ไลโปคาลิน มิวทีน from a random ไลบร

ไลโปคาลิน มิวทีน from a random ไลบรารี as described above, evolutive methods ที่รวมถึง limited การก่อกลายพันธุ์ can also be applied in order to optimize a มิวทีน that already possesses some binding activity for the target with respect to แอฟฟินิตี้ หรือ specificity for the target after repeated screening cycles.

[0091] It is readily apparent to the skilled person that complex formation is dependent on many factors such as concentration of the binding partners, the presence of competitors, ionic strength of the buffer system etc. Selection and enrichment is generally performed under conditions allowing the isolation of ไลโปคาลิน มิวทีน having, in complex with the desired target, a dissociation constant of at least 200 nM. However, the washing and elution steps can be carried out under varying stringency. A selection with respect to the kinetic characteristics is possible as well. For example, the selection can be performed under conditions, which favor complex formation of the target with มิวทีน that show a slow dissociation from the target, or
in other words a low k0ff rate. Alternatively, selection can be performed under conditions, which favor fast formation of the complex between the มิวทีน and the target, หรือ in other
words a high kon rate. As a further illustrative alternative, the screening can be performed

under conditions that select for improved thermo-stability of the มิวทีน (compared to either wild type ไลโปคาลิน หรือ a มิวทีน that already has แอฟฟินิตี้ towards a pre-selected target).

[0092] Once a ไลโปคาลิน มิวทีน with แอฟฟินิตี้ to a given target has been selected, it is additionally possible to เป้าหมาย such a มิวทีน to another การก่อกลายพันธุ์ in order to subsequently select รูปแปรผัน of even higher แอฟฟินิตี้ หรือ รูปแปรผัน with improved properties such as higher thermo-stability, improved serum stability, thermodynamic stability, improved solubility, improved ประเภทโมโนเมอร์ behavior, improved resistance against thermal denaturation, chemical denaturation, proteolysis, หรือ detergents, etc. This further การก่อกลายพันธุ์, which in case of aiming at higher แอฟฟินิตี้ can be considered as in vitro "แอฟฟินิตี้ maturation", can be achieved by ตำแหน่ง specific mutation based on rational design หรือ a random mutation. Another possible approach for obtaining a higher แอฟฟินิตี้ หรือ improved properties is the use of error-prone PCR, which results in point mutations over a selected range of sequence positions of the ไลโปคาลิน มิวทีน. The error-prone PCR can be carried out in accordance with any known protocol such as the one described by Zaccolo et al. (1996) J. Mal. Biol. 255, 589-603. Other methods of random การก่อกลายพันธุ์ that are suitable for such purposes รวมถึง random insertion/deletion (RID) การก่อกลายพันธุ์ as described by Murakami, H et al. (2002) Nat.Biotechnol. 20, 76-81 หรือ nonhomologous random recombination (NRR) as described by Bittker, J. A et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20,1024-1029. If desired, แอฟฟินิตี้ maturation can also be carried out according to the procedure described in WO 00/75308 หรือ Schlehuber, S. et al. (2000) J. Mal. Biol. 297,
1105-1120, where มิวทีน of the bilin-binding protein having high แอฟฟินิตี้ to digoxigenin were obtained.

[0093] In this regard, it is clear to the skilled person that the แอฟฟินิตี้'s Ko values (dissociation constant of the complex formed between the respective มิวทีน and its ลิแกนด์) may vary within a certain experimental range, depending on the method and experimental setup that is used for determining the แอฟฟินิตี้ of a particular ไลโปคาลิน มิวทีน for a given ลิแกนด์. This means, there may be a slight deviation in the measured Ko values หรือ a tolerance range depending, for example, on whether the Ko value was determined by surface plasmon resonance (Biacore) หรือ by competition ELISA.
[0094] Also รวมถึงd in the scope of the present การเปิดเผย are forms of the above มิวทีน, in which the respective มิวทีน has been altered หรือ modified with respect to its potential immunogenicity.

[0095] Cytotoxic T-cells recognize peptide antigens on the cell surface of an antigen• presenting cell in association with a class I major histocompatibility complex (MHC) molecule. The ability of the peptides to ยึดเกาะ to MHC molecules is allele specific and correlates with their immunogenicity. In order to reduce immunogenicity of a given protein, the ability to predict which peptides in a protein have the potential to ยึดเกาะto a given MHC molecule is of great value. Approaches that employ a computational threading approach to identify potential T-cell เอพิโทป have been previously described to predict the binding of a given peptide sequence to MHC class I molecules (Altuvia et al. (1995) J. Mol. Biol. 249,
244-250).


[0096] Such an approach may also be utilized to identify potential T-cell เอพิโทป in the มิวทีน of the การเปิดเผย and to make depending on its intended use a selection of a specific มิวทีน on the basis of its predicted immunogenicity. It may be furthermore possible to เป้าหมาย peptide บริเวณs which have been predicted to contain T-cell เอพิโทป to additional การก่อกลายพันธุ์ to reduce หรือ eliminate these T-cell เอพิโทป and thus minimize immunogenicity. The removal of amphipathic เอพิโทป from genetically engineered antibodies has been described (Mateo et al. (2000) Hybridoma 19, 6, 463-471) and may be adapted to the มิวทีน of the present การเปิดเผย.

[0097] The มิวทีน thus obtained may possess a minimized immunogenicity, which is desirable for their use in therapeutic and diagnostic applications, such as those described below.

[0098] For several applications of the ไลโปคาลิน มิวทีน disclosed herein, the inventive ไลโปคาลิน มิวทีน may be fused, for example at their N-terminus หรือ their C-terminus, to a moiety, which can be protein, a protein domain หรือ a peptide such as a signal sequence and/or an แอฟฟินิตี้ tag.

[0099] แอฟฟินิตี้ tags such as the Strep-tag® หรือ Strep-tag® II (Schmidt, T.G.M. et al. (1996) J. Mal. Biol. 255, 753-766), the myc-tag, the FLAG-tag, the Hisg-tag หรือ the HA-tag or
proteins such as glutathione-S-transferase also allow easy detection and/or purification of รีคอมบิแนนต์ proteins are further examples of suitable fusion partners. Finally, proteins with
chromogenic หรือ fluorescent properties such as the green fluorescent protein (GFP) หรือ the yellow fluorescent protein (YFP) are suitable fusion partners for a ไลโปคาลิน มิวทีน of the การเปิดเผย as well. For example, when used in the experiments described in Examples below, the ไลโปคาลิน มิวทีน disclosed herein carry a C-terminal Strep-Tag®II purification tag (IBA GmbH) consisting of 10 amino acids (SAWSHPQFEK).

[00100] For some applications, it is also useful to employ the มิวทีน of the การเปิดเผย in a labeled form. Accordingly, the การเปิดเผย is also directed to ไลโปคาลิน มิวทีน which are คอนจูเกตd to a label moiety selected from the group consisting of enzyme labels, radioactive labels, colored labels, fluorescent labels, chromogenic labels, luminescent labels, แฮปเทน, digoxigenin, biotin, metal complexes, metals, and colloidal gold. The มิวทีน may also be คอนจูเกตd to a low molecular weight organic compound. The term "low molecular weight organic compound" ตามที่ใช้ในที่นี้ denotes a ประเภทโมโนเมอร์ carbon-based compound, which may have aliphatic, alicyclic and/or aromatic moieties. In typical embodiments the low molecular weight organic compound is an organic compound that has a main chain of at least two carbon atoms, and ในบางรุรุ not more than 7 หรือ 12 rotatable carbon bonds. Such a compound has a molecular weight in the range from about 100 to about 2000 Dalton, such as from about 100 to about 1000 Dalton. It may optionally รวมถึง one หรือ two metal atoms.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

มิวทีนไลโปคาลินจากไลบรารีสุ่มเป็น วิธี evolutive การก่อกลายพันธุ์ที่รวมถึงจำกัดใช้ในการเพิ่มประสิทธิภาพมิวทีนที่มีบางกิจกรรมผูกเป้าหมายเกี่ยวกับแอฟฟินิตี้หรือ specificity เป้าหมายหลังจากรอบการตรวจคัดกรองซ้ำแล้ว[0091] จึงเป็นประเด็นให้บุคคลมีทักษะซับซ้อนก่อตัวขึ้นอยู่กับหลายปัจจัยเช่นความเข้มข้นของคู่ผูก สถานะของคู่แข่ง ionic ความแข็งแรงของระบบบัฟเฟอร์เป็นต้น เลือกและโดดเด่นโดยทั่วไปดำเนินการภายใต้เงื่อนไขที่ให้แยกมิวทีนไลโปคาลินมี ในคอมเพล็กซ์ด้วยเป้าหมายที่ต้องการ ค่าคง dissociation น้อย 200 nM อย่างไรก็ตาม ขั้นตอนการซักผ้าและ elution สามารถดำเนินภายใต้ stringency แตกต่างกัน ตัวเลือกเกี่ยวกับลักษณะเดิม ๆ ได้เป็นอย่างดี สามารถทำการเลือกภายใต้เงื่อนไข ซึ่งชอบก่อตัวซับซ้อนของเป้าหมายด้วยมิวทีนที่แสดง dissociation ช้าจากเป้าหมาย เช่น หรือ ในคำอื่น ๆ อัตราต่ำ k0ff หรือ เลือกสามารถดำเนินการได้ภายใต้เงื่อนไข ซึ่งชอบก่อตัวอย่างรวดเร็วของซับซ้อนระหว่างมิวทีนและปลายทาง หรือในที่อื่น ๆคำอัตราสูงคอน เป็นการเพิ่มเติมแสดงทางเลือก คัดกรองสามารถทำได้ภายใต้เงื่อนไขที่เลือกสำหรับการปรับปรุงเสถียรภาพการเทอร์โมของมิวทีน (เปรียบเทียบกับทั้งป่าชนิดไลโปคาลินหรือมิวทีนที่มีอยู่แล้วแอฟฟินิตี้ไปยังเป้าหมายที่เลือกไว้)[0092] เมื่อเลือกมิวทีนไลโปคาลินกับแอฟฟินิตี้ไปยังเป้าหมายที่กำหนดไว้ จำเป็นนอกจากนี้เพื่อเป้าหมายดังกล่าวมิวทีนที่ไปการก่อกลายพันธุ์อื่นเพื่อมาเลือกรูปแปรผันรูปแปรผันหรือแอฟฟินิตี้สูงมีคุณสมบัติดีขึ้นเช่นเทอร์โมความมั่นคงสูง เซรั่มปรับปรุงความมั่นคง เสถียรภาพทางอุณหพลศาสตร์ ละลายปรับปรุง ประเภทโมโนเมอร์ปรับปรุง พฤติกรรม การปรับปรุงความต้านทานต่อความร้อน denaturation, denaturation เคมี , proteolysis หรือผงซักฟอก ฯลฯ การก่อกลายพันธุ์ต่อไปนี้ ซึ่งในกรณีมุ่งที่แอฟฟินิตี้สูงถือได้ว่า เป็นในหลอดที่ "พ่อแม่แอฟฟินิตี้" สามารถทำได้ โดยการกลายพันธุ์เฉพาะตำแหน่งตามเชือดออกแบบหรือการกลายพันธุ์แบบสุ่ม วิธีเป็นไปได้อื่นสำหรับรับสูงกว่าแอฟฟินิตี้หรือการปรับปรุงคุณสมบัติการใช้ PCR ผิดพลาดเสี่ยง ผล mutations จุดในช่วงที่เลือกลำดับตำแหน่งของไลโปคาลินมิวทีน ได้ สามารถทำ PCR ผิดพลาดมักออกตามโพรโทคอใด ๆ ชื่อดังเช่นอธิบายไว้ โดย Zaccolo et al. (1996) J. Mal. Biol. 255, 589-603 ต่าง ๆ ของการก่อกลายพันธุ์สุ่มที่เหมาะสมเช่นวัตถุประสงค์รวมถึงแทรกสุ่มลบ (RID) การก่อกลายพันธุ์ตามที่อธิบายไว้ โดยมุระกะมิ H et al. Nat.Biotechnol (2002) 20, 76-81 หรือ nonhomologous สุ่ม recombination (NRR) ตามที่อธิบายไว้ โดย Bittker เจ A al. ร้อยเอ็ด (2002) Nat. Biotechnol 20,1024-1029. ถ้าต้อง แอฟฟินิตี้พ่อแม่ยังสามารถดำเนินตามขั้นตอนที่อธิบายไว้ใน WO 00/75308 หรือ Schlehuber, S. et al. (2000) J. Mal. Biol. 2971105-1120 ได้รับมิวทีนของโปรตีน bilin ผูกที่มีแอฟฟินิตี้สูงถึง digoxigenin[0093] ในการนี้ เป็นที่ชัดเจนผู้เชี่ยวชาญที่ค่าเกาะของแอฟฟินิตี้ (dissociation ค่าคงที่ของอาคารที่เกิดขึ้นระหว่างของลิแกนด์และมิวทีนตามลำดับ) อาจแตกต่างกันในทดลองช่วง ขึ้นอยู่กับวิธีการติดตั้งทดลองที่ใช้ในการกำหนดแอฟฟินิตี้ของมิวทีนไลโปคาลินเฉพาะสำหรับลิแกนด์กำหนด ซึ่งหมายความ อาจมีความแตกต่างเล็กน้อยในการวัดเกาะค่าหรือช่วงค่าเผื่อตาม เช่น ว่าถูกกำหนดโดย plasmon ผิวการสั่นพ้อง (Biacore) หรือค่าเกาะโดย ELISA การแข่งขัน [0094] ยัง รวมถึงd ในขอบเขตของการเปิดเผยปัจจุบันมีรูปแบบของมิวทีนข้าง มิวทีนเกี่ยวข้องได้ถูกเปลี่ยนแปลงหรือแก้ไขเกี่ยวกับ immunogenicity ที่อาจเกิดขึ้น[0095] cytotoxic T-เซลล์รู้จัก antigens เพปไทด์บนผิวเซลล์ของ antigen• นำเซลล์กับคลาฉัน histocompatibility สำคัญซับซ้อน (เอ็มเอชซี) โมเลกุล สามารถของเปปไทด์ที่จะยึดเกาะเอ็มเอชซีโมเลกุลเป็น allele ที่เฉพาะเจาะจง และคู่กับ immunogenicity ของพวกเขา ยก immunogenicity โปรตีนกำหนด ความสามารถในการทำนายที่เปปไทด์ในโปรตีนมีศักยภาพ ยึดเกาะto เอ็มเอชซีให้ โมเลกุลมีค่ามาก แนวทางที่ว่าจ้างวิธีการเธรดคำนวณระบุเอพิโทป T เซลล์อาจมีการอธิบายไว้ก่อนหน้านี้เพื่อทำนายการรวมของเพปไทด์ที่กำหนดลำดับการเอ็มเอชซีคลาฉันโมเลกุล (Altuvia et al. (1995) J. Biol. Mol. 249244-250)อาจยังใช้ [0096] เช่นวิธีการระบุศักยภาพเซลล์ T เอพิโทปในมิวทีนของการเปิดเผย และต้องขึ้นอยู่กับการเลือกของมิวทีนเฉพาะตาม immunogenicity การคาดการณ์ อาจสามารถนอกจากนี้ บริเวณs เพปไทด์เป้าหมายซึ่งได้รับการคาดการณ์มี T เซลล์ เอพิโทปเพื่อการก่อกลายพันธุ์เพิ่มเติมเพื่อลดหรือกำจัดเอพิโทป T เซลล์เหล่านี้ และลด immunogenicity จึง ได้ เอาเอพิโทป amphipathic จากแอนตี้ออกแบบแปลงพันธุกรรมมีการอธิบาย (เซาท์อีสท์ et al. (2000) Hybridoma 19, 6, 463-471) และอาจปรับให้มิวทีนของการเปิดเผยอยู่[0097] มิวทีนที่ได้รับจึง อาจมีการ immunogenicity ย่อเล็กสุด ซึ่งเป็นการใช้ในการวินิจฉัย และรักษาโปรแกรมประยุกต์ เช่นที่อธิบายไว้ด้านล่าง[0098] สำหรับการใช้งานของมิวทีนไลโปคาลินที่เปิดเผยนี้ มิวทีนไลโปคาลินประดิษฐ์อาจจะ fused ตัวอย่างที่ของพวกเขาออกเป็น N-นัสของ C-นัส การ moiety ซึ่งจะมีโปรตีน หรือโดเมนโปรตีนเป็นเพปไทด์เช่นลำดับสัญญาณหรือป้ายเป็นแอฟฟินิตี้[0099] แอฟฟินิตี้ tags such as the Strep-tag® หรือ Strep-tag® II (Schmidt, T.G.M. et al. (1996) J. Mal. Biol. 255, 753-766), the myc-tag, the FLAG-tag, the Hisg-tag หรือ the HA-tag orproteins such as glutathione-S-transferase also allow easy detection and/or purification of รีคอมบิแนนต์ proteins are further examples of suitable fusion partners. Finally, proteins with chromogenic หรือ fluorescent properties such as the green fluorescent protein (GFP) หรือ the yellow fluorescent protein (YFP) are suitable fusion partners for a ไลโปคาลิน มิวทีน of the การเปิดเผย as well. For example, when used in the experiments described in Examples below, the ไลโปคาลิน มิวทีน disclosed herein carry a C-terminal Strep-Tag®II purification tag (IBA GmbH) consisting of 10 amino acids (SAWSHPQFEK).[00100] For some applications, it is also useful to employ the มิวทีน of the การเปิดเผย in a labeled form. Accordingly, the การเปิดเผย is also directed to ไลโปคาลิน มิวทีน which are คอนจูเกตd to a label moiety selected from the group consisting of enzyme labels, radioactive labels, colored labels, fluorescent labels, chromogenic labels, luminescent labels, แฮปเทน, digoxigenin, biotin, metal complexes, metals, and colloidal gold. The มิวทีน may also be คอนจูเกตd to a low molecular weight organic compound. The term "low molecular weight organic compound" ตามที่ใช้ในที่นี้ denotes a ประเภทโมโนเมอร์ carbon-based compound, which may have aliphatic, alicyclic and/or aromatic moieties. In typical embodiments the low molecular weight organic compound is an organic compound that has a main chain of at least two carbon atoms, and ในบางรุรุ not more than 7 หรือ 12 rotatable carbon bonds. Such a compound has a molecular weight in the range from about 100 to about 2000 Dalton, such as from about 100 to about 1000 Dalton. It may optionally รวมถึง one หรือ two metal atoms.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ไลโปคาลินมิวทีนจากไลบรารีสุ่มตามที่อธิบายไว้ข้างต้นวิธี Evolutive ที่รวมถึง จำกัด การก่อกลายพันธุ์นอกจากนี้ยังสามารถนำมาใช้เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพมิวทีนที่มีอยู่แล้วมีบางกิจกรรมที่มีผลผูกพันสำหรับเป้าหมายด้วย ส่วนที่เกี่ยวกับแอฟฟินิตี้หรือเฉพาะเจาะจงสำหรับเป้าหมายหลังจากรอบคัดกรองซ้ำ. [0091] มันเป็นได้อย่างง่ายดายที่ชัดเจนให้กับคนที่มีทักษะที่เชิงซ้อนจะขึ้นอยู่กับปัจจัยหลายอย่างเช่นความเข้มข้นของคู่ค้าที่มีผลผูกพันการปรากฏตัวของคู่แข่งไอออนิก ความแข็งแรงของระบบบัฟเฟอร์ ฯลฯ การคัดเลือกและการตกแต่งโดยทั่วไปจะดำเนินการภายใต้เงื่อนไขการอนุญาตให้แยกไลโปคาลินมิวทีนที่มีในที่ซับซ้อนที่มีเป้าหมายที่ต้องการเป็นแยกออกจากกันอย่างต่อเนื่องไม่น้อยกว่า 200 นาโนเมตร อย่างไรก็ตามขั้นตอนการซักผ้าและ elution สามารถดำเนินการได้ภายใต้ความเข้มงวดที่แตกต่างกัน เลือกที่เกี่ยวกับลักษณะการเคลื่อนไหวเป็นไปได้เช่นกัน ยกตัวอย่างเช่นการเลือกสามารถดำเนินการได้ภายใต้เงื่อนไขที่สนับสนุนการก่อตัวที่ซับซ้อนของเป้าหมายด้วยมิวทีนที่แสดงให้เห็นถึงการแยกตัวออกช้าจากเป้าหมายหรือในคำอื่น ๆ ที่มีอัตราต่ำ k0ff อีกวิธีหนึ่งคือการเลือกสามารถดำเนินการได้ภายใต้เงื่อนไขที่สนับสนุนการก่อตัวได้อย่างรวดเร็วที่ซับซ้อนระหว่างมิวทีนและเป้าหมายหรือในอื่น ๆคำอัตราที่สูงกรณ์ ในฐานะที่เป็นทางเลือกตัวอย่างเพิ่มเติมได้ที่การตรวจคัดกรองสามารถดำเนินการได้ภายใต้เงื่อนไขที่เลือกสำหรับการปรับปรุงเสถียรภาพความร้อนของมิวทีน (เมื่อเทียบกับทั้งป่าประเภทไลโปคาลินหรือมิวทีนที่มีอยู่แล้วแอฟฟินิ ตี้ไปสู่เป้าหมายที่เลือกไว้ล่วงหน้า). [0092] เมื่อไลโปคาลินมิวทีนกับแอฟฟินิตี้ที่จะเป็นเป้าหมายที่กำหนดได้รับการคัดเลือกก็ยังเป็นไปได้ที่จะเป้าหมายดังกล่าวมิวทีนที่จะ อีกการก่อกลายพันธุ์เพื่อที่จะต่อมาเลือกรูปแปรผันของสูงขึ้นแอฟฟินิตี้หรือรูปแปรผันที่มีคุณสมบัติที่ดีขึ้นเช่นความร้อนความมั่นคงสูงมีความมั่นคงในซีรั่มที่ดีขึ้น, ความมั่นคงทางอุณหพลศาสตร์การละลายที่ดีขึ้น, การปรับปรุงประเภทโมโนเมอร์พฤติกรรม ความต้านทานที่ดีขึ้นกับการสูญเสียสภาพธรรมชาติความร้อน denaturation เคมี proteolysis, หรือผงซักฟอก ฯลฯ ต่อไปนี้การก่อกลายพันธุ์ซึ่งในกรณีของการมุ่งที่สูงกว่าแอฟฟินิตี้ถือได้ว่าเป็นในหลอดทดลอง "แอฟฟินิตี้การเจริญเติบโต" สามารถทำได้โดยการกลายพันธุ์ตำแหน่งที่เฉพาะเจาะจงขึ้นอยู่กับการออกแบบที่มีเหตุผลหรือการกลายพันธุ์แบบสุ่ม อีกวิธีการที่เป็นไปได้สำหรับการได้รับสูงกว่าแอฟฟินิตี้หรือคุณสมบัติที่ดีขึ้นคือการใช้วิธี PCR ผิดพลาดได้ง่ายซึ่งส่งผลให้เกิดการกลายพันธุ์จุดในช่วงที่เลือกของตำแหน่งลำดับของไลโปคาลินมิวทีน PCR ผิดพลาดได้ง่ายสามารถดำเนินการให้สอดคล้องกับโปรโตคอลใด ๆ เช่นเดียวอธิบายโดย Zaccolo et al, (1996) เจล Biol 255, 589-603 วิธีการอื่น ๆ ของการสุ่มการก่อกลายพันธุ์ที่มีความเหมาะสมสำหรับวัตถุประสงค์ดังกล่าวรวมถึงการแทรกสุ่ม / ลบ (RID) การก่อกลายพันธุ์ตามที่อธิบาย Murakami, H, et al (2002) Nat.Biotechnol 20 หรือ 76-81 nonhomologous รวมตัวกันอีกแบบสุ่ม (NRR) ตามที่อธิบาย Bittker, เจ, et al (2002) ชัยนาท Biotechnol 20,1024-1029 ถ้าต้องการให้แอฟฟินิตี้เจริญเติบโตนอกจากนี้ยังสามารถดำเนินการตามขั้นตอนที่อธิบายไว้ใน WO 00/75308 Schlehuber หรือเอสเอตอัล (2000) เจล Biol 297, 1105-1120 ที่มิวทีนของโปรตีน Bilin ผูกพันมีสูงแอฟฟินิตี้ที่จะได้รับ digoxigenin. [0093] ในเรื่องนี้ก็เป็นที่ชัดเจนไปยังบุคคลที่มีทักษะที่แอฟฟินิตี้ เป็นค่าเกาะ (แยกออกจากกันอย่างต่อเนื่องของความซับซ้อนที่เกิดขึ้นระหว่างนั้นมิวทีนและลิของแกนด์) อาจแตกต่างกันในช่วงการทดลองบางอย่างขึ้นอยู่กับวิธีการและการตั้งค่าการทดลองที่ใช้สำหรับการกำหนดแอฟฟินิตี้ของ โดยเฉพาะอย่างยิ่งไลโปคาลินมิวทีนสำหรับให้ลิแกนด์ ซึ่งหมายความว่าอาจจะมีความคลาดเคลื่อนเล็กน้อยในการวัดค่าเกาะหรือช่วงความอดทนขึ้นอยู่ยกตัวอย่างเช่นว่าค่าเกาะถูกกำหนดโดยพื้นผิวด้วยคลื่น plasmon (Biacore) หรือโดยวิธี ELISA แข่งขัน. [0094] ยังรวมถึงงใน ขอบเขตของปัจจุบันการเปิดเผยรูปแบบข้างต้นมิวทีนซึ่งในแต่ละมิวทีนมีการเปลี่ยนแปลงหรือการปรับเปลี่ยนส่วนที่เกี่ยวกับภูมิคุ้มกันที่มีศักยภาพของตน. [0095] Cytotoxic T-เซลล์รับรู้แอนติเจนเปปไทด์บนมือถือ พื้นผิวของแอนติเจน•นำเสนอมือถือในการเชื่อมโยงกับการเรียนผมซับซ้อน histocompatibility ที่สำคัญ (MHC) โมเลกุล ความสามารถของเปปไทด์ที่จะยึดเกาะโมเลกุล MHC เป็นเฉพาะอัลลีลและมีความสัมพันธ์กับภูมิคุ้มกันของพวกเขา เพื่อที่จะลดภูมิคุ้มกันของโปรตีนที่กำหนดความสามารถในการคาดการณ์ที่ peptides ในโปรตีนที่มีศักยภาพในการยึดเกาะที่จะโมเลกุล MHC ได้รับมีค่ามาก วิธีการที่ใช้วิธีการคำนวณเกลียวที่มีศักยภาพในการระบุ T-cell เอพิโทปได้รับการอธิบายก่อนหน้านี้ที่จะคาดการณ์ผลผูกพันของลำดับเปปไทด์ที่ได้รับการเรียน MHC โมเลกุลของฉัน (Altuvia et al. (1995) เจ Mol. Biol. 249 , 244-250). [0096] วิธีการดังกล่าวอาจจะถูกนำมาใช้ในการระบุที่อาจเกิดขึ้น T-cell เอพิโทปในมิวทีนของการเปิดเผยและเพื่อให้ขึ้นอยู่กับความตั้งใจเลือกใช้ของที่เฉพาะเจาะจงมิ วทีนบนพื้นฐานของการคาดการณ์การกระตุ้นภูมิคุ้มกันของตน อาจเป็นไปได้นอกจากนี้เพื่อเป้าหมายเปปไทด์บริเวณ s ซึ่งได้รับการคาดการณ์ว่าจะมี T-cell เอพิโทปที่จะเพิ่มเติมการก่อกลายพันธุ์เพื่อลดหรือขจัดเหล่านี้ T-cell เอพิโทปและทำให้ลดการกระตุ้นภูมิคุ้มกัน การกำจัดของ amphipathic เอพิโทปจากแอนติบอดีดัดแปลงพันธุกรรมได้รับการอธิบาย (แม et al. (2000) ไฮบริ 19, 6, 463-471) และอาจมีการปรับให้เข้ากับมิวทีนของการเปิดเผยในปัจจุบัน. [0097 ] ที่มิวทีนที่ได้รับจึงอาจมีภูมิคุ้มกันลดลงซึ่งเป็นที่น่าพอใจสำหรับการใช้งานของพวกเขาในการใช้งานการรักษาและวินิจฉัยเช่นที่ระบุไว้ด้านล่าง. [0098] สำหรับการใช้งานหลายไลโปคาลินมิวทีนเปิดเผย ที่นี้ที่สร้างสรรค์ไลโปคาลินมิวทีนอาจจะผสมเช่นที่ N-ปลายทางของพวกเขาหรือ C-ปลายทางของพวกเขาที่จะครึ่งหนึ่งซึ่งสามารถเป็นโปรตีนโดเมนโปรตีนหรือเปปไทด์เช่นลำดับสัญญาณ และ / หรือแอฟฟินิตี้แท็ก. [0099] แอฟฟินิตี้แท็กเช่น Strep-tag®หรือ Strep tag®-II (ชมิดท์ TGM et al. (1996) เจล. Biol. 255 , 753-766) ที่ myc แท็กที่ธงแท็กที่ Hisg แท็กหรือ HA-แท็กหรือโปรตีนเช่นกลูตาไธโอน-S-transferase ยังช่วยให้การตรวจสอบที่ง่ายและ / หรือการทำให้บริสุทธิ์ของรีคอมบิแนนต์โปรตีน ต่อไปนี้เป็นตัวอย่างของคู่ค้าฟิวชั่นที่เหมาะสม สุดท้ายกับโปรตีนchromogenic หรือคุณสมบัติเรืองแสงเช่นสีเขียวเรืองโปรตีน (GFP) หรือโปรตีนเรืองแสงสีเหลือง (YFP) เป็นคู่ค้าฟิวชั่นเหมาะสำหรับไลโปคาลินมิวทีนของการเปิดเผยเช่นกัน ตัวอย่างเช่นเมื่อใช้ในการทดลองที่อธิบายไว้ในตัวอย่างด้านล่างไลโปคาลินมิวทีนเปิดเผยในที่นี้ดำเนิน C-ขั้ว Strep-Tag®IIแท็กบริสุทธิ์ (IBA GmbH) ซึ่งประกอบด้วยกรดอะมิโน 10 (SAWSHPQFEK) [00100] สำหรับการใช้งานบางอย่างก็ยังเป็นประโยชน์ในการจ้างมิวทีนของการเปิดเผยในรูปแบบที่มีข้อความ ดังนั้นการเปิดเผยเป็นผู้กำกับยังไลโปคาลินมิวทีนซึ่งเป็นคอนจูเกตงไปครึ่งหนึ่งฉลากเลือกจากกลุ่มประกอบด้วยป้ายเอนไซม์ป้ายกัมมันตรังสีฉลากสีป้ายเรืองแสง, ป้าย chromogenic, ป้ายเรืองแสง, แฮปเทน, digoxigenin, ไบโอตินคอมเพล็กซ์โลหะโลหะและทองคอลลอยด์ มิวทีนก็อาจจะเป็นคอนจูเกตงจะมีน้ำหนักโมเลกุลต่ำสารประกอบอินทรีย์ คำว่า "น้ำหนักโมเลกุลต่ำสารประกอบอินทรีย์" ตามที่ใช้ในที่นี้หมายถึงประเภทโมโนเมอร์ผสมคาร์บอนซึ่งอาจมี aliphatic, alicyclic และ / หรือ moieties หอม ใน embodiments ทั่วไปน้ำหนักโมเลกุลต่ำสารประกอบอินทรีย์เป็นสารประกอบอินทรีย์ที่มีห่วงโซ่หลักอย่างน้อยสองอะตอมของคาร์บอนและในบางรุรุไม่เกิน 7 หรือ 12 พันธบัตรคาร์บอนหมุนได้ สารดังกล่าวมีน้ำหนักโมเลกุลอยู่ในช่วงประมาณ 100 ถึงประมาณ 2000 ดาลตันเช่นจากประมาณ 100 ถึง 1,000 ดาลตันเกี่ยวกับ มันอาจจะเลือกรวมถึงหนึ่งหรือสองอะตอมโลหะ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ไลโปคาลินมิวทีนจากไลบรารีสุ่มตามที่อธิบายไว้ข้างต้น การก่อกลายพันธุ์วิวัฒนาการที่รวมถึงวิธีการ จำกัด ยังสามารถใช้เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพมิวทีนแล้วมีกิจกรรมบางอย่างที่เชื่อมเป้าหมายด้วยความเคารพแอฟฟินิตี้ค็อคความจำเพาะของเป้าหมายหลังจากซ้ำ

รอบฉายภาพยนตร์ .[ ก็ทํา ] มันพร้อมแจ้งไปยังบุคคลที่มีทักษะเชิงซ้อนนั้นขึ้นอยู่กับปัจจัยหลายอย่าง เช่น ความเข้มข้นของหุ้นส่วนรวมการแสดงตนของคู่แข่ง ความแรงไอออนของระบบบัฟเฟอร์ฯลฯ การเลือกและการเสริมโดยทั่วไปจะดำเนินการภายใต้เงื่อนไขการอนุญาตให้มีการแยกไลโปคาลินมิวทีนในซับซ้อนกับที่ต้องการเป้าหมายเป็นค่าคงที่ของการอย่างน้อย 200 นาโนเมตร อย่างไรก็ตาม การใช้ และขั้นตอนที่สามารถดำเนินการได้ภายใต้การ stringency . การเลือกเกี่ยวกับลักษณะการเคลื่อนไหวก็เป็นไปได้เช่นกัน ตัวอย่างเช่น การสามารถกระทำได้ภายใต้เงื่อนไข ซึ่งชอบสร้างที่ซับซ้อนของเป้าหมายด้วยมิวทีนที่แสดงการแตกตัวช้า จากเป้าหมายหรือ
ในคำอื่น ๆ k0ff อัตราต่ำ อีกวิธีหนึ่งคือ การเลือกที่สามารถดำเนินการได้ภายใต้เงื่อนไข ซึ่งชอบสร้างที่รวดเร็วของซับซ้อนระหว่างมิวทีนและเป้าหมาย ค็อคกล่าวอีกนัยหนึ่ง
อัตราคนสูง ในฐานะที่เป็นอีกตัวอย่างทางเลือก , การคัดกรองที่สามารถดำเนินการได้

ภายใต้เงื่อนไขที่เลือกเพื่อปรับปรุงเสถียรภาพของมิวทีนเทอร์โม ( เทียบกับทั้งป่าประเภทไลโปคาลินค็อคเป็นมิวทีนที่มีอยู่แล้วแอฟฟินิตี้ต่อก่อนเลือกเป้าหมาย )

[ 0092 ] เมื่อไลโปคาลินมิวทีนกับแอฟฟินิตี้กับการกําหนดเป้าหมายได้ถูกเลือกมันยังเป็นไปได้ที่จะเป้าหมายเช่นมิวทีนเพื่อการก่อกลายพันธุ์อื่นเพื่อที่จะสามารถเลือกรูปแปรผันของสูงขึ้นแอฟฟินิตี้ค็อครูปแปรผันด้วยการปรับปรุงคุณสมบัติเช่นเสถียรภาพสูงกว่าเทอร์โม , การปรับปรุงเสถียรภาพความมั่นคงทางที่ดีขึ้น , เซรั่ม , การละลายพฤติกรรมประเภทโมโนเมอร์ดีขึ้น เพิ่มความต้านทานต่อความร้อน ( เคมี ( โปรตีโ ลซิส , ผงซักฟอก , ค็อค ฯลฯ การก่อกลายพันธุ์ต่อไปนี้ ซึ่งในกรณีของเป้าหมายในแอฟฟินิตี้สูงกว่า ก็ถือเป็นการ " แอฟฟินิตี้วุฒิภาวะ "สามารถทำได้ โดยเฉพาะการตำแหน่งขึ้นอยู่กับการออกแบบเหตุผลค็อคการกลายพันธุ์แบบสุ่ม แนวทางหนึ่งที่เป็นไปได้สำหรับการได้รับสูงกว่าแอฟฟินิตี้ค็อคคุณสมบัติปรับปรุงข้อผิดพลาดที่มักจะใช้วิธี PCR ซึ่งผลในจุดกลายพันธุ์มากกว่าช่วงที่เลือกของลำดับตำแหน่งของไลโปคาลินมิวทีน .ข้อผิดพลาดง่าย PCR สามารถเป็นไปตามโปรโตคอลรู้จักใด ๆเช่นหนึ่งที่อธิบายโดย zaccolo et al . ( 1996 ) เจ มอล วท บ วท . 255 , 589-603 . วิธีการอื่น ๆของการก่อกลายพันธุ์สุ่มที่เหมาะสมสำหรับวัตถุประสงค์รวมถึงการแทรก / ลบสุ่ม ( RID ) การก่อกลายพันธุ์ตามที่อธิบายไว้โดยมุราคามิ , H et al . ( 2002 ) nat.biotechnol . 2076-81 ค็อค nonhomologous การสุ่ม ( nrr ) ตามที่อธิบายไว้โดย bittker เจเป็น et al . ( 2002 ) ชัยนาท biotechnol . 201024-1029 . ถ้าต้องการแอฟฟินิตี้วุฒิภาวะยังสามารถดำเนินการตามขั้นตอนที่อธิบายไว้ใน wo 00 / 75308 ค็อค schlehuber S . , et al . ( 2000 ) เจ มอล วท บ วท . 1105-1120 297 ,
,ที่มิวทีนของบิลินโปรตีนที่มีแอฟฟินิตี้สูงที่จะติดได้

[ 0093 ] ในส่วนนี้ ก็เป็นที่ชัดเจนให้กับคนที่มีความสามารถที่ค่า KO ของแอฟฟินิตี้ ( หวิวคงที่ของคอมเพล็กซ์เกิดขึ้นระหว่างมิวทีนเกี่ยวข้องและลิแกนด์ ) อาจแตกต่างกันในบางการทดลองช่วงขึ้นอยู่กับวิธีการและทดลองการติดตั้งที่ใช้สำหรับการแอฟฟินิตี้ของมิวทีนไลโปคาลินเฉพาะสำหรับการลิแกนด์ . ซึ่งหมายความว่าอาจจะมีการเบี่ยงเบนเล็กน้อยในวัดเกาะค็อคค่าความอดทนช่วงขึ้น ตัวอย่างเช่นว่าค่าโค ถูกกำหนดโดยเสียงสะท้อน PLASMON พื้นผิว ( biacore ) ค็อคการแข่งขันโดยวิธีอีไลซ่า
[ 0094 ] ยังรวมถึง D ในขอบเขตของปัจจุบันการเปิดเผยเป็นรูปแบบข้างต้นมิวทีนซึ่งในมิวทีนนั้นได้ถูกเปลี่ยนแปลงค็อคแก้ไขด้วยความเคารพ

สามารถศักยภาพ .[ 0095 ] พิษเซลล์จำแอนติเจนบนผิวเซลล์ของเปปไทด์แอนติเจนแต่ละเซลล์นำเสนอในความสัมพันธ์กับชั้นชั้นหลักฮิสโตคอมแพทิบิลิตี คอมเพล็กซ์ ( MHC ) โมเลกุล ความสามารถของยึดเกาะ MHC โมเลกุลเปปไทด์เพื่อให้มีความสัมพันธ์กับยีนที่เฉพาะเจาะจงและสามารถของพวกเขา เพื่อลดความสามารถของที่ให้โปรตีนความสามารถในการทำนายซึ่งเปปไทด์ในโปรตีนมีศักยภาพที่จะยึดเกาะเพื่อให้โมเลกุล MHC มีมูลค่าที่ดีเยี่ยม วิธีที่ใช้ในการคำนวณเธรดวิธีการที่อาจเกิดขึ้นจากเอพิโทปได้อธิบายไว้ก่อนหน้าที่จะทำนายผูกพันของเปปไทด์เพื่อให้ลำดับชั้น MHC โมเลกุล ( altuvia et al . ( 1995 ) เจ. โมล วท บ วท . 249 , 244-250



)