Since their original discovery (Mar

Since their original discovery (Maraganore et al., 1984), the characterization of Lys49 PLA2 myotoxins found in numerous viperid venoms raised a controversy over their catalytic activity. Given that most purified proteins of this type exhibited very low, but detectable levels of PLA2 activity, some authors favored the interpretation that such catalytic activity was intrinsic, whereas others supported the idea that the activity was caused by trace contamination with catalytically-active Asp49 PLA2s, implying that the Lys49 proteins were enzymatically inactive. The work of Ward and colleagues, at the University of São Paulo in Ribeirão Preto, brought this long-term controversy to an end, thus becoming a milestone in this area of research. For the first time, a recombinant form of a Lys49 toxin (Bothrops jararacussu bothropstoxin I) was analyzed and compared to its natural counterpart isolated from the crude venom. Moreover, a set of point mutations affecting the “catalytic” center of the protein (Lys49/Asp, His48/Gln), or its C-terminal region (Lys122/Ala), were introduced and comparatively studied. Using a sensitive assay, the purified natural toxin presented a detectable, low PLA2 activity, whereas no enzymatic activity could be measured with the recombinant toxin. Importantly, mutating the Lys49 posi- tion back to Asp did not restore enzymatic activity, demonstrating that the lack of catalysis by the Lys49 proteins is not the consequence of this single replacement, but also of additional susbstitutions (i.e., at residues in the calcium-binding loop; Petan et al., 2007). Furthermore, the mutant His48/Gln, which eliminates this essential component of the catalytic machinery of PLA2s, retained the same membrane-damaging activities of the natural toxin, elegantly confirming a number of observations in this field which suggested that Lys49 myotoxins exert their actions by a calcium-independent, non-catalytic mechanism of action, involving their C-terminal region (Lomonte et al., 1994). Results with the recombinant Lys122/Ala mutant, by showing a reduced toxicity, were also in clear support of such prevailing hypotheses on the mode of action of Lys49 myotoxins. This work, and a subsequent series of studies by Ward and colleagues, led to a deeper understanding of the structural determinants involved in the toxicity of the Lys49 PLA2s, overall illustrating the powerful use of molecular biology and protein engineering strategies to
unravel the structure–function relationships in PLA2 toxins from snake venoms.
The following is a personal account of this work by Richard J. Ward: “The relationship between catalytic activity and biological function in the Lys49-PLA2s had been a controversy since their discovery, and it was clear to me that the way to resolve this question was through the characterization of the heterologous protein. Since the late 1990’s I had been working to solve a series of technical difficulties associated with producing bothropstoxin-I from Bothrops jararacussu as a heterologous protein in E. coli. The protein expressed well, but in the form of inclusion bodies, and refolding to obtain the native conformation was proving to be a major obstacle. The project had reached the point where I was trying everything to maintain protein solubility, when by chance I came across the work of Batas and Chaudhuri (1996) describing protein refolding in the presence of a gel-filtration matrix. To my great satisfaction, this method largely solved the solubility issue, and in a short time I had adapted the technique to get reasonable yields of the fully myotoxic heterologous bothropstoxin-I. With the expression system in hand and a group of enthusiastic post-graduate students in the lab, a series of active-site mutants were produced and characterized using a highly sensitive phospholipase A2 assay. The results were clear, the heterologous bothropstoxin-I did not show catalytic activity against synthetic phospholipid mixtures, and the residual lipid hydrolysis that had been previously observed in bothropstoxin-I prepared from the venom was therefore due to contamination from co-purified Asp49- PLA2s. This result then raised the obvious question: if the biological functions of Lys49-PLA2s are not a consequence of lipid hydrolysis, what is causing these effects? Over the last few years much progress has been made to finding an answer to this question, and site-directed mutagenesis has contributed to our understanding as to how a non-catalytic reorganization of membrane lipids coupled with structural transitions in the dimeric form of the Lys49-PLA2s leads to permeabilization of cell membranes, and ultimately to cell death”.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ตั้งแต่การค้นพบของเดิม (Maraganore et al., 1984), คุณสมบัติของ Lys49 PLA2 myotoxins พบในหลาย viperid ดีขึ้นข้อผ่านกิจกรรมของตัวเร่งปฏิกิริยา ที่สุดบริสุทธิ์ของโปรตีน ชนิดนี้จัดแสดงระดับต่ำมาก แต่อาสากิจกรรม PLA2 เขียนบางชื่นชอบการตีความที่กิจกรรมเช่นตัวเร่งปฏิกิริยามี intrinsic ในขณะที่สนับสนุนความคิดที่ว่า กิจกรรมที่เกิดจากการปนเปื้อนติดตามพร้อมใช้งาน catalytically Asp49 PLA2s หน้าที่ว่า โปรตีน Lys49 ได้ enzymatically งาน การทำงานของผู้ป่วยและเพื่อนร่วมงาน ที่มหาวิทยาลัยของเซาเปาลูใน Ribeirão Preto นำถกเถียงนี้ระยะยาวจะจบสิ้น จึง เป็น เหตุการณ์สำคัญในงานวิจัยนี้ ครั้งแรก แบบ recombinant สารพิษ Lys49 (Bothrops jararacussu bothropstoxin ฉัน) วิเคราะห์ และเปรียบเทียบกับสำเนาของธรรมชาติที่แยกต่างหากจากพิษน้ำมัน นอกจากนี้ ชุดของ mutations จุดส่งผลกระทบต่อโปรตีน (Lys49/Asp, His48/Gln), หรือภูมิภาคของเทอร์มินัล C (Lys122/อลา), เมือง "ตัวเร่งปฏิกิริยา" ได้แนะนำ และศึกษาดีอย่างหนึ่ง ใช้ทดสอบสำคัญ พิษธรรมชาติบริสุทธิ์นำเสนอกิจกรรมการ PLA2 อาสา ต่ำ ในขณะที่กิจกรรมเอนไซม์ในระบบไม่สามารถวัด ด้วยพิษ recombinant สำคัญ mutating posi-สเตรชันจาก Lys49 ไป Asp ไม่ได้ไม่คืนกิจกรรมเอนไซม์ในระบบ เห็นว่า การเร่งปฏิกิริยาโดยโปรตีน Lys49 ขาดไม่สัจจะแทนเดียวนี้ แต่ยัง susbstitutions เพิ่มเติม (เช่น ที่ตกค้างในห่วงผูกแคลเซียม Petan et al., 2007) นอกจากนี้ mutant His48/Gln ซึ่งเอานี้ส่วนประกอบสำคัญของเครื่องจักรตัวเร่งปฏิกิริยาของ PLA2s สะสมกิจกรรมทำลายเยื่อที่เหมือนกับสารพิษธรรมชาติ บริการยืนยันหมายเลขในฟิลด์นี้ซึ่งแนะนำว่า Lys49 myotoxins คน ๆ นั้น ๆ โดยกลไกแคลเซียมอิสระ ไม่มีตัวเร่งปฏิกิริยาของการดำเนินการ สังเกตเกี่ยวข้องกับภูมิภาคของเทอร์มินัล C (Lomonte et al., 1994) ผลลัพธ์ มี mutant Lys122/อลา recombinant โดยแสดงความเป็นพิษลดลง ยังสนับสนุนชัดเจนของสมมุติฐานดังกล่าวเป็นโหมดของการดำเนินการของ Lys49 myotoxins งานนี้ และชุดต่อมาของการศึกษาโดยผู้ป่วยและเพื่อนร่วมงาน นำไปสู่ความเข้าใจลึกของดีเทอร์มิแนนต์โครงสร้างเกี่ยวข้องกับการที่ความเป็นพิษของ PLA2s Lys49 รวมแสดงการใช้ประสิทธิภาพของชีววิทยาโมเลกุลโปรตีนวิศวกรรมคลี่คลายความสัมพันธ์โครงสร้าง – ฟังก์ชันในสารพิษงูดี PLA2The following is a personal account of this work by Richard J. Ward: “The relationship between catalytic activity and biological function in the Lys49-PLA2s had been a controversy since their discovery, and it was clear to me that the way to resolve this question was through the characterization of the heterologous protein. Since the late 1990’s I had been working to solve a series of technical difficulties associated with producing bothropstoxin-I from Bothrops jararacussu as a heterologous protein in E. coli. The protein expressed well, but in the form of inclusion bodies, and refolding to obtain the native conformation was proving to be a major obstacle. The project had reached the point where I was trying everything to maintain protein solubility, when by chance I came across the work of Batas and Chaudhuri (1996) describing protein refolding in the presence of a gel-filtration matrix. To my great satisfaction, this method largely solved the solubility issue, and in a short time I had adapted the technique to get reasonable yields of the fully myotoxic heterologous bothropstoxin-I. With the expression system in hand and a group of enthusiastic post-graduate students in the lab, a series of active-site mutants were produced and characterized using a highly sensitive phospholipase A2 assay. The results were clear, the heterologous bothropstoxin-I did not show catalytic activity against synthetic phospholipid mixtures, and the residual lipid hydrolysis that had been previously observed in bothropstoxin-I prepared from the venom was therefore due to contamination from co-purified Asp49- PLA2s. This result then raised the obvious question: if the biological functions of Lys49-PLA2s are not a consequence of lipid hydrolysis, what is causing these effects? Over the last few years much progress has been made to finding an answer to this question, and site-directed mutagenesis has contributed to our understanding as to how a non-catalytic reorganization of membrane lipids coupled with structural transitions in the dimeric form of the Lys49-PLA2s leads to permeabilization of cell membranes, and ultimately to cell death”.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ตั้งแต่การค้นพบของพวกเขาเดิม (Maraganore et al., 1984) ลักษณะของ Lys49 PLA2 myotoxins ที่พบในพิษ viperid หลายยกโต้เถียงการเร่งปฏิกิริยาของพวกเขา ระบุว่าโปรตีนที่บริสุทธิ์ที่สุดของประเภทนี้จัดแสดงที่ต่ำมาก แต่ระดับที่ตรวจพบของกิจกรรม PLA2 ผู้เขียนบางคนที่ชื่นชอบการตีความว่าการเร่งปฏิกิริยาดังกล่าวที่แท้จริงในขณะที่คนอื่น ๆ ได้รับการสนับสนุนความคิดที่ว่ากิจกรรมที่เกิดจากการปนเปื้อนร่องรอยด้วยตัวเร่งปฏิกิริยาที่ใช้งาน Asp49 PLA2s หมายความว่าโปรตีน Lys49 ไม่ใช้งานเอนไซม์ การทำงานของวอร์ดและเพื่อนร่วมงานที่มหาวิทยาลัยเซาเปาโลRibeirão Preto มานี้ความขัดแย้งในระยะยาวที่จะสิ้นสุดจึงกลายเป็นความสำเร็จครั้งสำคัญในพื้นที่ของการวิจัยครั้งนี้ เป็นครั้งแรกที่เป็นรูปแบบผสมของสารพิษ Lys49 (Bothrops jararacussu bothropstoxin I) ได้รับการวิเคราะห์และเมื่อเทียบกับคู่ของธรรมชาติที่แยกได้จากพิษน้ำมันดิบ นอกจากนี้ชุดของการกลายพันธุ์จุดที่มีผลต่อ "ตัวเร่งปฏิกิริยา" ศูนย์กลางของโปรตีน (Lys49 / งูเห่า, His48 / Gln) หรือภูมิภาค C-ขั้ว (Lys122 / Ala) ถูกนำมาใช้และศึกษาเปรียบเทียบ โดยใช้การทดสอบที่สำคัญสารพิษตามธรรมชาติบริสุทธิ์ที่นำเสนอการตรวจพบกิจกรรม PLA2 ต่ำในขณะที่เอนไซม์ไม่สามารถวัดได้ด้วยสารพิษ recombinant ที่สำคัญกรรมวิธีการบวก Lys49 กลับไปงูเห่าไม่ได้เรียกคืนเอนไซม์แสดงให้เห็นว่าการขาดการเร่งปฏิกิริยาโดยโปรตีน Lys49 ไม่ได้เป็นผลมาจากการเปลี่ยนครั้งนี้ครั้งเดียว แต่ยัง susbstitutions เพิ่มเติม (เช่นที่ตกค้างใน calcium- ห่วงผูกพัน. Petan et al, 2007) นอกจากนี้การกลายพันธุ์ His48 / Gln ซึ่งช่วยขจัดนี้องค์ประกอบที่สำคัญของเครื่องจักรเร่งปฏิกิริยาของ PLA2s ไว้ในกิจกรรมเดียวกัน membrane-damaging ของสารพิษตามธรรมชาติอย่างหรูหรายืนยันข้อสังเกตในสาขาซึ่งชี้ให้เห็นว่า myotoxins Lys49 ออกแรงกระทำของพวกเขาตามนี้ แคลเซียมอิสระกลไกไม่ใช่ตัวเร่งปฏิกิริยาของการดำเนินการที่เกี่ยวข้องกับภูมิภาค C ขั้วของพวกเขา (Lomonte et al., 1994) ผลกับ recombinant Lys122 / Ala กลายพันธุ์โดยแสดงความเป็นพิษที่ลดลงก็มีความชัดเจนในการสนับสนุนสมมติฐานที่เกิดขึ้นดังกล่าวในรูปแบบของการกระทำของ Lys49 myotoxins งานนี้และชุดของการศึกษาต่อโดยวอร์ดและเพื่อนร่วมงานจะนำไปสู่ความเข้าใจที่ลึกซึ้งของปัจจัยโครงสร้างที่เกี่ยวข้องกับความเป็นพิษของ Lys49 PLA2s โดยรวมแสดงให้เห็นถึงการใช้งานที่มีประสิทธิภาพของอณูชีววิทยาและกลยุทธ์วิศวกรรมโปรตีนเพื่อ
คลี่คลายโครงสร้างและหน้าที่ ความสัมพันธ์ในสารพิษ PLA2 จากพิษงู.
ต่อไปนี้เป็นบัญชีส่วนบุคคลของงานนี้โดยริชาร์ดเจวอร์ด: "ความสัมพันธ์ระหว่างการเร่งปฏิกิริยาทางชีวภาพและการทำงานใน Lys49-PLA2s ได้รับการโต้เถียงตั้งแต่การค้นพบของพวกเขาและมันก็เป็นที่ชัดเจนในการ ผมว่าวิธีการแก้ไขคำถามนี้ก็ผ่านลักษณะของโปรตีน heterologous นับตั้งแต่ช่วงปลายปี 1990 ผมได้รับการทำงานเพื่อแก้ชุดของปัญหาทางเทคนิคที่เกี่ยวข้องกับการผลิต bothropstoxin-I จาก Bothrops jararacussu เป็นโปรตีน heterologous ในเชื้อ E. coli โปรตีนที่ดี แต่ในรูปแบบของร่างกายรวมและทำ refolding เพื่อให้ได้โครงสร้างพื้นเมืองได้รับการพิสูจน์ให้เป็นอุปสรรคสำคัญ โครงการก็มาถึงจุดที่ผมพยายามทุกอย่างที่จะรักษาความสามารถในการละลายโปรตีนเมื่อมีโอกาสผมมาในการทำงานของทาสและ Chaudhuri (1996) อธิบาย refolding โปรตีนในการปรากฏตัวของเมทริกซ์เจลกรอง เพื่อความพึงพอใจที่ดีของฉันวิธีนี้ส่วนใหญ่ได้รับการแก้ไขปัญหาการละลายและในช่วงเวลาสั้น ๆ ที่ผมได้ไปปรับใช้เทคนิคที่จะได้รับผลตอบแทนที่เหมาะสมของ myotoxic อย่างเต็มที่ heterologous bothropstoxin-I ด้วยระบบการแสดงออกในมือและกลุ่มของนักเรียนหลังจบการศึกษามีความกระตือรือร้นในห้องปฏิบัติการ, ชุดของการกลายพันธุ์ที่ใช้งานอยู่ในสถานที่มีการผลิตและลักษณะการใช้ phospholipase ความไวสูงทดสอบ A2 ผลการวิจัยที่ชัดเจน heterologous bothropstoxin ฉันไม่แสดงการเร่งปฏิกิริยากับสารผสมเรียมสังเคราะห์และการย่อยไขมันที่เหลือที่ได้รับการตั้งข้อสังเกตก่อนหน้านี้ใน bothropstoxin-I ที่เตรียมจากพิษจึงเกิดจากการปนเปื้อนจากผู้ร่วมบริสุทธิ์ Asp49- PLA2s . ผลที่ได้นี้แล้วยกคำถามที่ชัดเจนถ้าฟังก์ชั่นทางชีวภาพของ Lys49-PLA2s ไม่ได้เป็นผลมาจากการย่อยสลายไขมันในสิ่งที่ก่อให้เกิดผลกระทบเหล่านี้? ช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมาความคืบหน้ามากได้รับการทำในการหาคำตอบของคำถามนี้และฉับเว็บไซต์กำกับได้มีส่วนร่วมในการทำความเข้าใจของเราเป็นวิธีการปรับโครงสร้างองค์กรที่ไม่เร่งปฏิกิริยาของไขมันในเยื่อหุ้มเซลล์ควบคู่ไปกับการเปลี่ยนโครงสร้างในรูปแบบของ dimeric Lys49 -PLA2s นำไปสู่การผ่านของเยื่อหุ้มเซลล์และในที่สุดเซลล์ตาย "

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

นับตั้งแต่การค้นพบของต้นฉบับ ( maraganore et al . , 1984 ) , คุณสมบัติของ lys49 pla2 ไมโทซินที่พบในส่วน viperid หลายยก การโต้เถียงกับฤทธิ์ของตน ระบุว่าส่วนใหญ่ของโปรตีนชนิดนี้มีโปรตีนต่ำมาก แต่ตรวจพบระดับของกิจกรรม pla2 บางคนเขียน ชอบตีความว่า ฤทธิ์ดังกล่าวอยู่ภายในในขณะที่คนอื่น ๆที่สนับสนุนความคิดที่ว่า กิจกรรมเกิดจากร่องรอยปนเปื้อนด้วย catalytically ปราดเปรียว asp49 pla2s , implying ที่ lys49 enzymatically โปรตีนถูกใช้งาน งานของแผนกและเพื่อนร่วมงานที่มหาวิทยาลัยใน̃ o เปาโลใน Ribeira ̃ O จึงนำความขัดแย้งระยะยาวนี้จะสิ้นสุด จึงเป็นหลักในพื้นที่ของการวิจัย สำหรับครั้งแรกรูปแบบโปรตีนของ lys49 สารพิษ ( bothrops jararacussu bothropstoxin ผม ) ได้วิเคราะห์และเปรียบเทียบกับธรรมชาติของคู่แยกจากพิษราคาน้ำมัน . นอกจากนี้ชุดของยีนที่มีผลต่อ " การจุดศูนย์ " ของโปรตีน ( lys49 / ASP , his48 / gln ) หรือเขต ( ซึ่ง lys122 / เอ๋ ) , แนะนำและทำการศึกษา โดยใช้วิธีที่อ่อนไหวธรรมชาติบริสุทธิ์สารพิษได้เสนอกิจกรรม pla2 ที่ต่ำ ในขณะที่ไม่มีเอนไซม์ สามารถวัดสารพิษ ใช้กับ คือ กรรมวิธีการ lys49 posi - tion กลับไป ASP ไม่ได้เรียกคืนเอนไซม์ , แสดงให้เห็นว่าการขาดการเร่งปฏิกิริยาโดย lys49 โปรตีนไม่ใช่ผลของการแทนที่นี้เพียงครั้งเดียว แต่ยัง susbstitutions เพิ่มเติม ( เช่นที่ตกค้างในแคลเซียม ผูกวง ; petan et al . , 2007 ) นอกจากนี้ gln his48 / กลายพันธุ์ ซึ่งจะลดส่วนนี้จำเป็นในการรักษา pla2s เครื่องจักร , เยื่อเดียวกันทำลายกิจกรรมของสารพิษธรรมชาติ อย่างยืนยัน จำนวนค่าสังเกตในฟิลด์นี้ ซึ่งชี้ให้เห็นว่า lys49 ไมโทซินออกแรง การกระทำของพวกเขา โดยแคลเซียมอิสระไม่มีปฏิกิริยา กลไกของการกระทำที่เกี่ยวข้องกับภูมิภาคของพวกเขา ( ซึ่ง lomonte et al . , 1994 ) ผลลัพธ์ที่ได้กับคอม lys122 / Ala กลายพันธุ์ โดยการแสดงการลดความเป็นพิษ ยังสนับสนุนชัดเจน เช่น มีสมมติฐานเกี่ยวกับโหมดของการกระทำของ lys49 ไมโทซิน . งานนี้ และชุดต่อมาของการศึกษาโดยผู้ป่วยและผู้ร่วมงานนำไปสู่ความเข้าใจที่ลึกของโครงสร้างปัจจัยที่เกี่ยวข้องกับความเป็นพิษของ lys49 pla2s รวมถึงการใช้อำนาจของอณูชีววิทยาและกลยุทธ์วิศวกรรมโปรตีน

แก้โครงสร้าง–หน้าที่ความสัมพันธ์ใน pla2 สารพิษจากพิษงู .
ต่อไปนี้เป็นบัญชีส่วนบุคคลของงานนี้ โดย ริชาร์ด เจ. วอร์ด :" ความสัมพันธ์ระหว่างความว่องไวและฟังก์ชันทางชีวภาพใน lys49-pla2s ได้รับการโต้เถียงตั้งแต่การค้นพบของพวกเขาและมันเป็นที่ชัดเจนแก่ฉันว่า วิธีที่จะแก้คำถามนี้ผ่านคุณสมบัติของโปรตีนชนิด .ตั้งแต่ปลายปี 1990 ผมเคยทำงานในการแก้ชุดของปัญหาด้านเทคนิคที่เกี่ยวข้องกับการผลิต bothropstoxin-i จาก bothrops jararacussu เป็นโปรตีนชนิดใน E . coli โปรตีนที่แสดงออกได้ดี แต่ในรูปแบบของการรวมร่าง และ refolding เพื่อให้ได้โครงสร้างดั้งเดิมถูกพิสูจน์เป็น อุปสรรคสำคัญโครงการได้ถึงจุดที่ฉันพยายามทุกอย่างเพื่อรักษาความสามารถในการละลายของโปรตีน เมื่อมีโอกาส ฉันมาข้ามการทำงานของกฎ และ chaudhuri ( 1996 ) อธิบายโปรตีน refolding ต่อหน้าเจลแบบเมทริกซ์ เพื่อความพึงพอใจอันยิ่งใหญ่ของฉัน วิธีการนี้ไปแก้ไขในปัญหาและในช่วงเวลาสั้นๆ ผมได้ดัดแปลงเทคนิคที่จะได้รับผลตอบแทนที่เหมาะสมของ myotoxic อย่างเต็มที่ชนิด bothropstoxin-i. ที่มีการแสดงออกในระบบมือและกลุ่มของนักศึกษาระดับบัณฑิตศึกษาที่กระตือรือร้นในแล็ป ชุดของพวกกลายพันธุ์ active site ถูกผลิตและลักษณะการใช้ความไวสูง phospholipase A2 ( . . . ผลลัพธ์ที่ได้ชัดเจนการ bothropstoxin-i ด้วยตัวเองไม่ได้แสดงความว่องไวกับส่วนผสมฟอสโฟลิพิดสังเคราะห์และย่อยไขมันตกค้างที่ได้รับก่อนหน้านี้ที่พบใน bothropstoxin-i เตรียมจากพิษจึงเนื่องจากการปนเปื้อนจาก Co asp49 - pla2s บริสุทธิ์ ผลนี้แล้วยกคำถามที่ชัดเจน :ถ้าฟังก์ชันทางชีวภาพของ lys49-pla2s ไม่ใช่ผลของการย่อยไขมันเป็นสิ่งที่ก่อให้เกิดผลกระทบเหล่านี้ ? กว่าไม่กี่ปีล่าสุดมากคืบหน้าแล้วจะหาคำตอบสำหรับคำถามนี้และเว็บไซต์การกำกับ ได้สนับสนุนความเข้าใจของเราเป็นวิธีที่ไม่เร่งปรับโครงสร้างของเยื่อไขมัน ควบคู่ไปกับการเปลี่ยนโครงสร้างในรูปแบบท้องเฟ้อของ lys49-pla2s นำไปสู่ permeabilization ของเยื่อหุ้มเซลล์ และในที่สุดจะตาย
เซลล์ "