2.2. Sample preparation for proteom

2.2. Sample preparation for proteomic analysis
Thirteen cows (7 CTL and 6 LFC) were subjected to follicular aspiration and in 12 cows (6 from each
group), E2-active follicles were found. Two of these cows (1 CTL and 1 LFC) had 2 E2-active follicles,
and as we preferred to examine cows with 1 dominant follicle, these animals were excluded from
further analysis. In total, the characteristics of the preovulatory (E2-active) follicles and proteomic
analysis were performed for follicles from 10 cows, 5 CTL cows and 5 LFC. Each FF sample was
subjected to buffer exchange with 50 mM ammonium bicarbonate using a 3-kDa molecular weight
cutoff filter (Amicon, Millipore, USA). Protein concentration from each sample was determined by its
reading at 280 nm in a NanoDrop spectrophotometer (Thermo Scientific, USA) and comparison to a
calibration curve using bovine serum albumin in 50 mM ammonium bicarbonate. Each sample contained
100 mg total protein. Proteins were denatured using 8 M urea and incubated for 10 min at room
temperature followed by addition of 5 mM dithiothreitol and incubation for 1 h at room temperature.
Urea was diluted five times and proteins were alkylated with 10 mM iodoacetamide (Sigma, USA) in
the dark for 30 min at 21 °C. Proteins were then subjected to digestion with trypsin (Promega,
Madison, WI, USA) at a 1:50 trypsin-to-protein ratio for 16 h at 37 °C [3]. The digestions were stopped
by trifluroacetic acid (1% v/v) Samples were desalted using solid-phase extraction columns (Oasis
HLB, Waters, Milford, MA, USA) and stored at 80 °C until further analysis.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.2. ตัวอย่างการเตรียมการสำหรับการวิเคราะห์ proteomicสิบสามวัว (7 CTL และ 6 LFC) ถูกเจาะทะเยอทะยาน และวัว 12 (6 จากแต่ละกลุ่ม), รูขุมขนใช้งาน E2 พบ สองของวัวเหล่านี้ (1 CTL และ 1 LFC) มีรูขุมขนใช้งาน E2 2และ ตามที่เราต้องการตรวจสอบวัวกับรูขุมขนเด่น 1 สัตว์เหล่านี้ถูกแยกออกจากวิเคราะห์เพิ่มเติม รวม ลักษณะของรูขุมขน (E2 ใช้งานอยู่) และ proteomic preovulatoryดำเนินการวิเคราะห์สำหรับรูขุมขนจาก 10 วัว วัว 5 CTL และ 5 LFC แก้ไขแต่ละอย่าง FFภายใต้การบัฟเฟอร์แลกกับ 50 มม.แอมโมเนียมไบคาร์บอเนตใช้น้ำหนักโมเลกุล 3-kDaตัดตัวกรอง (Amicon มิลลิพอร์ สหรัฐอเมริกา) กำหนดความเข้มข้นโปรตีนจากตัวอย่างแต่ละโดยการอ่านที่ 280 nm ในสเปค NanoDrop (เทอร์โมวิทยาศาสตร์ สหรัฐอเมริกา) และเปรียบเทียบกับการเส้นโค้งของการสอบเทียบโดยใช้วัว serum albumin ในแอมโมเนียมไบคาร์บอเนต 50 มม. แต่ละอย่างที่มีอยู่โปรตีนทั้งหมด 100 มิลลิกรัม โปรตีนถูกลแปลงใช้ยูเรีย 8 เมตร และ 10 นาทีห้องได้รับการกกอุณหภูมิตาม ด้วย 5 มม. dithiothreitol และบ่มสำหรับ 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องยูเรียถูกเจือจางห้าครั้ง และโปรตีนถูกคีเลตกับ 10 มม. iodoacetamide (ซิกม่า สหรัฐอเมริกา) ในมืด 30 นาทีที่อุณหภูมิ 21 องศาเซลเซียส โปรตีนแล้วถูกย่อยด้วยทริปซิน (Promegaเมดิสัน WI สหรัฐอเมริกา) เวลา 1:50 อัตราส่วนทริปซินโปรตีนสำหรับ 16 ชม.ที่อุณหภูมิ 37 ° C [3] Digestions ที่ถูกหยุดโดยกรด trifluroacetic (1% v/v) ตัวอย่างถูก desalted โดยใช้คอลัมน์แยกเฟสของแข็ง (โอเอซิสHLB น่านน้ำ ลฟอร์ด MA, USA) และเก็บไว้ที่ 80 ° C จนถึงการวิเคราะห์

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.2 การเตรียมตัวสำหรับการวิเคราะห์โปรตีน
สิบสามวัว (7 CTL และ 6 LFC) ถูกยัดเยียดให้ความทะเยอทะยานและ follicular 12 วัว (6 จากแต่ละ
กลุ่ม), รูขุม E2-ใช้งานถูกพบ สองของวัวเหล่านี้ (1 CTL และ 1 LFC) มีรูขุม 2 E2-ใช้งาน
และในขณะที่เราต้องการที่จะตรวจสอบวัว 1 รูขุมขนเด่น, สัตว์เหล่านี้ได้รับการยกเว้นจาก
การวิเคราะห์ต่อไป รวมลักษณะของ preovulatory นี้ (E2-ใช้งาน) และรูขุม proteomic
วิเคราะห์ได้ดำเนินการสำหรับรูขุมขนจาก 10 วัววัว 5 CTL และ 5 LFC ตัวอย่าง FF แต่ละคนถูก
ยัดเยียดให้ buffer แลกเปลี่ยนกับขนาด 50 มมแอมโมเนียมไบคาร์บอเนตโดยใช้น้ำหนักโมเลกุล 3 กิโลดาลตัน
กรองตัด (Amicon, อร์ค, สหรัฐอเมริกา) ความเข้มข้นของโปรตีนจากแต่ละตัวอย่างถูกกำหนดโดยตัวของมัน
อ่านที่ 280 นาโนเมตรใน NanoDrop spectrophotometer (Thermo Scientific, สหรัฐอเมริกา) และเมื่อเปรียบเทียบกับ
เส้นโค้งการสอบเทียบการใช้เซรั่มอัลบูมิวัวในขนาด 50 มมแอมโมเนียมไบคาร์บอเนต แต่ละตัวอย่างมี
100 มิลลิกรัมโปรตีนทั้งหมด โปรตีนถูกเอทิลแอลกอฮอล์ใช้ 8 เมตรยูเรียและบ่มเป็นเวลา 10 นาทีที่ห้อง
อุณหภูมิตามด้วยนอกเหนือจาก dithiothreitol 5 มิลลิเมตรและมีการบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง.
ยูเรียถูกเจือจางห้าครั้งและโปรตีนเป็น alkylated 10 มิลลิ iodoacetamide (Sigma, สหรัฐอเมริกา) ใน
ความมืดเป็นเวลา 30 นาทีที่ 21 ° C โปรตีนที่ถูกยัดเยียดแล้วย่อยด้วย trypsin (Promega,
Madison, WI, USA) ในอัตราส่วน 01:50 trypsin เพื่อโปรตีนสำหรับ 16 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 ° C [3] ย่อยได้ถูกหยุด
ด้วยกรด trifluroacetic (1% v / v) ตัวอย่าง desalted ใช้คอลัมน์สกัดเฟสของแข็ง (Oasis
HLB น้ำ, ฟอร์ด, MA, USA) และเก็บไว้ที่ 80 องศาเซลเซียสจนการวิเคราะห์ต่อไป

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.2 . การเตรียมตัวอย่างสำหรับวิเคราะห์โปรตีนวัวสิบสาม ( 7 ctl และ 6 กว่าถูก follicular ปณิธานและใน 12 ตัว ( 6 จากแต่ละกลุ่ม ) E2 ปราดเปรียว follicles ที่พบ สองของวัวเหล่านี้ ( 1 ctl 1 กว่า 2 E2 ปราดเปรียว folliclesและเราต้องการที่จะตรวจสอบวัว 1 รูขุมขนเด่น สัตว์เหล่านี้ถูกแยกออกจากการวิเคราะห์ต่อไป รวมคุณลักษณะของ preovulatory ( E2 อยู่ ) และสเตรส์การวิเคราะห์สำหรับรูขุมขนจากจำนวน 10 ตัว 5 ctl วัว 5 ลิเวอร์พูล แต่ละ FF ตัวอย่างต้องแลกกับ 50 mm แอมโมเนียมไบคาร์บอเนตบัฟเฟอร์ ใช้ 3-kda น้ำหนักโมเลกุลตัดตัวกรอง ( amicon มิลลิ , USA ) ความเข้มข้นของโปรตีนจากแต่ละตัวอย่างถูกกำหนดโดยของอ่านที่ 280 nm ใน nanodrop Spectrophotometer ( เทอร์โมวิทยาศาสตร์ , USA ) และเปรียบเทียบกับเส้นโค้งสอบเทียบโดยใช้อัลบูมินในแอมโมเนียมไบคาร์บอเนต 50 มิลลิเมตร แต่ละตัวอย่างประกอบด้วยรวม 100 มิลลิกรัม โปรตีน โปรตีนถูกใช้โดยใช้ 8 M ยูเรียและบ่มเป็นเวลา 10 นาที ที่ห้องอุณหภูมิตามด้วยนอกเหนือจาก 5 มม. บัตรแข็งและบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องยูเรียเป็นจำนวน 5 ครั้ง และโปรตีนเป็น alkylated 10 มม. iodoacetamide ( Sigma , USA )ที่มืดเป็นเวลา 30 นาทีที่ 21 องศา โปรตีนจึงต้องตัดด้วยเอนไซม์ ( promega ,Madison , WI , USA ) ในอัตราส่วน 1 : 50 เอนไซม์โปรตีน 16 ชั่วโมง 37 ° C [ 3 ] การ digestions ถูกหยุดโดย trifluroacetic acid ( 1 % v / v ) จำนวน desalted ส่วนการสกัดโดยใช้คอลัมน์ ( โอเอซิสhlb น้ํา มิลฟอร์ด , MA , USA ) และเก็บรักษาที่อุณหภูมิ 80 องศา C จนถึงการวิเคราะห์ต่อไป