลิลิตรของเหลวกลางวัฒนธรรมใน6 ซม. จานเลี้ยงเชื้อ ความหนาแน่นสุดท้ายของโปรโตพลาฝัง 4 9 105 ต่อมิลลิลิตร วัฒนธรรมโปรโตพลากลางอยู่บนพื้นฐานของกลาง CPP (Dirks et al. 1996) ประกอบด้วยแมโครองค์ประกอบขนาดเล็กและอินทรีย์กรดตามเขาและMychayluk (1975), วิตามินตามสื่อB5 (Gamborg et al. 1968) 74 กรัม l-1 กลูโคส 250 mg l-1 เคซีนไฮโดรไลเอนไซม์ (ซิกม่า) 0.1 mg l-1 กรด 2,4-dichlorophenoxyacetic (2,4-D) และ0.2 มก. l-1 zeatin (pH 5.6 กรอง -sterilized) วัฒนธรรมโปรโตพลาถูกบ่มในที่มืดที่ 26 ± 2C หลังจาก 10 วันของวัฒนธรรมกลางก็ถูกแทนที่ด้วยสดหนึ่ง