Cell pellets from 50 ml cultures we

Cell pellets from 50 ml cultures were disrupted by suspension in
3 ml BugBuster protein extraction reagent (Novagen, Billerica, MA)
supplementedwith 10 mlDNase I (NewEngland Biolabs, Ipswich,MA)
and 3mMof MgCl2, followed by incubation at room temperature for
20 min. Cell debris was removed by centrifugation at 12,000  g for
20min at 4 C. The supernatantwas transferred into a fresh tube and
an aliquot was saved for protein analysis by sodium dodecyl sulfate
polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The supernatant
(crude protein) was loaded onto metal ion affinity chromatography
His GraviTrap column (GE Healthcare, Pittsburgh, PA) preequilibrated with 10 ml of binding buffer (20 mM sodium phosphate, 500mMNaCl, 20mMimidazole, and 20% glycerol, pH7.4). The
column (upon loading the protein samples) was then washed with
binding buffer (10 ml). AKR and SDR were eluted with an elution
buffer (1 ml) containing 20 mM sodium phosphate, 500 mM NaCl,
500 mM imidazole, and 20% glycerol (pH 7.4). Elution was repeated
three times to collect 4 protein fractions (1ml each). Eluted fractions
were loaded onto Zeba™Spin Desalting Columns (Thermo Scientific)
and dialyzed against 25mMpotassiumphosphate buffer (pH7.0) plus
20% glycerol following themanufacturer's protocol. Purified AKR and
SDR were stored at
20 C until further use.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

เซลล์เกล็ดจากวัฒนธรรม 50 ml อยู่ระหว่างสองวัน โดยระงับใน3 ml BugBuster โปรตีนสกัดรีเอเจนต์ (Novagen, Billerica, MA)supplementedwith 10 mlDNase ฉัน (NewEngland Biolabs อิปสวิช MA)และ 3mMof MgCl2 ตาม ด้วยการบ่มที่อุณหภูมิห้องในประมาณ 20 นาทีเศษเซลล์ถูกเอาออก โดย centrifugation ที่ g 12000 สำหรับ20 นาทีที่ 4 ค Supernatantwas จะซื้อหลอดสด และส่วนลงตัวถูกบันทึกไว้สำหรับการวิเคราะห์โปรตีน โดย dodecyl โซเดียมซัลเฟตเจ polyacrylamide electrophoresis (SDS-หน้า) Supernatant(โปรตีนหยาบ) ถูกโหลดลงในโลหะไอออน affinity chromatographyคอลัมน์ GraviTrap ของเขา (GE สุขภาพ พิตส์เบิร์ก PA) preequilibrated กับ ml 10 ผูกบัฟเฟอร์ (pH7.4 20 มม.โซเดียมฟอสเฟต 500mMNaCl, 20mMimidazole และ 20% กลีเซ อร ) ที่คอลัมน์ (เมื่อโหลดตัวอย่างโปรตีน) ได้แล้วล้างด้วยผูกบัฟเฟอร์ (10 มล.) AKR และ SDR มี eluted กับการ elutionบัฟเฟอร์ (1 มล) ประกอบด้วย 20 มม.โซเดียมฟอสเฟต NaCl, 500 มม.อิมิดาโซล 500 มม. และ 20% กลีเซอร (pH 7.4) Elution ถูกทำซ้ำสามครั้งเพื่อเก็บเศษโปรตีน 4 (1ml แต่ละ) เศษ elutedถูกโหลดลงใน Zeba ™หมุน Desalting คอลัมน์ (เทอร์โม Scientific)และ dialyzed กับ 25mMpotassiumphosphate บัฟเฟอร์ (pH7.0) บวกกลีเซอร 20% ที่ต่อ themanufacturer ของโพรโทคอล Purified AKR และSDR ถูกเก็บไว้ที่ 20 C จนถึงใช้เพิ่มเติม

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เม็ดมือถือจาก 50 มลวัฒนธรรมที่ได้รับผลกระทบจากการระงับใน
3 มลสารสกัด BugBuster โปรตีน (Novagen, บิลเลริกา, MA)
supplementedwith 10 mlDNase ฉัน (NewEngland Biolabs, Ipswich, MA)
และ 3mMof MgCl2 ตามด้วยการบ่มที่อุณหภูมิห้องนาน
20 นาที เศษของเซลล์ถูกลบออกโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 12,000? กรัม
20min ที่ 4 องศาเซลเซียส supernatantwas โอนเข้ามาในท่อสดและ
aliquot ถูกบันทึกไว้สำหรับการวิเคราะห์โปรตีนโดยโซเดียมโดเดซิลซัลเฟต
ข่าวคราวอะคริเลต (SDS-PAGE) ใส
(โปรตีน) ถูกโหลดลงบนโลหะไอออน af ไฟ nity Chromatography
คอลัมน์ของเขา GraviTrap (GE Healthcare, พิตส์เบิร์ก) preequilibrated 10 มล. ของ buffer ผูกพัน (โซเดียมฟอสเฟต 20 มิลลิ 500mMNaCl, 20mMimidazole และกลีเซอรีน 20% pH7.4) .
คอลัมน์ (ตามโหลดตัวอย่างโปรตีน) ถูกล้างแล้วกับ
กันชนที่มีผลผูกพัน (10 มล.) AKR และ SDR ถูกชะชะกับ
บัฟเฟอร์ (1 มล.) ที่มีโซเดียมฟอสเฟตมิลลิ 20 500 มิลลิโซเดียมคลอไรด์,
500 มิลลิ imidazole และกลีเซอรีน 20% (pH 7.4) elution ซ้ำ
สามครั้งในการเก็บรวบรวม 4 เศษส่วนโปรตีน (1ml แต่ละคน) เศษส่วนชะ
ถูกโหลดลง Zeba ™ปั่นคอลัมน์ desalting (เทอร์โม scienti สาย c)
และ dialyzed กับบัฟเฟอร์ 25mMpotassiumphosphate (pH7.0) บวก
กลีเซอรีน 20% ต่อไปนี้โปรโตคอล themanufacturer ของ Puri สายเอ็ด AKR และ
SDR ถูกเก็บไว้ที่ 20 องศาเซลเซียสจนใช้งานต่อไป

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เซลล์เม็ดจาก 50 มิลลิลิตร วัฒนธรรมที่ถูกรบกวนจากช่วงล่างใน
3 ml bugbuster การสกัดโปรตีนโครงสร้าง ( novagen โตเกียว , MA )
supplementedwith 10 mldnase ( นิวอิงแลนด biolabs อิปสวิช , MA )
3mmof MgCl2 และตามด้วยการบ่มที่อุณหภูมิห้อง
20 นาทีเศษเซลล์จะถูกลบออกโดยการปั่นเหวี่ยงที่ 12000  G สำหรับ
20 นาทีที่ 4  C supernatantwas ถ่ายโอนลงในหลอดสด
เป็นส่วนที่หารลงตัวเป็นบันทึกการวิเคราะห์โปรตีนโดยโซเดียมโดเดซิลซัลเฟต
polyacrylamide gel electrophoresis ( SDS-PAGE ) และน่าน
( โปรตีน ) ถูกโหลดลงบนโลหะไอออนโครมาโตกราฟี AF จึงเกียรติ
ของเขา gravitrap คอลัมน์ ( GE สุขภาพ , Pittsburgh , PA ) preequilibrated 10 มิลลิลิตร ผูก บัฟเฟอร์ ( 20 มิลลิเมตร โซเดียมฟอสเฟต 500mmnacl 20mmimidazole , และ 20 % กลีเซอรอล ph7.4 )
คอลัมน์ ( เมื่อโหลดโปรตีนตัวอย่าง ) จากนั้นล้างด้วย
ผูกพันบัฟเฟอร์ ( 10 ml ) และมีตัวอย่างกับ akr SDR (
บัฟเฟอร์ ( 1 มล. ) ประกอบด้วยโซเดียมฟอสเฟต 20 มม. ขนาด 500 มม.
อิมิดาโซล 500 มม. และ 20 % กลีเซอรอล ( pH 7.4 ) ได้มาย้ำ
สามครั้งเพื่อเก็บ 4 โปรตีนเศษส่วน ( 1ml แต่ละครั้ง ) ตัวอย่างเศษส่วน
ถูกโหลดลงบน zeba ™ปั่น desalting คอลัมน์ ( เทอร์โม scienti จึง C )
ผ่านกับ 25mmpotassiumphosphate และบัฟเฟอร์ ( ph7.0 ) บวก
20 % กลีเซอรอลดังต่อไปนี้โปรโตคอลผู้ผลิตของ ปุริมและถ่ายทอด akr
SDR ที่อุณหภูมิ 20 C
 จนกว่าจะใช้ต่อไป