Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 89,

Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 89, pp. 11486-11489, December 1992 Neurobiology Borna disease virus, a negative-strand RNA virus, transcribes in the nucleus of infected cells (central nervous system infection/behavioral disorders) THOMAS BRIESE*t, JUAN CARLOS DE LA TORREt, ANN LEWIS§, HANNS LUDWIG*, AND W. IAN LIPKIN§¶ *Institute of Virology, Free University of Berlin, Nordufer 20, D 1000 Berlin 65, Federal Republic of Germany; tDepartment of Neuropharmacology, Scripps Research Institute, 10666 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037; and IDepartments of Anatomy and Neurobiology, Neurology, and Microbiology and Molecular Genetics, University of California, Irvine, CA 92717 Communicated by D. Carleton Gajdusek, September 1, 1992 (received for review April 22, 1992) ABSTRACT Borna disease virus, an uncas ied Infectious agent, causes immune-mediated neurologic disease in a wide variety of animal hosts and may be involved in pathogenesis of selected neuropsychiatric diseases in man. 1nitial reports suggested that Borna disease virus is a singlesranded RNA virus. We describe here a method for isolatin of viral particles that has allowed definitive identification of the genome as containg a negative-polarity RNA. Further, we show that the viral mRNAs are transcribed in the nucleus. Borna disease is an immune-mediated behavioral syndrome caused by infection with an unclassified agent, Borna disease virus (BDV). Though natural infection has only been confirmed to occur in horses and sheep, the potential host range of BDV includes other mammals and birds. Experimental infection of birds, rodents, and primates leads to the expression of BDV proteins in neural tissues, meningoencephalitis, and behavioral disturbances (1). Antibodies reactive with BDV proteins have been found in patients with neuropsychiatric diseases, suggesting the possibility that BDV or a related virus may be a human pathogen (2-7). Though the agent has not been identified by electron microscopy, molecular approaches have facilitated its partial characterization. BDV cDNA clones have been isolated by subtractive screening of libraries prepared from infected rat brain (8) and infected cells (6). Analyses of BDV transcripts in Northern and in situ hybridization experiments have indicated that BDV is likely to be a single-stranded RNA virus with a genome of 8.5 (8, 9) to 10 kilobases (kb) (6). The polarity of the viral genome has been controversial (6, 8-11). Here we report that infectious BDV particles contain a negative-polarity 8.5-kb RNA and demonstrate that viral mRNAs are synthesized in cell nuclei. MATERIALS AND METHODS Virus Particle Preparation. Oligo/TL, an human oligodendrocyte cell line (12), was infected at an estimated multiplicity of infection of 0.5 focus-forming unit per cell using BD rat brain homogenate (strain V, sixth rat passage) (13-15). Cells were passed every 2-3 days and used for virus particle preparation in passages 10 through 25. Infectious virus was titered in a cell-ELISA system (16). The confluent cell layer (1-2 x 108 cells) was washed once with 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), overlaid with 20 mM Tris HCl, pH 7.4/250 mM MgCl2 (Tris-Mg250 buffer), and incubated for 1.5 hr at 370C to release the cell-bound virus. Supernatant was collected and spun twice at 2500 x g for 5 min. Clarified supernatant was brought to 0.002% Zwittergent 3-14 (Calbiochem) and incubated for 1 hr at room temperature. Virus particles were pelleted at 100,000 x g for 1 hr at 200C, resuspended in 20 mM Tris HCl, pH 7.4/125 mM MgCl2 (Tris-Mg,2 buffer), and treated with DNase (Boehringer Mannheim) at 50 Ag/ml and RNase (Boehringer Mannheim) at 50 ,ug/ml for 1 hr at 3TC. Virus particles were pelleted at 100,000 x g for 1 hr at 40C and resuspended in Tris-Mg,25 buffer for virus titration or nucleic acid extraction. Extraction of RNAs from Virus Partickles. Virus particle preparations were mixed with an equal volume of 2x lysis buffer (100 mM EDTA/10%o SDS/2% 2-mercaptoethanol/ 400 pg of proteinase K per ml/100 mM Tris-HCl, pH 8.3) and incubated for 45 min at 650C. After cooling to room temperature, preparations were extracted twice with phenol/ chloroform/isoamyl alcohol. The final aqueous phase was supplemented with glycogen to 40 Ag/ml and placed at -200C overnight with 1/10th volume of 3 M sodium acetate (pH 5.0) and 1 volume of isopropyl alcohol. Precipitated nucleic acids were pelleted at 20,000 x g for 30 min at 40( and resuspended in H20/0.5% SDS for Northern hybridization analysis. Total cell RNA from rat brain was extracted by homogenization in guanidinium isothiocyanate and centrifugation through cesium chloride (17). Total cell RNA from tissue culture cells was extracted with guanidinium isothiocyanate/acid phenol (18). RNA Nuceocytoplsmic Transport. RNA nucleocytoplasmic transport experiments were done according to methods of Schroder et al. (19). Uninfected or persistently BDVinfected C6 cells (American Type Culture Collection) were cooled on ice, washed three times with HB buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.5/1 mM MgCl2/1 mM EGTA), and then homogenized on ice in HB buffer/i mM phenylmethylsulfonyl fluoride using a Dounce homogenizer (40 strokes with an "A" pestle). The suspension was brought to 50%6 (wt/vol) sucrose/20 mM Tris HC1, pH 7.5/1 mM MgCl2 and spun over a 60o (wt/vol) sucrose/20 mM Tris-HCl, pH 7.5/1 mM MgCl2 cushion at 130,000 x g for 1 hr at 40C. Nuclei were resuspended in transport buffer (25 mMTris-HC1, pH 7.5/250 mM sucrose/0.5 mM CaCl2/0.3 mM MnCl2/25 mM KCI/5 mM spermidine/5 mM 2-mercaptoethanol/yeast tRNA at 300 jug/ml). Nuclei were resuspended in aliquots (840 Al). Individual aliquots were mixed with 160 1d of either an ATPregenerating system (15.6 mM ATP/31.2 mM Na2HPO4/31.2 mM phosphoenolpyruvate/pyruvate kinase at 218 units/ml) or the same buffer system without ATP (-ATP control). Transport kinetics were performed at 300C. Reactions were stopped on ice at 0, 15, or 40 min and spun at 1000 x g for 4 min at 00C. Supernatants (postnuclear fractions) were extracted with phenol/chloroform/isoamyl alcohol, placed at -20oC overnight with 1/10th volume of 3 M sodium acetate Abbreviations: BDV, Borna disease virus; ORF, open reading frame. tPresent address: Department of Neurology, University of California, Irvine, CA 92717. 1To whom reprint requests should be addressed.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

สหรัฐอเมริกา proc. Natl. Acad. Sci. ปี 89 นำ 11486-11489, 1992 ธันวาคม Neurobiology Borna โรคไวรัส การลบเดอะอาร์เอ็นเอไวรัส transcribes ในนิวเคลียสของเซลล์ติดเชื้อ (ระบบประสาทส่วนกลางโรคติดเชื้อ/พฤติกรรม) โทมัส BRIESE * t ฮวนคาร์ลอสเดอลา TORREt, ANN LEWIS§ ลุดวิกแห่ง HANNS * และปริมาณเอียน LIPKIN§¶ * สถาบันชเป็น มหาวิทยาลัยเสรีแห่งเบอร์ลิน Nordufer 20 เบอร์ลิน D 1000 65ประเทศสาธารณรัฐเยอรมนี tDepartment Neuropharmacology, Scripps วิจัย สถาบัน ถนนเหนือ Torrey ไพน์ 10666, La Jolla, CA 92037 และ IDepartments กายวิภาคศาสตร์ และ Neurobiology ประสาทวิทยา และจุลชีววิทยา และอณูพันธุ ศาสตร์ มหาวิทยาลัยแคลิฟอร์เนีย เออร์วิน CA 92717 Communicated โดย D. Carleton Gajdusek, 1 กันยายน 1992 (ได้รับการตรวจทานที่ 22 เมษายน 1992) บทคัดย่อ Borna โรคไวรัส การ uncas ต่าง ๆ ติดเชื้อแทน ทำ mediated ภูมิคุ้มกันโรค neurologic ในโฮสต์สัตว์ที่หลากหลาย และอาจเกี่ยวข้องกับพยาธิกำเนิดของโรค neuropsychiatric เลือกในคน 1nitial รายงานแนะนำว่า ไวรัสโรค Borna singlesranded อาร์เอ็นเอไวรัส ที่นี่เราอธิบายวิธีการ isolatin ของอนุภาคไวรัสที่ได้รับอนุญาตรหัสทั่วไปของกลุ่มที่เป็น containg อาร์เอ็นเอเป็นขั้วลบ ต่อไป เราแสดงว่า mRNAs ไวรัสจะทับศัพท์ในนิวเคลียส โรค Borna เป็นการ mediated ภูมิคุ้มกันพฤติกรรมอาการเกิดจากการติดเชื้อกับตัวแทนไม่ได้แยกประเภท ไวรัสโรค Borna (BDV) แต่ยืนยันติดเชื้อตามธรรมชาติเกิดขึ้นในม้า และแกะ เป็นโฮสต์ช่วงของ BDV เท่านั้น รวมถึงการเลี้ยงลูกด้วยนมและนกอื่น ๆ ทดลองติดเชื้อของนก งาน และ primates นำไปสู่ค่าของ BDV โปรตีนในเนื้อเยื่อประสาท meningoencephalitis และเกิดพฤติกรรม (1) แอนตี้ปฏิกิริยากับ BDV โปรตีนพบในผู้ป่วยโรค neuropsychiatric แนะนำความเป็นไปได้ว่า BDV หรือไวรัสที่เกี่ยวข้องอาจจะเป็นการศึกษามนุษย์ (2-7) แม้ไม่ได้ระบุ โดย microscopy อิเล็กตรอนตัวแทน วิธีโมเลกุลมีบริการจำแนกเป็นบางส่วน BDV cDNA โคลนได้รับแยกต่างหาก โดยคัดกรอง subtractive ของไลบรารีที่เตรียมจากสมองหนูที่ติดเชื้อ (8) และเซลล์ติดเชื้อ (6) วิเคราะห์ใบแสดงผล BDV เหนือและทดลองใน situ hybridization ได้บ่งชี้ว่า BDV จะ ควั่นเดียวไวรัสอาร์เอ็นเอ มีจีโนมของ 8.5 (8, 9) กับ kilobases 10 (kb) (6) ขั้วของกลุ่มไวรัสได้แย้ง (6, 8-11) ที่นี่เรารายงานว่า ติดเชื้ออนุภาค BDV ประกอบด้วยอาร์เอ็นเอ 8.5 kb เป็นขั้วลบ และแสดงให้เห็นว่า มีสังเคราะห์ไวรัส mRNAs ในแอลฟาเซลล์ วัสดุและวิธีการเตรียมอนุภาคไวรัส Oligo/TL บรรทัดเซลล์มนุษย์ oligodendrocyte (12), มีการติดเชื้อที่มีมากมายหลายหลากโดยประมาณติดเชื้อ 0.5 หน่วยความขึ้นต่อเซลล์ใช้ BD หนูสมอง homogenate (ต้องใช้ V หกราชกาล) (13-15) เซลล์ถูกส่งผ่านทุก ๆ 2-3 วัน และใช้สำหรับการเตรียมอนุภาคไวรัสในทางเดิน 10 ถึง 25 ติดเชื้อไวรัสเป็น titered ในระบบเซลล์ ELISA (16) ชั้นเซลล์ confluent (1-2 x 108 เซลล์) ถูกล้างกับ 20 มม. overlaid กับ 20 มม.ทริสเรทติ้ง HCl ค่า pH 7.4/250 มม. MgCl2 (ตรี Mg250 บัฟเฟอร์), ทริสเรทติ้ง HCl (pH 7.4), และ incubated 1.5 ชั่วโมงที่ 370C ปล่อยไวรัสเซลล์แบบผูก Supernatant ถูกรวบรวม และปั่นที่ 2500 x g สองปรารถนาคืน Clarified supernatant 0.002% Zwittergent 3-14 (Calbiochem) และ incubated สำหรับ 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง อนุภาคไวรัสได้ pelleted ที่ g x 100000 ใน 1 ชั่วโมงที่ 200C, resuspended ใน 20 มม.ทริสเรทติ้ง HCl ค่า pH 7.4/125 มม. MgCl2 (ตรี-Mg บัฟเฟอร์ 2), และรักษา ด้วย DNase (มันน์ไฮม์ Boehringer) Ag 50 ml และ RNase (มันน์ไฮม์ Boehringer) ที่ 50 ยู จี/ml ใน 1 ชั่วโมงที่ 3TC อนุภาคไวรัสได้ pelleted ที่ 100000 g x 1 ชั่วโมงที่ 40C และ resuspended ในทริสเรทติ้งมก. 25 บัฟเฟอร์สำหรับการไทเทรตไวรัสหรือสกัดกรดนิวคลีอิก สกัด RNAs จากไวรัส Partickles การเตรียมอนุภาคไวรัสถูกผสม ด้วยปริมาณเท่ากันของบัฟเฟอร์การ lysis x 2 (100 มม. EDTA/10%o SDS/2% 2-mercaptoethanol / 400 pg proteinase K ต่อ ml/100 มม.ตรี-HCl, pH 8.3) และ incubated สำหรับ 45 นาทีที่ราว 650 หลังจากทำความเย็นอุณหภูมิห้อง เตรียมถูกสกัด ด้วยวางสอง / แอลกอฮอล์ คลอโรฟอร์ม/isoamyl อควีเฟสสุดท้ายเสริม ด้วยไกลโคเจนกับ Ag 40 ml และอยู่ที่ C-200 ค้างคืนมีปริมาตร 1/10 ของ 3 M โซเดียม acetate (pH 5.0) และปริมาณแอลกอฮอล์ isopropyl 1 ตะกอนกรดนิวคลีอิกมี pelleted ที่ 20000 x g ใน 30 นาทีที่ 40 (และ resuspended ใน H20/0.5% SDS สำหรับวิเคราะห์ hybridization ภาคเหนือ รวมเซลล์อาร์เอ็นเอจากสมองหนูถูกสกัด โดย homogenization guanidinium isothiocyanate และ centrifugation ผ่าน cesium คลอไรด์ (17) รวมเซลล์อาร์เอ็นเอจากเซลล์เนื้อเยื่อที่สกัด ด้วย guanidinium isothiocyanate/กรด วาง (18) อาร์เอ็นเอ Nuceocytoplsmic ขนส่ง อาร์เอ็นเอ nucleocytoplasmic ขนส่งทดลองทำตามวิธีของ Schroder et al. (19) เชื้อ หรือสามารถเซลล์ BDVinfected C6 (อเมริกันประเภทวัฒนธรรมชุด) ระบายความร้อนด้วยบนน้ำแข็ง ล้างสามครั้ง ด้วยบัฟเฟอร์ HB (10 mM ตรี-HCl, pH 7.5/1 มม. MgCl2/1 มม. EGTA), และ homogenized เป็นกลุ่มแล้ว บนน้ำแข็งในบัฟเฟอร์ HB / ฉันฟลูออไรด์ phenylmethylsulfonyl มม.ใช้ homogenizer Dounce (40 จังหวะกับการ pestle "A") ระบบกันสะเทือนถูกนำตัวไป 50 6% (wt/vol) ซูโครส/20 มม.ทริสเรทติ้ง HC1, pH 7.5/1 มม. MgCl2 และปั่นกว่า 60o เป็น (wt/vol) ซูโครส/20 มม.ตรี-HCl, pH 7.5/1 มม. MgCl2 เบาะที่ 130,000 x g 1 ชั่วโมงที่ 40 ซี แอลฟาถูก resuspended ในขนส่งบัฟเฟอร์ (25 mMTris-HC1, pH 7.5/250 มม. ซูโครส/0.5 มม. CaCl2/0.3 มม. MnCl2/25 มม. KCI/5 มม. spermidine/5 มม. 2-mercaptoethanol/ยีสต์ tRNA ที่เหยือก 300 ml) แอลฟาถูก resuspended ใน aliquots (840 Al) แต่ละ aliquots ถูกผสมกับ d ระบบการ ATPregenerating (ไม่เกิน 15.6 มม. ATP/31.2 มม. Na2HPO4/31.2 มม. phosphoenolpyruvate/pyruvate kinase ที่ 218 หน่วย/มล) หรือระบบบัฟเฟอร์เดียว โดย ATP 1 160 (-ควบคุม ATP) จลนพลศาสตร์การขนส่งได้ดำเนินการในราว 300 ปฏิกิริยาหยุดบนน้ำแข็งที่ 0, 15 หรือ 40 นาที และปั่นที่ 1000 x g ใน 4 นาทีที่ 00 c Supernatants (ส่วน postnuclear) ที่สกัด ด้วยแอลกอฮอล์ คลอโรฟอร์ม/วาง/isoamyl วางที่ - 20oC ค้างคืนมีปริมาตร 1/10 ของ 3 M โซเดียม acetate คำย่อ: BDV, Borna โรคไวรัส ORF กรอบเปิดอ่าน tPresent ที่อยู่: แผนกประสาทวิทยา มหาวิทยาลัยแคลิฟอร์เนีย เออร์วิน CA 92717 1 เป็นผู้พิมพ์คำขอควรได้รับ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

พร Natl Acad วิทย์ สหรัฐอเมริกาฉบับ 89, pp. 11486-11489, ธันวาคม 1992 ไวรัสโรคชีววิทยา Borna, RNA ไวรัสลบสาระ transcribes ในนิวเคลียสของเซลล์ที่ติดเชื้อ (ระบบประสาทส่วนกลางติดเชื้อ / ความผิดปกติของพฤติกรรม) THOMAS BRIESE * t, Juan Carlos DE LA TORREt, ANN LEWIS§, HANNS LUDWIG * และดับบลิวเอียนLIPKIN§¶ * สถาบันไวรัสวิทยา, ฟรีมหาวิทยาลัยเบอร์ลิน Nordufer 20 D 1000 เบอร์ลิน 65, สหพันธ์สาธารณรัฐเยอรมนี tDepartment ของ Neuropharmacology, Scripps Research Institute, 10666 เหนือ Torrey Pines ถนน La Jolla, CA 92037; และ IDepartments กายวิภาคศาสตร์และชีววิทยาวิทยาและจุลชีววิทยาและอณูพันธุศาสตร์, มหาวิทยาลัยแคลิฟอร์เนียเออร์ไวน์, CA 92717 สื่อสารโดย D. Carleton Gajdůšek, 1 กันยายน 1992 (รับสำหรับความคิดเห็น 22 เมษายน 1992) บทคัดย่อ Borna ไวรัสโรค UNCAS IED ตัวแทนติดเชื้อทำให้เกิดโรคทางระบบประสาทระบบภูมิคุ้มกันของร่างกายในหลากหลายของครอบครัวสัตว์และอาจจะมีส่วนร่วมในการเกิดโรคของโรค neuropsychiatric ในมนุษย์ รายงาน 1nitial ชี้ให้เห็นว่าไวรัสโรค Borna เป็นไวรัส RNA singlesranded ที่นี่เราอธิบายวิธีการ isolatin ของอนุภาคไวรัสที่ได้รับอนุญาตให้ระบุตัวตนที่ชัดเจนของจีโนมเป็น containg RNA เชิงลบขั้ว นอกจากนี้เราแสดงให้เห็นว่า mRNAs ไวรัสจะคัดลอกในนิวเคลียส โรค Borna เป็นดาวน์ซินโดรพฤติกรรมระบบภูมิคุ้มกันของร่างกายที่เกิดจากการติดเชื้อตัวแทนไม่เป็นความลับไวรัสโรค Borna (BDV) แม้ว่าการติดเชื้อตามธรรมชาติมีเพียงการยืนยันที่จะเกิดขึ้นในม้าและแกะช่วงโฮสต์ที่มีศักยภาพของ BDV รวมถึงการเลี้ยงลูกด้วยนมและนกอื่น ๆ การติดเชื้อของนกหนูและลิงจะนำไปสู่​​การแสดงออกของโปรตีน BDV ในเนื้อเยื่อระบบประสาทสมองอักเสบและพฤติกรรมที่ผิดปกติ (1) แอนติบอดีปฏิกิริยากับโปรตีน BDV ได้รับการพบในผู้ป่วยที่มีโรค neuropsychiatric บอกความเป็นไปได้ที่ BDV หรือไวรัสที่เกี่ยวข้องอาจจะเป็นเชื้อโรคของมนุษย์ (2-7) แม้ว่าตัวแทนยังไม่ได้รับการยืนยันจากกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนวิธีโมเลกุลมีการอำนวยความสะดวกของตัวละครบางส่วน BDV cDNA โคลนได้รับการแยกโดยการตรวจคัดกรอง subtractive ของห้องสมุดจัดทำขึ้นจากสมองของหนูที่ติดเชื้อ (8) และเซลล์ที่ติดเชื้อ (6) การวิเคราะห์จิตบำบัด BDV ในภาคเหนือและในแหล่งกำเนิดการทดลองผสมข้ามพันธุ์ได้ชี้ให้เห็นว่า BDV จะเป็นไวรัส RNA สายเดี่ยวสายกับจีโนม 8.5 (8, 9) ถึง 10 kilobases (KB) (6) ขั้วของจีโนมของไวรัสที่ได้รับความขัดแย้ง (6, 8-11) ที่นี่เรารายงานว่าอนุภาค BDV ติดเชื้อมีขั้วลบ RNA 8.5 กิโลและแสดงให้เห็นว่า mRNAs ไวรัสมีการสังเคราะห์ในนิวเคลียสของเซลล์ วัสดุและวิธีการเตรียมอนุภาคไวรัส Oligo / TL, โอลิโกเดนโดรไซต์เซลล์ของมนุษย์ (12) ได้รับการติดเชื้อที่หลายหลากของการติดเชื้อประมาณ 0.5 โฟกัสการจัดตั้งหน่วยต่อเซลล์โดยใช้ BD homogenate สมองของหนู (สายพันธุ์ V ทางเดินของหนูที่หก) (13-15) เซลล์ที่ถูกส่งผ่านไปทุก 2-3 วันและใช้สำหรับการเตรียมอนุภาคไวรัสในทางเดินที่ 10 ถึง 25 ติดเชื้อไวรัส titered ในระบบเซลล์ ELISA (16) ชั้นเซลล์ไหลมารวมกัน (1-2 x 108 เซลล์) ได้รับการล้างครั้งเดียวกับ 20 มิลลิเมตร Tris-HCl (pH 7.4) ซ้อนทับกับ 20 มม Tris HCl ค่า pH 7.4 / 250 มิลลิ MgCl2 (บัฟเฟอร์ Tris-Mg250) และบ่มเป็นเวลา 1.5 ชั่วโมงที่ 370C จะปล่อยไวรัสมือถือที่ถูกผูกไว้ ใสถูกเก็บรวบรวมและหมุนครั้งที่สอง 2500 xg เป็นเวลา 5 นาที ใสชี้แจงถูกนำตัวไป 0.002% Zwittergent 3-14 (เกียว) และบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง อนุภาคไวรัสถูกเม็ดที่ 100,000 xg เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 200C, resuspended ใน 20 mM Tris HCl ค่า pH 7.4 / 125 มิลลิ MgCl2 (Tris-Mg 2 กันชน) และรับการรักษาด้วย DNase (Boehringer Mannheim) ที่ 50 Ag / ml และ RNase (Boehringer Mannheim) ที่ 50, ไมโครกรัม / มิลลิลิตรเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 3TC อนุภาคไวรัสถูกเม็ดที่ 100,000 xg เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 40C และ resuspended ใน Tris-Mg, 25 บัฟเฟอร์สำหรับการไทเทรตไวรัสหรือการสกัดกรดนิวคลีอิก สกัดจาก RNAs Partickles ไวรัส การเตรียมอนุภาคไวรัสที่ถูกผสมกับปริมาณที่เท่ากันของบัฟเฟอร์สลาย 2x (100 มิลลิ EDTA / 10% o SDS / 2% 2-mercaptoethanol / 400 กรัมของโปรตีน K ต่อมิลลิลิตร / 100 มิลลิ Tris-HCl ค่า pH 8.3) และบ่มเป็นเวลา 45 นาทีที่ 650C หลังจากที่ระบายความร้อนที่อุณหภูมิห้อง, การเตรียมการมาสกัดเป็นครั้งที่สองที่มีฟีนอล / คลอโรฟอร์ม / เครื่องดื่มแอลกอฮอล์ isoamyl เฟสน้ำสุดท้ายที่ถูกเสริมด้วยไกลโคเจนถึง 40 Ag / ml และวางไว้ที่ -200C ค้างคืนกับ 1 / ปริมาณ 10 ของ 3 M acetate โซเดียม (pH 5.0) และ 1 ปริมาณของเครื่องดื่มแอลกอฮอล์ isopropyl กรดนิวคลีอิกตกตะกอนถูกเม็ดที่ 20,000 xg เป็นเวลา 30 นาทีที่ 40 (และ resuspended ใน H20 / 0.5% SDS สำหรับการวิเคราะห์การผสมพันธุ์ภาคเหนือ. อาร์เอ็นเอของเซลล์ทั้งหมดจากสมองของหนูถูกสกัดโดยทำให้เป็นเนื้อเดียวกันใน isothiocyanate Guanidinium และการหมุนเหวี่ยงผ่านซีเซียมคลอไรด์ (17). ทั้งหมด อาร์เอ็นเอของเซลล์จากเซลล์เพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อถูกสกัดด้วย Guanidinium isothiocyanate / กรดฟีนอล (18). อาร์เอ็นเอ Nuceocytoplsmic ขนส่ง. RNA ทดลองขนส่ง nucleocytoplasmic ได้ทำตามวิธีการของ Schroder et al. (19). ที่ไม่ติดเชื้อหรือเสมอ BDVinfected เซลล์ C6 (วัฒนธรรมประเภทอเมริกัน คอลเลกชัน) ได้รับการระบายความร้อนบนน้ำแข็งล้างสามครั้งด้วยบัฟเฟอร์ HB (10 mM Tris-HCl ค่า pH 7.5 / 1 มิลลิ MgCl2 / 1 มิลลิ EGTA) และหดหายแล้วบนน้ำแข็งในบัฟเฟอร์ HB / i มิลลิ phenylmethylsulfonyl ใช้ฟลูออไรโฮโมจีไน Dounce ( 40 จังหวะกับ "A" สาก). ระงับถูกนำตัวถึง 50% 6 (น้ำหนัก / ปริมาตร) ซูโครส / 20 มิลลิ Tris HC1 ค่า pH 7.5 / 1 มิลลิ MgCl2 และหมุนกว่า 60o (น้ำหนัก / ปริมาตร) ซูโครส / 20 มิลลิเมตร Tris-HCl ค่า pH 7.5 / 1 เบาะมิลลิ MgCl2 ที่ 130,000 xg เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 40C นิวเคลียสถูก resuspended ในบัฟเฟอร์การขนส่ง (25 mMTris-HC1 ค่า pH 7.5 / 250 มิลลิซูโครส / 0.5 มิลลิ CaCl2 / 0.3 มิลลิ MnCl2 / 25 มิลลิ KCI / 5 มิลลิเปอร์ / 5 มิลลิ 2-mercaptoethanol / tRNA ยีสต์ที่ 300 เหยือก / ml) นิวเคลียสถูก resuspended ในส่วนลงตัว (840 อัล) ส่วนลงตัวบุคคลที่มีการผสมกับ 160 1D ทั้งระบบ ATPregenerating (15.6 มิลลิเอทีพี / 31.2 มิลลิ Na2HPO4 / 31.2 มิลลิ Phosphoenolpyruvate / ไคเนสไพรูที่ 218 หน่วย / ml) หรือระบบบัฟเฟอร์เดียวกันโดยไม่ต้อง ATP (ควบคุม -ATP) จลนศาสตร์ขนส่งได้ดำเนินการที่ 300C ปฏิกิริยาก็หยุดบนน้ำแข็งที่ 0, 15 หรือ 40 นาทีและหมุนที่ 1000 xg เป็นเวลา 4 นาทีที่ 00C supernatants (postnuclear เศษส่วน) ถูกสกัดด้วยฟีนอล / คลอโรฟอร์ม / isoamyl แอลกอฮอล์วางไว้ที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียสค้างคืนกับ 1 / ปริมาณ 10 ของ 3 M acetate โซเดียมย่อ: BDV ไวรัสโรค Borna; ORF อ่านเปิดกรอบ tPresent ที่อยู่: กรมวิทยา, มหาวิทยาลัยแคลิฟอร์เนียเออร์ไวน์, แคลิฟอร์เนีย 92717. 1 ในผู้ที่พิมพ์การร้องขอควรได้รับการแก้ไข

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

proc . NATL . ราช . สภาวะโลกร้อน อเมริกา Vol . 89 , . 11486-11489 เดือนธันวาคม 2535 ประสาทชีววิทยาไวรัสโรคบอร์นา , ลบ strand RNA ไวรัสมากในนิวเคลียสของเซลล์ที่ติดเชื้อ ( ติดเชื้อ / ความผิดปกติทางระบบประสาทส่วนกลาง ) โทมัส briese * T , ฮวน คาร์ลอส เด ลา torret Ann Lewis §โครงการลุดวิก , * , และ ยน Lipkin §¶ * สถาบันไวรัสวิทยา มหาวิทยาลัยอิสระเบอร์ลิน nordufer 20 ,65 D 1000 เบอร์ลิน สหพันธ์สาธารณรัฐเยอรมนี tdepartment ของ neuropharmacology สถาบันวิจัย Scripps 10666 เหนือ , ใกล้ถนน , La Jolla , CA 92037 และ idepartments ของกายวิภาคศาสตร์และชีววิทยา ระบบประสาท และจุลชีววิทยาและอณูชีววิทยา มหาวิทยาลัยแคลิฟอร์เนีย เออร์ไวน์ , แคลิฟอร์เนีย 92717 สื่อสารโดย คาร์ลตัน กาดูเซ็ก กันยายน 2535 ( 1 ที่ได้รับความคิดเห็นที่ 22 เมษายน1992 ) โรคไวรัสบอร์นานามธรรม , เอินเคิสได้ตัวแทนติดเชื้อ สาเหตุ immune-mediated ทางประสาทวิทยาโรคในหลากหลายของโฮสต์ของสัตว์ และอาจเกี่ยวข้องกับพยาธิกำเนิดของโรค neuropsychiatric คัดสรรในมนุษย์ รายงาน 1nitial ชี้ให้เห็นว่าโรคไวรัสบอร์นาเป็นไวรัส RNA singlesranded .เราอธิบายที่นี่วิธีการ isolatin อนุภาคของไวรัสที่ได้รับอนุญาตการแตกหักของโครโมโซมเป็น RNA containg เป็นขั้วที่เป็นลบ นอกจากนี้ยังแสดงให้เห็นว่ารหัสไวรัสจะคัดลอกในนิวเคลียส โรคบอร์นาเป็น immune-mediated พฤติกรรมโรคที่เกิดจากการติดเชื้อกับตัวแทน Unclassified ไวรัสโรคบอร์นา ( bdv )แม้ว่าการติดเชื้อในธรรมชาติมีเพียงได้รับการยืนยันที่จะเกิดขึ้นในม้าและแกะ มีศักยภาพเป็นเจ้าภาพช่วง bdv รวมถึงสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมและนก การติดเชื้อในคน นก หนู และสัตว์ที่นำไปสู่การแสดงออกของโปรตีนในเนื้อเยื่อประสาท bdv , เยื่อหุ้มสมองกับสมองอักเสบและพฤติกรรมแปรปรวน ( 1 )แอนติบอดีปฏิกิริยากับโปรตีน bdv ได้รับพบได้ในผู้ป่วยโรค neuropsychiatric ชี้ให้เห็นความเป็นไปได้ที่ bdv หรือเกี่ยวข้องไวรัสอาจจะก่อให้เกิดโรคกับมนุษย์ ( 2-7 ) แต่เจ้าหน้าที่ไม่ได้ระบุโดยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนชนิดส่องกราด โมเลกุลของมันมีแนวทางสนับสนุนบางส่วน ทำให้bdv cDNA โคลนได้ถูกแยกโดยการใช้การของห้องสมุดที่เตรียมจากไวรัสสมองหนู ( 8 ) และเซลล์ที่ติดเชื้อ ( 6 ) การวิเคราะห์ bdv transcripts ในภาคเหนือและใน situ hybridization การทดลองได้แสดงให้เห็นว่า bdv น่าจะเดียวควั่น RNA ไวรัสกับจีโนมของ 8.5 ( 8 , 9 ) 10 กิโลเบส ( KB ) ( 6 ) ขั้วของจีโนมของไวรัสมีการโต้แย้ง ( 68-11 ) ที่นี่เรารายงานว่าอนุภาค bdv ติดเชื้อประกอบด้วยลบขั้ว 8.5-kb RNA และแสดงให้เห็นว่า ไวรัสรหัสถูกสังเคราะห์ในเซลล์ นิวเคลียส วัสดุและวิธีการเตรียมอนุภาคไวรัส โอลิโก / TL , มนุษย์เซลล์โอลิโกเดนโดรไซต์ไลน์ ( 12 ) , ติดเชื้อที่หลายหลากของการติดเชื้อประมาณ 0.5 มุ่งเน้นสร้างหน่วยต่อเซลล์ใช้ BD สมองหนูอน ( สายพันธุ์ V ,หนูเดิน 6 ) ( 9 ) เซลล์ก็ผ่านทุก 2-3 วัน และใช้สำหรับการเตรียมอนุภาคไวรัสในหัวข้อ 10 ถึง 25 โรคติดเชื้อไวรัสในเซลล์ ระบบ titered ) ( 16 ) ชั้นเซลล์กระจู๋กระจี๋ ( 1-2 x 108 เซลล์ ) ซักครั้งกับ HCl หรือ 20 มม. ( pH 7.4 ) หุ้มด้วย HCl หรือ 20 มม. , pH 7.4/250 มม. ชุด ( tris-mg250 buffer ) โดย 1 .5 ชั่วโมงใน 370c ปล่อยเซลล์จำกัดไวรัส รวบรวมและนำปั่นสองครั้งที่ 2500 x g 5 นาทีมีสูง ถูกนำ zwittergent 0.002 % 3-14 ( calbiochem ) และบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิห้อง อนุภาคไวรัสเป็นเม็ดที่ 100000 x g เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ที่ 200 resuspended ใน HCl หรือ 20 มม. , pH 7.4/125 มม. ชุด ( โดยมก. , 2 บัฟเฟอร์ )และรักษาด้วยตรวจหา ADNase ( Boehringer Mannheim ) ที่ 50 AG / ml และเลส ( Boehringer Mannheim ) ที่ 50 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตรเป็นเวลา 1 ชั่วโมง ใน 3tc . อนุภาคไวรัสเป็นเม็ดที่ 100000 x g เป็นเวลา 1 ชั่วโมงและในบริษัทที่ 40C resuspended มิลลิกรัม , 25 บัฟเฟอร์สำหรับไวรัสที่มีหรือการสกัดกรดนิวคลีอิก . การสกัด partickles RNAs จากไวรัสการเตรียมอนุภาคไวรัสที่ถูกผสมด้วยปริมาณเท่ากัน 2x การสลายบัฟเฟอร์ ( 100 mM EDTA / 10 % o t / 2 เพียงอย่างเดียว / 400 pg ของโปรตีน K ต่อมิลลิลิตร / 100 มม. หรือ HCl , pH 8.3 ) และบ่มเป็นเวลา 45 นาทีที่ 650c หลังจากเย็นที่อุณหภูมิห้อง , การเตรียมการสกัดด้วย phenol / 2 คลอโรฟอร์ม / แอลกอฮอล์ในปริมาณ .ขั้นตอนสุดท้ายคือน้ำเติมไกลโคเจน 40 AG / ml และวางไว้ที่ - 200 ค้างคืนกับ 1 / 10 ของ 3 ปริมาณโซเดียมอะซีเตท ( pH 5.0 ) และ 1 ปริมาณไอโซโพรพิลแอลกอฮอล์ ตกตะกอนกรดนิวคลีอิกเป็นเม็ดที่ 20 , 000 x G สำหรับ 30 นาทีที่ 40 ( และ resuspended ใน H20 / 0.5 % SDS เพื่อการวิเคราะห์ ( ภาคเหนือ )อาร์เอ็นเอเซลล์ทั้งหมดจากสมองหนูถูกสกัดโดยการปั่นเหวี่ยงผ่าน guanidinium ในไอโซไธโอไซยาเนตและซีเซียมคลอไรด์ ( 17 ) อาร์เอ็นเอเซลล์ทั้งหมด เซลล์เพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อจากสารไอโซไธโอไซยาเนต guanidinium / กรดฟีนอล ( 18 ) ประสิทธิภาพการขนส่ง nuceocytoplsmic . อาร์เอ็นเอ nucleocytoplasmic การขนส่งการทดลองเป็นไปตามวิธีชรอเดอร์ et al . ( 19 )มาก่อน หรือผู้ bdvinfected C6 เซลล์ ( ประเภทคอลเลกชันวัฒนธรรมอเมริกัน ) ลงบนน้ำแข็ง ซักสามครั้งกับ HB บัฟเฟอร์ ( 10 มม. นอกจากนี้ กรดไฮโดรคลอริก pH 7.5/1 มม. ชุด / 1 มม. หน่วย ) , แล้วบดน้ำแข็งใน HB บัฟเฟอร์ / ฉันฟลูออไรด์ phenylmethylsulfonyl มม. ใช้ทัดทา ( 40 จังหวะด้วย " A " สาก ) ถูกระงับเอา 50% 6 ( น้ำหนัก / ปริมาตร ) ซูโครส / 20 มิลลิเมตร นอกจากนี้ ภาวะที่ pH 75 / 1 ชุดมม. และปั่นไป 60o ( น้ำหนัก / ปริมาตร ) ซูโครส / 20 mm หรือ HCl , pH 7.5/1 มม. ชุดเบาะที่ 130 , 000 x g 1 ชม. ที่ 40C . นิวเคลียสเป็น resuspended ขนส่ง ( 25 mmtris-hc1 ในบัฟเฟอร์ pH 7.5/250 มม. 0.5 / 0.5 มม. ผลิต / 0.3 มม. mncl2 / kci / 25 มม. 5 มิลลิเมตร spermidine / 5 มม. อย่างเดียว / ยีสต์การเมารถ 300 เหยือก / ml ) นิวเคลียสเป็น resuspended ในเฉยๆ ( 840 อัล )ส่วนที่หารลงตัวแต่ละตัวผสมกับ 160 1D ทั้งระบบ ( atpregenerating 15.6 มม. เอทีพี / 31.2 มม. na2hpo4 / 31.2 มม. Pyruvate kinase ในฟอสโฟอีนอลไพรูเวต / 218 หน่วย / มล. ) หรือระบบเดียวกันโดยไม่ต้องบัฟเฟอร์เอทีพี ( ATP - ควบคุม ) จลนศาสตร์ของการขนส่ง มีการปฏิบัติที่ 300 C . ปฏิกิริยาหยุดบนน้ำแข็งที่ 0 , 15 , หรือ 40 นาที และสานที่ 1000 x g 4 นาทีที่แกนเดียว .supernatants ( postnuclear เศษส่วน ) ถูกสกัดด้วยคลอโรฟอร์มในปริมาณแอลกอฮอล์ฟีนอล / / อยู่ที่ - 20oc ค้างคืนกับปริมาณ 1 / 10 ของ 3 M โซเดียมอะซิเตตย่อ : bdv บอร์นา , ไวรัสโรค ; ORF , กรอบเปิดอ่าน . ที่อยู่ tpresent : ภาควิชาประสาทวิทยา มหาวิทยาลัยแคลิฟอร์เนีย เออร์ไวน์ , แคลิฟอร์เนีย 92717 . ที่พิมพ์หน้า 1to ควรจะ addressed .