2.6. Epifluorescence and phase-cont

2.6. Epifluorescence and phase-contrast microscopy
The effect of various pressures on the membrane potential and
membrane integrity of L. monocytogenes LGB was investigated on
samples specifically prepared for microscopy observations. Pasteurized
smoothies were aseptically centrifuged at 12,000  g to remove
insoluble matter, inoculated as described above and treated at the
conditions of the D and E treatments (Table 1). Cells were recovered
from the samples before and after treatments by gentle centrifugation
(400g,10 min),washed (0.1% peptonewater) and the resulting
pellet was used for staining by two fluorescent dye preparations.
The two component LIVE/DEAD BacLight kit (Molecular Probes,
Leiden, The Netherlands) was used to observe the membrane
integrity. Staining was performed on a cell pellet from a 1 mL
sample according to the manufacturer suggestions, and 5 mL of the
stained suspension was spotted onto a slide for microscopy. Untreated
and thermally inactivated L. monocytogenes cultures were
used as positive and negative controls, respectively.
The lipophilic cationic carbocyanine dye JC-1 (Molecular Probes)
exhibits a potential-dependent membrane permeation. The critical
dye concentration is achieved in the cytoplasm when membranes
are polarized, allowing the yellow/red fluorescing J aggregates to
form. In cells with depleted membrane potentials only monomers
of the dye are observed in the cytoplasm (green fluorescence)
(Cossarizza, Baccarani-Contri, Kalashnikova, & Franceschi, 1993).
Therefore, according to the potential depletion intensity, fluorescence
ranges from red to green.
JC-1 was dissolved in DMSO to a stock concentration of 10 mg/
mL (w/v) and stored in the dark until use. After JC-1 dilution (1:100
in PBS), 0.5 mL were used to suspend the cell pellet derived from
0.5 mL of sample. Then, the sample was incubated in the dark at
37 C for 15 min, washed twice and the dyed cells were suspended
in 0.3 mL of PBS before microscopy observations (5 mL).
Due to the short half-life of the stain, the digital images were
rapidly acquired using an epifluorescence microscope BX52
(Olympus Italia, Segrate, I) coupled to a ColorView II camera (SIS,
Munster, DE) and equipped with a double-band pass fluorescence
optical filter set for the simultaneous imaging of fluorescein
(485 ± 15 nm ex, 505 ± 15 nm em) and Texas red dyes (585 ± 15 nm
ex, 625 ± 15 nm em). The apparatus was also equipped with a
phase-contrast optic.
Images of each sample were acquired from 20 fields each containing
200e300 cells in order to approximately estimate the
number of cells in different physiological states.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.6 microscopy Epifluorescence และระยะความคมชัดผลของแรงกดดันต่าง ๆ ในเมมเบรนมีศักยภาพ และความสมบูรณ์ของเยื่อของ L. monocytogenes LGB ถูกสอบสวนในตัวอย่างที่เตรียมไว้โดยเฉพาะสำหรับการสังเกต microscopy Pasteurizedน้ำปั่นได้ centrifuged ที่ g 12000 เอา asepticallyขึ้นเรื่อง inoculated ที่อธิบายข้างต้น และถือว่าในการเงื่อนไขของการรักษาที่ D และ E (ตาราง 1) เซลล์ที่ถูกกู้คืนจากตัวอย่างก่อน และ หลังการบำบัดโดย centrifugation อ่อนโยน(400 กรัม 10 นาที), หิน (peptonewater 0.1%) และการส่งผลเม็ดใช้สำหรับย้อมสีโดยเตรียมย้อมฟลูออเรสสองชุด LIVE/ตาย BacLight คอมโพเนนต์สองที่ (Probes โมเลกุลไลเดน ประเทศเนเธอร์แลนด์) ถูกใช้เพื่อสังเกตการเมมเบรนความสมบูรณ์ของการ ย้อมสีทำตามเม็ดเซลล์จาก 1 mLตัวอย่าง ตามคำแนะนำของผู้ผลิต และ 5 mL ของระงับทิ้งคราบด่างถูกลงบนภาพนิ่งสำหรับ microscopy ไม่ถูกรักษาและยกเลิกแพ L. monocytogenes วัฒนธรรมใช้เป็นตัวควบคุมบวก และลบ ตามลำดับย้อม lipophilic cationic carbocyanine เจซี-1 (Probes โมเลกุล)การจัดแสดงการซึมผ่านเมมเบรนขึ้นอยู่กับศักยภาพ ที่สำคัญความเข้มข้นของสีย้อมทำในไซโทพลาซึมเมื่อเยื่อหุ้มมีโพลาไรซ์ สีเหลือง/แดง fluorescing J เพิ่มเพื่อช่วยให้แบบฟอร์มการ ในเซลล์ที่มีเมมเบรนพิกศักยภาพเพียง monomersของสีที่พบในไซโทพลาซึม (fluorescence สีเขียว)(Cossarizza, Baccarani Contri, Kalashnikova และ Franceschi, 1993)ดังนั้น ตามศักยภาพการลดลงของความเข้ม fluorescenceช่วงสีแดงกับสีเขียวเจซี-1 ถูกละลายใน DMSO เพื่อความเข้มข้น 10 มก.หุ้น /มล (w/v) และเก็บไว้ในมืดจนใช้ หลังจากเจือจางเจซี-1 (1: 100ใน PBS), ใช้ 0.5 mL ไประงับเม็ดเซลล์มา0.5 มล.ของตัวอย่าง แล้ว ตัวอย่างที่ incubated ในมืดที่37 C 15 นาที ล้างสองและเซลล์ที่ย้อมถูกหยุดชั่วคราวใน 0.3 mL ของ PBS ก่อนสังเกต microscopy (5 มล.)เนื่องจากมี half-life สั้นของคราบ ภาพดิจิตอลได้อย่างรวดเร็วมาใช้กล้องจุลทรรศน์การ epifluorescence BX52(เลียโอลิมปัส Segrate ฉัน) ควบคู่กับกล้อง ColorView II (SISเสาะ DE) พร้อม fluorescence ผ่านสองวงตัวกรองแสงที่ตั้งค่าสำหรับภาพพร้อมของ fluorescein(485 nm ± 15 อดีต เอ็ม 505 ± 15 nm) และสีแดงเท็กซัส (585 ± 15 nmอดีต 625 ± 15 nm ยาว) เครื่องยังไม่พร้อมกับการระยะความคมชัดแสงรูปภาพของแต่ละอย่างได้รับมาจาก 20 เขตข้อมูลแต่ละที่ประกอบด้วยเซลล์ 200e300 เพื่อประเมินประมาณการจำนวนเซลล์ในอเมริกาสรีรวิทยาแตกต่างกัน

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.6 Epifluorescence และเฟสตรงกันข้ามกล้องจุลทรรศน์
ผลกระทบจากแรงกดดันต่างๆบนเมมเบรนที่มีศักยภาพและ
ความสมบูรณ์ของเมมเบรนของ L. monocytogenes LGB ถูกตรวจสอบใน
ตัวอย่างที่เตรียมไว้เป็นพิเศษสำหรับการสังเกตกล้องจุลทรรศน์ พาสเจอร์ไรส์
สมูทตี้ถูกปั่นปลอดเชื้อที่ 12,000? กลบ
เรื่องที่ไม่ละลายเชื้อตามที่อธิบายไว้ข้างต้นและรับการรักษาที่
เงื่อนไขของการพัฒนาและการรักษาอี (ตารางที่ 1) เซลล์ที่ถูกกู้คืน
จากตัวอย่างก่อนและหลังการรักษาโดยการหมุนเหวี่ยงอ่อนโยน
(400 กรัม, 10 นาที) ล้าง (0.1% peptonewater) และส่งผลให้
เม็ดที่ใช้สำหรับการย้อมสีสองเตรียมการย้อมสีเรืองแสง.
สองสดองค์ประกอบ / ชุด BacLight ตาย (พร็อบโมเลกุล
Leiden, เนเธอร์แลนด์) ถูกใช้ในการสังเกตเยื่อ
สมบูรณ์ การย้อมสีได้รับการดำเนินการในตะกอนเซลล์จากมิลลิลิตร 1
ตัวอย่างตามข้อเสนอแนะของผู้ผลิตและ 5 มิลลิลิตร
ระงับเลือดเป็นด่างบนสไลด์สำหรับกล้องจุลทรรศน์ ได้รับการรักษา
และยับยั้งความร้อน L. monocytogenes วัฒนธรรมที่ถูก
นำมาใช้เป็นตัวควบคุมบวกและลบตามลำดับ.
ประจุบวก lipophilic carbocyanine ย้อม JC-1 (วัดระดับโมเลกุล)
จัดแสดงนิทรรศการซึมผ่านเมมเบรนที่มีศักยภาพขึ้นอยู่กับ ที่สำคัญ
ความเข้มข้นของสีย้อมจะประสบความสำเร็จใน cytoplasm เมื่อเยื่อ
มีขั้วให้เหลือง / สีแดงเรืองแสง J มวลที่จะ
สร้าง ในเซลล์ที่มีศักยภาพเยื่อหมดโมโนเมอร์เฉพาะ
ของสีย้อมที่มีการตั้งข้อสังเกตในพลาสซึม (เรืองแสงสีเขียว)
(Cossarizza, Baccarani-Contri, Kalashnikova และ Franceschi, 1993).
ดังนั้นตามความเข้มของการสูญเสียที่อาจเกิดขึ้นการเรืองแสง
ช่วงจากสีแดงเป็นสีเขียว .
JC-1 ถูกละลายใน DMSO ที่ความเข้มข้นหุ้น 10 มิลลิกรัม /
มิลลิลิตร (w / v) และเก็บไว้ในที่มืดจนการใช้งาน หลังจาก JC-1 เจือจาง (1: 100
ในพีบีเอส) 0.5 mL ถูกนำมาใช้ในการระงับตะกอนเซลล์ที่ได้จาก
0.5 มิลลิลิตรของกลุ่มตัวอย่าง จากนั้นกลุ่มตัวอย่างถูกบ่มในที่มืดที่
37 องศาเซลเซียสนาน 15 นาทีล้างสองครั้งและเซลล์ย้อมถูกระงับ
ใน 0.3 มิลลิลิตรพีบีเอสก่อนที่จะสังเกตกล้องจุลทรรศน์ (5 มิลลิลิตร).
เนื่องจากครึ่งชีวิตสั้น ๆ ของคราบ ภาพดิจิตอลได้
มาอย่างรวดเร็วโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ epifluorescence BX52
(โอลิมปั Italia, Segrate ผม) คู่กับกล้อง Colorview II (SIS,
มอนสเตอร์, DE) และติดตั้งผ่านสองวงเรืองแสง
กรองแสงที่ตั้งไว้สำหรับการถ่ายภาพพร้อมกันของ fluorescein
( 485 ± 15 นาโนเมตรอดีต 505 ± 15 นาโนเมตร em) และเท็กซัสสีแดง (585 ± 15 นาโนเมตร
อดีต 625 ± 15 นาโนเมตร em) เครื่องยังมาพร้อมกับ
แก้วนำแสงเฟสตรงกันข้าม.
รูปภาพของแต่ละตัวอย่างได้มาจาก 20 สาขาแต่ละที่มี
200e300 เซลล์เพื่อประมาณประเมิน
จำนวนของเซลล์ในรัฐทางสรีรวิทยาที่แตกต่างกัน