[0026] A ไลโปคาลิน มิวทีน of the การเปิดเผย may also be able to ยึดเกาะ an ชิ้นส่วนย่อย ก่อการ ตอบสนองภูมิคุ้มกัน of PCSK9. An ชิ้นส่วนย่อย ก่อการ ตอบสนองภูมิคุ้มกัน of PCSK9 is a ชิ้นส่วนย่อย that has one or more เอพิโทป, mimotopes or other antigenic determinants, and is thus capable of inducing an immune response or against which an antibody can be raised. The ชิ้นส่วนย่อย ก่อการ ตอบสนองภูมิคุ้มกัน may รวมถึง a single เอพิโทป or may have a plurality of เอพิโทป. Since an antigen-presenting system, e.g. a carrier protein, may be used to provide the size required for recognition by an immune system, no particular size limitation applies to the ชิ้นส่วนย่อย ก่อการ ตอบสนองภูมิคุ้มกัน. Hence, the ชิ้นส่วนย่อย ก่อการ ตอบสนองภูมิคุ้มกัน may also be a "hapten", i.e. a ชิ้นส่วนย่อย that need not be antigenic per se or may have low immunogenicity, in particular due to its small molecular weight and accordingly size. Typically an ชิ้นส่วนย่อย ก่อการ ตอบสนองภูมิคุ้มกัน can, alone or when presented on a carrier, be bound by an immunoglobulin. An ชิ้นส่วนย่อย ก่อการ ตอบสนองภูมิคุ้มกัน of PCSK9 is typically capable of interacting with LDL-R and thereby modulating low density lipoprotein (LDL) particles that circulate in the bloodstream. ในบางรุรุ, an ชิ้นส่วนย่อย ก่อการ ตอบสนองภูมิคุ้มกัน of PCSK9 retains the capability of the full length ligand to be recognized and/or bound by a ไลโปคาลิน มิวทีน according to the การเปิดเผย. For example, the immunogenic :ชิ้นส่วนย่อยmay be an N-terminally and/or C-terminally shortened protein or peptide.
[0027] In รุรุต่างๆ, the ไลโปคาลิน มิวทีน of the การเปิดเผย are able to ยึดเกาะPCSK9 of a น็อนฮิวเมน ไพรเมต PCSK9 (e.g., ไซโนมอลกัส มังกี้ PCSK9 or chimpanzee PCSK9) or an ชิ้นส่วนย่อย ก่อการ ตอบสนองภูมิคุ้มกันของมัน with detectable แอฟฟินิตี้, i.e. with a KD of at least 200 nM. ในบางรุรุ a ไลโปคาลิน มิวทีน of the การเปิดเผย may ยึดเกาะa น็อนฮิวเมน ไพรเมต PCSK9 or an ชิ้นส่วนย่อย ก่อการ ตอบสนองภูมิคุ้มกันของมัน with a KD equal to or less than about 10 nM, about 1 nM or about 0.3 nM. In รุรุต่างๆ, antigen binding portion ยึดเกาะ to mouse PCSK9 or an ชิ้นส่วนย่อย ก่อการ ตอบสนองภูมิคุ้มกันของมัน with a Ko equal to or less than about 10 nM, about 1 nM or about 0.5 nM.
[0028] In รุรุต่างๆ, one or more ไลโปคาลิน มิวทีน of the การเปิดเผย are able to ยึดเกาะฮิวเมน PCSK9.9or an ชิ้นส่วนย่อย ก่อการ ตอบสนองภูมิคุ้มกันของมัน with detectable แอฟฟินิตี้, i.e. with a Ko of at least 200 nM. ในบางรุรุ a ไลโปคาลิน มิวทีน of the การเปิดเผย may ยึดเกาะ ฮิวเมน PCSK9.9 or an ชิ้นส่วนย่อย ก่อการ ตอบสนองภูมิคุ้มกันของมัน with a Ko equal to or less than about 10 nM, about 1 nM, about 0.1 nM, about 0.5 nM, about0.25 nM, about 10 pM or even less.
[0029) In some further embodiments, binding แอฟฟินิตี้ of one or more ไลโปคาลิน มิวทีน to ฮิวเมน PCSK9 or an ชิ้นส่วนย่อย ก่อการ ตอบสนองภูมิคุ้มกันของมัน have been found to be of a Kn below 0.1 nM and ในบางรุรุ be of a Ko equal to or less than about 1 picomolar (pM) (see Figure 7).
[0030) The binding แอฟฟินิตี้ of a ไลโปคาลิน มิวทีน to a selected target, in the present case PCSK9, can be measured and thereby Kn values of a มิวทีน-ligand complex be determine by a multitude of methods known to those skilled in the art. Such methods รวมถึง, but are not limited to, fluorescence titration, competition ELISA, calorimetric methods, such as isothermal titration calorimetry (ITC), and surface plasmon resonance (BIAcore). Examples for such methods are detailed below (See e.g. Example 7).
[0031) In one embodiment, a ไลโปคาลิน มิวทีน of the การเปิดเผย may act as an แอนตาโกนิสต์ of PCSK9. The term "แอนตาโกนิสต์ of PCSK9," ตามที่ใช้ในที่นี้, refers to an agent that is capable of interfere with the binding between PCSK9 and LDL-R. In some cases, a PCSK9 แอนตาโกนิสต์ can be identified by its ability to fully or partically inhibit the binding between PCSK9 and LDL-R.
[0032] Futhermore, a ไลโปคาลิน • มิวทีน of the การเปิดเผย may be competitive for binding ofLDL-R to PCSK9 (see Example 7).
[0033] In addition, a ไลโปคาลิน มิวทีน of the การเปิดเผย may be competitive for binding of a monoclonal antibody ซึ่งประกอบรวมด้วย SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 33 to PCSK9 (see Example 12).
[0034] In a further embodiment, a ไลโปคาลิน มิวทีน of the การเปิดเผย may be able to fully or partially inhibit PCSK9-mediated downregulation of LDL-R. Inhibition occurs, for example, where PCSK9-mediated downregulation of LDL-R, when exposed to a ไลโปคาลิน มิวทีน of the การเปิดเผย, is at least about 10% less, e.g. at least about 25%, 50%, 75% less, or totally inhibited, in comparison to PCSK9-mediated downregulation of LDL-R in the presence of a control or in the absence of the ไลโปคาลิน มิวทีน. In some still further embodiments, a ไลโปคาลิน มิวทีน of the การเปิดเผย may be able to inhibit PCSK9-mediated downregulation of LDL-R in a dose-dependent manner. In some still further embodiments, the inhibition of PCSK9-mediated downregulation of LDL-R can be demonstrated in a HEPG2-cell-based assay as essentially described in Example 13.
[0035) In yet another embodiment, a ไลโปคาลิน มิวทีน of the การเปิดเผย may be able to restore LDL uptake in the presence of PCSK9. In some further embodiments, the restorage of LDL updtake in the presence of PCSK9 can be demonstrated in a HEPG2-cell-based assay as essentially described in Example 11. In some still furtherernbodiments, to set up the assay, HEPG2 cells may be incubated with a fixed concentration of hPCSK9 (e.g. 100 nM) and then
may be titrated with one or more ไลโปคาลิน มิวทีน.
[0036) PCSK.9 can be taken to define a non-natural ligand of hum.an tear ไลโปคาลิน. The term "non-natural ligand" refers to a compound, which does not ยึดเกาะto ไลโปคาลิน น้ำตามนุษย์ เต็มวัย under physiological conditions. The term "ไลโปคาลินนุนุ" ตามที่ใช้ในที่นี้ refers to the ไลโปคาลิน น้ำตามนุษย์ เต็มวัย corresponding to the protein of the SWISS-PROT Data Bank Accession Number P3 l 025, while the ไลโปคาลิน น้ำตามนุษย์ เต็มวัย (SEQ ID NO:
1) does not รวมถึง the N-terminal signal peptide that is รวมถึงd in the sequence of SWISS• PROT Accession Number P31025.
[0037) The amino acid sequence of a มิวทีน of the การเปิดเผย has a high sequence identity to ไลโปคาลิน น้ำตามนุษย์ เต็มวัย (SEQ ID NO: 1). In this context, the amino acid sequence of a มิวทีน of the การเปิดเผย may be substantially similar to the amino acid sequence of ไลโปคาลิน น้ำตามนุษย์ เต็มวัย. A respective sequence of a ไลโปคาลิน มิวทีน of the การเปิดเผย, being substantially similar to the sequences of ไลโปคาลิน น้ำตามนุษย์ เต็มวัย, may have in รุรุต่างๆ at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 82%, at least
85%, at least 87% or at least 90% identity, ที่รวมถึง at least 95% identity, to the sequence of ไลโปคาลิน น้ำตามนุษย์ เต็มวัย (see, for example, Figure 10 and Figure 14), with the proviso that the altered position or sequence is retained.