- ข้อความ
- ประวัติศาสตร์
1. IntroductionThe Turner BioSystem
1. Introduction
The Turner BioSystems TD-700 Laboratory Fluorometer in combination with Molecular Probes' LIVE/DEAD® BacLightTM Bacterial Viability Kit provides a novel two-color fluorescence assay of bacterial viability that allows researchers to quantitatively distinguish live and dead bacteria in minutes, even in a mixed population containing a range of bacterial types. Conventional direct-count assays of bacterial viability are based on metabolic characteristics or membrane integrity. However, methods relying on metabolic characteristics often only work for a limited subset of bacterial groups,(1) and methods for assessing bacterial membrane integrity commonly have high levels of background fluorescence.(2) Both types of determinations suffer from being very sensitive to growth and staining conditions.(3,4)
The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability assay utilizes mixtures of SYTO® 9 green fluorescent nucleic acid stain and the red fluorescent nucleic acid stain, propidium iodide. These stains differ both in their spectral characteristics and in their ability to penetrate healthy bacterial cells. When used alone, the SYTO 9 stain labels bacteria with both intact and damaged membranes. In contrast, propidium iodide penetrates only bacteria with damaged membranes, competing with the SYTO 9 stain for nucleic acid binding sites when both dyes are present. When mixed in recommended proportions, SYTO 9 stain and propidium iodide produce green fluorescent staining of bacteria with intact cell membranes and red fluorescent staining of bacteria with damaged membranes. The background remains virtually nonfluorescent. Consequently, the ratio of green to red fluorescence intensities provides a quantitative index of bacterial viability (Figure 1).
2. Materials Required
Turner BioSystems TD-700 Laboratory Fluorometer with standard PMT (P/N 7000-009)
Quartz-halogen lamp (P/N 7000-930)
13 mm round test tube adapter (P/N 7000-981)
Two pairs of filters are required: First pair includes: EX 486 nm filter (P/N 034-0486), EM 520 nm filter (P/N 034-0520). Second pair includes: EX 520 nm filter (P/N 034-0520), EM 325-700 nm (P/N 10-058R) and greater than 610 nm filter (P/N 10-054R).
Filter o-rings (P/N 7000-949)
13 mm x 100 mm borosilicate glass test tubes (P/N 10-031)
LIVE/DEAD® BacLight(TM) Bacterial Viability Kit (catalog number L-7012), supplied by Molecular Probes, Inc., Eugene, OR. This kit consists of three components: Component A, 300 µL of 3.34 mM SYTO 9 in anhydrous DMSO, Component B, 300 µL of 20 mM propidium iodide in anhydrous DMSO, and Component C, 10 mL of BacLight mounting oil (this component is not used in the fluorometric assay described here). One kit is sufficient for analysis of about 65 samples using this protocol. Handling, storage and the use of the reagents should be performed in accordance with the product information sheet supplied by Molecular Probes.
Staphylococcus aureus suspension containing approximately 1 × 10-7 bacteria/mL. To adjust the concentration of the bacterial suspension, take a 3 mL sample in a 10 mm × 10 mm cuvette and measure the optical density at 670 nm (OD670) using a spectrophotometer. 1 × 10-7 bacteria/mL corresponds to OD670 ~0.15. Microcentrifuge (SUREspin(TM) Model 7040, Helena Labs, Beaumont, TX).
Isopropyl alcohol.
Table 1
Table 1. Preparation of isopropyl alcohol/water mixtures
3. Experimental Protocol
3.1. Disinfectant Treatment of Staphylococcus aureus with Isopropyl Alcohol
3.1.1 In a set of 5 labeled tubes, prepare 0, 10, 30, 70 and 100% isopropyl alcohol/water mixtures as outlined in Table 1.
3.1.2 Label a set of 5 microfuge tubes with the designation 0, 10, 30, 70, or 100%.
3.1.3 Transfer 1 mL of Staphylococcus aureus suspension to each of the labeled microfuge tubes[A].
3.1.4 Centrifuge the microfuge tubes for 3 minutes at 10,000 rpm.
3.1.5 Remove and discard the supernatant from each microfuge tube using a glass Pasteur pipet.
3.1.6 Break up the bacterial pellets and resuspend each in 1 mL of 0, 10, 30, 70 or 100% isopropyl alcohol/water (step 3.1.1) according to the designation on the tube. For example, resuspend the pellet in the microfuge tube marked 10% in 1 mL of 10% isopropyl alcohol.
3.1.7 Incubate the bacterial suspensions in alcohol/water mixtures for 1 hour at room temperature.
3.1.8 Centrifuge the bacterial suspensions for 3 minutes at 10,000 rpm.
3.1.9 Break up bacterial pellets and resuspend each in 1 mL of sterile filtered water.
3.1.10 Centrifuge bacterial suspensions for 3 minutes at 10,000 rpm.
3.1.11 Break up bacterial pellets and resuspend each in 1.5 mL of sterile filtered water.[A]
[A] Although the experiment described here is based on a comparison of samples containing equal numbers of bacteria, it is also possible to compare viability of bacterial samples with different densities because the ratio of green to red fluorescence is relatively independent of the number of bacteria present.
3.2 Bacterial Staining
3.2.1 Prepare a 2X BacLight staining solution from the kit reagents by mixing 3 uL of component A and 3 uL of component B per 1 mL of sterile water. To prepare sufficient staining solution for the five samples and one reagent blank used in the experiment described here, add 27 uL of BacLight component A and 27 uL of BacLight component B to 9 mL of sterile water.
3.2.2 Label six 13 mm glass test tubes with reagent blank, 0, 10, 30, 70, and 100%.
3.2.3 Transfer 1.5 mL of 2X BacLight (prepared in 3.2.1) to each labeled test tube.
3.2.4 Transfer 1.5 mL of sterile water to the reagent blank tube, making up a total of 3 mL in this test tube.
3.2.5 Transfer 1.5 mL of the isopropyl alcohol-exposed Staphylococcus aureus from the microfuge tubes to the correspondingly labeled glass test tubes, making up a total of 3 mL in each test tube.
3.3 Fluorescence Measurements (Green Fluorescence)
3.3.1 Install the 486 nm filter in A-EX and 520 nm filter in A-EM.
3.3.2 Rotate the TD-700 filter cylinder to place the 485 nm excitation and 530 nm emission filters in the optical path.
3.3.3 You will be performing a simple mode calibration (refer to your manual if need be). Press "enter" from the keypad. Select [1] on the keypad to enter "setup" then select [1] to enter "mode".
3.3.4 Using the arrow key to choose the mode, select "simple, then [ESC] twice to return to the setup/calibration screen. Select [2], then press [ENTER].
3.3.5 The TD-700 will prompt you to insert a typical sample. Insert the sample containing the largest number of live bacteria; this sample should have the highest intensity of green fluorescence among those to be measured. In the experiment described here, this will be the sample containing 0% isopropyl alcohol.
3.3.6 Press [ENTER]. The instrument detection sensitivity will be automatically optimized to match the fluorescence of the sample. When the screen indicates that the sample is 500, press [ENTER]. Your TD-700 is now calibrated.
3.3.7 Press [ENTER] again and read the remaining samples in the order of reagent blank followed by the bacterial samples in order of increasing isopropyl alcohol concentration.
3.3.8 For each sample, record the fluorescence intensity value shown on the fluorometer display screen. To equalize any photobleaching effects, insert samples into the fluorometer for approximately equal time periods. Correct data for the dye background by subtracting the reagent blank fluorescence value from each bacterial sample fluorescence reading.
3.4 Fluorescence Measurements (Red Fluorescence)
3.4.1 Rotate the TD-700 filter cylinder to place the 520 nm excitation and 325-700 nm and greater than 610 nm emission filters in the optical path ("B" on the left hand side lined up with silver dot).
3.4.2 Press [ENTER] on the TD-700 key pad.
3.4.3 Select [2] CALIBRATION from the displayed options.
3.4.4 Insert the sample containing the largest number of dead bacteria; this sample should have the highest intensity of red fluorescence among those to be measured. In the experiment described here, this will be the sample containing 100% isopropyl alcohol.
3.4.5 Press ENTER. The instrument detection sensitivity will be automatically optimized to match the fluorescence of the sample.
3.4.6 Press ENTER again and read the remaining samples in the order of reagent blank followed by the bacterial samples in order of increasing isopropyl alcohol concentration.
3.4.7 For each sample, record the fluorescence intensity value shown on the fluorometer display screen. To equalize any photobleaching effects, insert samples into the fluorometer for approximately equal time periods. Correct data for the dye background by subtracting the reagent blank fluorescence value from each bacterial sample fluorescence reading.
3.5 Data Analysis and Interpretation
3.5.1 For each sample, divide the background-corrected green fluorescence intensity by the background-corrected red fluorescence intensity.
3.5.2 Plot the calculated green/red fluorescence intensity ratio (Y-axis) as a function of isopropyl alcohol concentration (X-axis).
3.5.3 Plotted data should show decreasing green/red fluorescence intensity ratios as the number of dead bacteria increases (i.e. as the isopropyl alcohol concentration increases; Figure 1).
Figure 1
Figure 1. Analysis of Staphylococcus aureus viability following one hour exposure to varying concentrations of isopropyl alcohol. The TD-700 Laboratory Fluorometer was used to separately quantitate the green and red fluorescence emission produced by staining with SYTO 9 and propidium iodide respectively. The ratio of green/red fluorescence intensity was calculated for each sample and plotted against isopropyl alcohol concentration.
4. References
J Appl Bacteriol 72, 410 (1992)
Lett Appl Microbiol 13, 58 (1991)
Curr Microbiol 4, 321 (1980)
J Microbiol Meth 13, 87 (1991)
5. Patent and Trademark Information
LIVE/DEAD and SYTO are registered trademarks of Molecular Probes, Inc. BacLight is a trademark of Molec
The Turner BioSystems TD-700 Laboratory Fluorometer in combination with Molecular Probes' LIVE/DEAD® BacLightTM Bacterial Viability Kit provides a novel two-color fluorescence assay of bacterial viability that allows researchers to quantitatively distinguish live and dead bacteria in minutes, even in a mixed population containing a range of bacterial types. Conventional direct-count assays of bacterial viability are based on metabolic characteristics or membrane integrity. However, methods relying on metabolic characteristics often only work for a limited subset of bacterial groups,(1) and methods for assessing bacterial membrane integrity commonly have high levels of background fluorescence.(2) Both types of determinations suffer from being very sensitive to growth and staining conditions.(3,4)
The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability assay utilizes mixtures of SYTO® 9 green fluorescent nucleic acid stain and the red fluorescent nucleic acid stain, propidium iodide. These stains differ both in their spectral characteristics and in their ability to penetrate healthy bacterial cells. When used alone, the SYTO 9 stain labels bacteria with both intact and damaged membranes. In contrast, propidium iodide penetrates only bacteria with damaged membranes, competing with the SYTO 9 stain for nucleic acid binding sites when both dyes are present. When mixed in recommended proportions, SYTO 9 stain and propidium iodide produce green fluorescent staining of bacteria with intact cell membranes and red fluorescent staining of bacteria with damaged membranes. The background remains virtually nonfluorescent. Consequently, the ratio of green to red fluorescence intensities provides a quantitative index of bacterial viability (Figure 1).
2. Materials Required
Turner BioSystems TD-700 Laboratory Fluorometer with standard PMT (P/N 7000-009)
Quartz-halogen lamp (P/N 7000-930)
13 mm round test tube adapter (P/N 7000-981)
Two pairs of filters are required: First pair includes: EX 486 nm filter (P/N 034-0486), EM 520 nm filter (P/N 034-0520). Second pair includes: EX 520 nm filter (P/N 034-0520), EM 325-700 nm (P/N 10-058R) and greater than 610 nm filter (P/N 10-054R).
Filter o-rings (P/N 7000-949)
13 mm x 100 mm borosilicate glass test tubes (P/N 10-031)
LIVE/DEAD® BacLight(TM) Bacterial Viability Kit (catalog number L-7012), supplied by Molecular Probes, Inc., Eugene, OR. This kit consists of three components: Component A, 300 µL of 3.34 mM SYTO 9 in anhydrous DMSO, Component B, 300 µL of 20 mM propidium iodide in anhydrous DMSO, and Component C, 10 mL of BacLight mounting oil (this component is not used in the fluorometric assay described here). One kit is sufficient for analysis of about 65 samples using this protocol. Handling, storage and the use of the reagents should be performed in accordance with the product information sheet supplied by Molecular Probes.
Staphylococcus aureus suspension containing approximately 1 × 10-7 bacteria/mL. To adjust the concentration of the bacterial suspension, take a 3 mL sample in a 10 mm × 10 mm cuvette and measure the optical density at 670 nm (OD670) using a spectrophotometer. 1 × 10-7 bacteria/mL corresponds to OD670 ~0.15. Microcentrifuge (SUREspin(TM) Model 7040, Helena Labs, Beaumont, TX).
Isopropyl alcohol.
Table 1
Table 1. Preparation of isopropyl alcohol/water mixtures
3. Experimental Protocol
3.1. Disinfectant Treatment of Staphylococcus aureus with Isopropyl Alcohol
3.1.1 In a set of 5 labeled tubes, prepare 0, 10, 30, 70 and 100% isopropyl alcohol/water mixtures as outlined in Table 1.
3.1.2 Label a set of 5 microfuge tubes with the designation 0, 10, 30, 70, or 100%.
3.1.3 Transfer 1 mL of Staphylococcus aureus suspension to each of the labeled microfuge tubes[A].
3.1.4 Centrifuge the microfuge tubes for 3 minutes at 10,000 rpm.
3.1.5 Remove and discard the supernatant from each microfuge tube using a glass Pasteur pipet.
3.1.6 Break up the bacterial pellets and resuspend each in 1 mL of 0, 10, 30, 70 or 100% isopropyl alcohol/water (step 3.1.1) according to the designation on the tube. For example, resuspend the pellet in the microfuge tube marked 10% in 1 mL of 10% isopropyl alcohol.
3.1.7 Incubate the bacterial suspensions in alcohol/water mixtures for 1 hour at room temperature.
3.1.8 Centrifuge the bacterial suspensions for 3 minutes at 10,000 rpm.
3.1.9 Break up bacterial pellets and resuspend each in 1 mL of sterile filtered water.
3.1.10 Centrifuge bacterial suspensions for 3 minutes at 10,000 rpm.
3.1.11 Break up bacterial pellets and resuspend each in 1.5 mL of sterile filtered water.[A]
[A] Although the experiment described here is based on a comparison of samples containing equal numbers of bacteria, it is also possible to compare viability of bacterial samples with different densities because the ratio of green to red fluorescence is relatively independent of the number of bacteria present.
3.2 Bacterial Staining
3.2.1 Prepare a 2X BacLight staining solution from the kit reagents by mixing 3 uL of component A and 3 uL of component B per 1 mL of sterile water. To prepare sufficient staining solution for the five samples and one reagent blank used in the experiment described here, add 27 uL of BacLight component A and 27 uL of BacLight component B to 9 mL of sterile water.
3.2.2 Label six 13 mm glass test tubes with reagent blank, 0, 10, 30, 70, and 100%.
3.2.3 Transfer 1.5 mL of 2X BacLight (prepared in 3.2.1) to each labeled test tube.
3.2.4 Transfer 1.5 mL of sterile water to the reagent blank tube, making up a total of 3 mL in this test tube.
3.2.5 Transfer 1.5 mL of the isopropyl alcohol-exposed Staphylococcus aureus from the microfuge tubes to the correspondingly labeled glass test tubes, making up a total of 3 mL in each test tube.
3.3 Fluorescence Measurements (Green Fluorescence)
3.3.1 Install the 486 nm filter in A-EX and 520 nm filter in A-EM.
3.3.2 Rotate the TD-700 filter cylinder to place the 485 nm excitation and 530 nm emission filters in the optical path.
3.3.3 You will be performing a simple mode calibration (refer to your manual if need be). Press "enter" from the keypad. Select [1] on the keypad to enter "setup" then select [1] to enter "mode".
3.3.4 Using the arrow key to choose the mode, select "simple, then [ESC] twice to return to the setup/calibration screen. Select [2], then press [ENTER].
3.3.5 The TD-700 will prompt you to insert a typical sample. Insert the sample containing the largest number of live bacteria; this sample should have the highest intensity of green fluorescence among those to be measured. In the experiment described here, this will be the sample containing 0% isopropyl alcohol.
3.3.6 Press [ENTER]. The instrument detection sensitivity will be automatically optimized to match the fluorescence of the sample. When the screen indicates that the sample is 500, press [ENTER]. Your TD-700 is now calibrated.
3.3.7 Press [ENTER] again and read the remaining samples in the order of reagent blank followed by the bacterial samples in order of increasing isopropyl alcohol concentration.
3.3.8 For each sample, record the fluorescence intensity value shown on the fluorometer display screen. To equalize any photobleaching effects, insert samples into the fluorometer for approximately equal time periods. Correct data for the dye background by subtracting the reagent blank fluorescence value from each bacterial sample fluorescence reading.
3.4 Fluorescence Measurements (Red Fluorescence)
3.4.1 Rotate the TD-700 filter cylinder to place the 520 nm excitation and 325-700 nm and greater than 610 nm emission filters in the optical path ("B" on the left hand side lined up with silver dot).
3.4.2 Press [ENTER] on the TD-700 key pad.
3.4.3 Select [2] CALIBRATION from the displayed options.
3.4.4 Insert the sample containing the largest number of dead bacteria; this sample should have the highest intensity of red fluorescence among those to be measured. In the experiment described here, this will be the sample containing 100% isopropyl alcohol.
3.4.5 Press ENTER. The instrument detection sensitivity will be automatically optimized to match the fluorescence of the sample.
3.4.6 Press ENTER again and read the remaining samples in the order of reagent blank followed by the bacterial samples in order of increasing isopropyl alcohol concentration.
3.4.7 For each sample, record the fluorescence intensity value shown on the fluorometer display screen. To equalize any photobleaching effects, insert samples into the fluorometer for approximately equal time periods. Correct data for the dye background by subtracting the reagent blank fluorescence value from each bacterial sample fluorescence reading.
3.5 Data Analysis and Interpretation
3.5.1 For each sample, divide the background-corrected green fluorescence intensity by the background-corrected red fluorescence intensity.
3.5.2 Plot the calculated green/red fluorescence intensity ratio (Y-axis) as a function of isopropyl alcohol concentration (X-axis).
3.5.3 Plotted data should show decreasing green/red fluorescence intensity ratios as the number of dead bacteria increases (i.e. as the isopropyl alcohol concentration increases; Figure 1).
Figure 1
Figure 1. Analysis of Staphylococcus aureus viability following one hour exposure to varying concentrations of isopropyl alcohol. The TD-700 Laboratory Fluorometer was used to separately quantitate the green and red fluorescence emission produced by staining with SYTO 9 and propidium iodide respectively. The ratio of green/red fluorescence intensity was calculated for each sample and plotted against isopropyl alcohol concentration.
4. References
J Appl Bacteriol 72, 410 (1992)
Lett Appl Microbiol 13, 58 (1991)
Curr Microbiol 4, 321 (1980)
J Microbiol Meth 13, 87 (1991)
5. Patent and Trademark Information
LIVE/DEAD and SYTO are registered trademarks of Molecular Probes, Inc. BacLight is a trademark of Molec
0/5000
7 Press [ENTER] again and read the remaining samples in the order of reagent blank followed by the bacterial samples in order of increasing isopropyl alcohol concentration.
3.3.8 For each sample, record the fluorescence intensity value shown on the fluorometer display screen. To equalize any photobleaching effects, insert samples into the fluorometer for approximately equal time periods.1. แนะนำ
เดอะเทอร์เนอร์ BioSystems TD-700 ห้องปฏิบัติ Fluorometer ร่วมกับโมเลกุล Probes' LIVE/ตาย ® BacLightTM แบคทีเรียชีวิตชุดช่วยให้การวิเคราะห์นวนิยายสองสี fluorescence ของชีวิตแบคทีเรียที่ช่วยให้นักวิจัย quantitatively แยกแยะแบคทีเรียอยู่ และตายในนาที แม้ในประชากรผสมประกอบด้วยหลากหลายชนิดของแบคทีเรีย ปกติ assays ตรงจำนวนของแบคทีเรียนี้ขึ้นอยู่กับลักษณะที่เผาผลาญหรือเมมเบรนความ อย่างไรก็ตาม วิธีการอาศัยลักษณะเผาผลาญมักจะทำการย่อยของแบคทีเรีย groups,(1) จำกัดและวิธีการประเมินความสมบูรณ์ของเมมเบรนของแบคทีเรียโดยทั่วไปมีพื้น fluorescence ระดับสูง คราบเหล่านี้แตกต่างกันทั้ง ในลักษณะของสเปกตรัม และความสามารถในการเข้าเซลล์แบคทีเรียเพื่อสุขภาพ ใช้คนเดียว คราบ SYTO 9 ป้ายชื่อแบคทีเรีย ด้วยสารเหมือนเดิม และเสียหาย ในทางตรงกันข้าม ไอโอไดด์ propidium แทรกซึมแบคทีเรียกับเข้าเสียหาย การแข่งขันกับคราบ SYTO 9 กรดนิวคลีอิกรวมเที่ยวเมื่อทั้งสองสีมีอยู่(2) ประสบ determinations ทั้งสองชนิดมีความสำคัญมากในการเจริญเติบโต และสภาพการย้อมสี(3, 4)
วิเคราะห์ที่ LIVE/ตาย BacLight แบคทีเรียนี้ใช้ส่วนผสมของ SYTO ® 9 กรดนิวคลีอิกเรืองแสงสีเขียวคราบและคราบสีแดงเรืองแสงเอ็น ไอโอไดด์ propidium เมื่อผสม สัดส่วน SYTO 9 คราบ และ propidium แนะนำไอโอไดด์ผลิตสีเขียวเรืองแสงย้อมสีของแบคทีเรียกับเยื่อหุ้มเซลล์เหมือนเดิมและสีแดงเรืองแสงย้อมสีของแบคทีเรียด้วยสารเสียหาย พื้นหลังยังคงลุก nonfluorescent ดังนั้น อัตราส่วนของสีเขียวเพื่อการปลดปล่อยก๊าซ fluorescence สีแดงแสดงดัชนีเชิงปริมาณของแบคทีเรียนี้ (รูปที่ 1) .
2 วัสดุที่จำเป็น
เทอร์เนอร์ BioSystems Fluorometer TD-700 ห้องปฏิบัติการกับมาตรฐาน PMT (P/N 7000-009)
ควอตซ์เจน (P/N 7000-930)
13 มม.ปัดเศษหลอดทดสอบการ์ด (P/N 7000-981)
สองคู่ของตัวกรองจำเป็น: คู่แรกรวม: EX 486 nm กรอง (P/N 034-0486) EM 520 nm กรอง (P/N 034-0520) คู่ที่สองมี: EX 520 nm กรอง (P/N 034-0520), EM 325-700 นาโนเมตร (P/N 10 058R) มากกว่า 610 nm กรอง (P/N 10 054R) .
กรองโอริง (P/N 7000-949)
หลอดทดสอบแก้ว borosilicate 13 มม. x 100 มม. (P/N 10-031)
สด/ตาย® BacLight(TM) แบคทีเรียนี้ชุด (แค็ตตาล็อกจำนวน L 7012), จัด โดยโมเลกุลคลิปปากตะเข้ Inc., Eugene, OR ชุดนี้ประกอบด้วยส่วนประกอบที่ 3: ส่วนประกอบ A, 300 µL SYTO 9 มม. 3.34 ใน DMSO ได ส่วนประกอบ B µL 300 ของ 20 มม. propidium ไอโอไดด์ในได DMSO และคอมโพเนนต์ C, 10 mL ของ BacLight ติดตั้งน้ำมัน (คอมโพเนนต์นี้ไม่ได้ใช้ในการทดสอบ fluorometric ที่อธิบายไว้ที่นี่) ชุดหนึ่งเพียงพอสำหรับการวิเคราะห์อย่างประมาณ 65 ที่ใช้โพรโทคอลนี้ จัดการ จัดเก็บและการใช้ reagents ควรดำเนินการตามเอกสารข้อมูลของผลิตภัณฑ์โดยโมเลกุล Probes.
ระงับหมอเทศข้างลาย staphylococcus ที่ประกอบด้วยประมาณ 1 × 10-7 แบคทีเรีย/mL การปรับความเข้มข้นของการระงับเชื้อแบคทีเรีย มีตัวอย่าง 3 mL ใน cuvette 10 มม. × 10 มม. และวัดความหนาแน่นออปติคัลที่ 670 nm (OD670) ใช้เป็นเครื่องทดสอบกรดด่าง 1 × 10-7 แบคทีเรีย/mL ที่สอดคล้องกับ OD670 ~ 0.15 Microcentrifuge (SUREspin(TM) รุ่น 7040 เฮเลนา Labs โบมอนต์ TX) .
แอลกอฮอล์ Isopropyl
3 mL 1 ของ Staphylococcus หมอเทศข้างลายระงับโอนย้ายแต่ละหลอด microfuge ป้าย [A]
3.1.4 Centrifuge หลอด microfuge 3 นาทีที่ 10000 รอบต่อนาที
3.1.5 เอา และละทิ้ง supernatant จากแต่ละหลอด microfuge ใช้แก้ว pipet เมืองบันดุง
3.1.6 แบ่งขึ้นขี้แบคทีเรีย และ resuspend แต่ละใน 1 mL 0, 10, 30, 70 หรือ 100% แอลกอฮอล์ isopropyl/น้ำ (ขั้นตอน 3.1ตารางที่ 1
1 ตาราง เตรียมส่วนผสมของแอลกอฮอล์ isopropyl/น้ำ
3 โพรโทคอลการทดลอง
3.1 หมอเทศข้างลายรักษา Staphylococcus ยาฆ่าเชื้อ ด้วยแอลกอฮอล์ Isopropyl
3.1.1 ในชุด 5 หลอดป้าย เตรียมน้ำยาผสมแอลกอฮอล์ isopropyl/น้ำ 0, 10, 30, 70 และ 100% ตามที่ระบุไว้ในตารางที่ 1.
3.1.2 ป้ายชื่อชุด 5 หลอด microfuge กับ%กำหนด 0, 10, 30, 70 หรือ 100
3.11) ตามที่จะกำหนดในหลอด ตัวอย่าง resuspend เม็ดในหลอด microfuge เครื่อง 10% ใน 1 mL ของ 10% แอลกอฮอล์ isopropyl
3.1.7 ฟักฟโรแบคทีเรียในน้ำยาผสมแอลกอฮอล์/น้ำ 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง
3.1.8 Centrifuge ฟโรแบคทีเรีย 3 นาทีที่ 10000 รอบต่อนาที
3.1แบ่ง 9 ขึ้นขี้แบคทีเรีย และ resuspend ใน 1 mL ของกระบอกกรองน้ำแต่ละ
เครื่องหมุนเหวี่ยง 3.1.10 แบคทีเรียพัก 3 นาทีที่ 10000 รอบต่อนาที
3.1.11 แบ่งขึ้นขี้แบคทีเรีย และ resuspend แต่ละใน 1.5 mL กรองน้ำฆ่าเชื้อ[A]
[A] แม้ว่าการทดลองอธิบายไว้ที่นี่ขึ้นอยู่กับการเปรียบเทียบตัวอย่างที่ประกอบด้วยจำนวนแบคทีเรีย เท่า สามารถเปรียบเทียบชีวิตของตัวอย่างเชื้อแบคทีเรียที่มีความหนาแน่นแตกต่างกันเนื่องจากอัตราส่วนของสีเขียวกับแดง fluorescence จะค่อนข้างขึ้นอยู่กับจำนวนของแบคทีเรียปัจจุบัน
3.2 การย้อมสีแบคทีเรีย
3.2.1 เตรียม 2 X BacLight ย้อมสีโซลูชันจาก reagents ชุดโดย uL 3 ผสมประกอบ A และ uL 3 ของส่วนผสม B ต่อ 1 mL ใส่น้ำ4 โอน 1.5 mL ใส่น้ำกับรีเอเจนต์ว่างท่อ ทำขึ้นจำนวน 3 mL ในหลอดทดสอบนี้
3.2.5 โอนย้าย 1.5 mL ของหมอเทศข้างลาย Staphylococcus แอลกอฮอล์ isopropyl สัมผัสจากหลอด microfuge ไปที่ป้ายเรียบทดสอบหลอด ทำขึ้นจำนวน 3 mL ในหลอดทดสอบละกัน
3.3 วัด Fluorescence (กรี Fluorescence)
3.3 การเตรียมพอย้อมสีโซลูชั่นสำหรับตัวอย่างห้าและหนึ่งรีเอเจนต์ว่างใช้ในการทดลองที่อธิบายไว้ที่นี่ เพิ่ม uL 27 A BacLight คอมโพเนนต์และ uL 27 ของ BacLight ส่วนประกอบ B 9 mL ของกระบอกน้ำ
3.2.2 ป้าย 6 หลอดทดสอบกระจก 13 mm กับรีเอเจนต์ว่าง 0, 10, 30, 70 และ 100%
มลโอน 1.5 3.2.3 2 X BacLight (เตรียมใน 3.2.1) แต่ละป้ายหลอดทดสอบ
3.21 ติดตั้งตัวกรอง nm 486 ในกรอง A EX และ 520 nm ใน A-EM
3.3.2 หมุนถังกรอง TD-700 สามารถวางในการกระตุ้น nm 485 และกรองมลพิษที่ 530 nm path. แสง
3.3.3 คุณจะทำเทียบโหมดปกติ (หมายถึงถ้าของคุณด้วยตนเองจำเป็น) กด "ใส่" จากแป้นพิมพ์ เลือก [1] บนแป้นพิมพ์เพื่อป้อน "ตั้งค่า" แล้วเลือก [1] เพื่อป้อน "โหมด"
3.3 ในการทดลองที่อธิบายไว้ที่นี่ นี้จะเป็นตัวอย่างที่ประกอบด้วย 0% แอลกอฮอล์ isopropyl.
3.3.6 กด [ENTER] ความไวในการตรวจสอบเครื่องมือจะสามารถปรับให้ตรงกับ fluorescence ของตัวอย่างโดยอัตโนมัติ เมื่อหน้าจอบ่งชี้ว่า ตัวอย่าง 500 กด [ENTER] ขณะนี้มีการปรับเทียบของคุณ TD-700.
3.3ใช้แป้นลูกศรเพื่อเลือกโหมด เลือก "ง่าย นั้น [ESC] สองครั้งเพื่อกลับสู่หน้าจอการตั้งค่า/เทียบ 4 เลือก [2], จาก นั้นกด [ENTER] .
3.3.5 TD-700 จะพร้อมท์ให้คุณใส่ตัวอย่างทั่วไป ตัวอย่างที่ประกอบด้วยจำนวนแบคทีเรียสด แทรก อย่างนี้ควรมีความเข้มสูงสุดของ fluorescence สีเขียวที่จะวัด7 กด [ENTER] อีกครั้ง และอ่านตัวอย่างที่เหลือกับรีเอเจนต์ว่างตามตัวอย่างแบคทีเรียเพื่อเพิ่มความเข้มข้นแอลกอฮอล์ isopropyl.
3.3.8 สำหรับแต่ละตัวอย่าง บันทึกค่าความเข้ม fluorescence ที่แสดงบนหน้าจอแสดงผล fluorometer จะป้อนกล่องผลใด ๆ photobleaching ใส่ตัวอย่างลงใน fluorometer ที่สำหรับรอบระยะเวลาเท่ากันประมาณ2 กด [ENTER] บน TD-700 คีย์แผ่น
3.4.3 เลือกเทียบ [2] จากการแสดงตัวเลือกการ
3.4.4 แทรกตัวอย่างที่ประกอบด้วยจำนวนแบคทีเรียตาย อย่างนี้ควรมีความเข้มสูงสุดของ fluorescence สีแดงที่จะวัด ในการทดลองที่อธิบายไว้ที่นี่ นี้จะเป็นตัวอย่างที่ประกอบด้วย 100% แอลกอฮอล์ isopropyl
3.4.5 กดป้อน ข้อมูลพื้นหลังย้อมโดยการลบค่ารีเอเจนต์ fluorescence ว่างจากแบคทีเรียแต่ละตัวอย่าง fluorescence อ่านถูกต้อง
3.4 วัด Fluorescence (แดง Fluorescence)
3.4.1 หมุนถังกรอง TD-700 ถึง 520 nm ในการกระตุ้นและ 325-700 nm มากกว่า 610 nm กรองมลพิษในเส้นทางออปติคอล ("B" ทางด้านซ้ายมือเรียงกัน มีจุดเงิน) .
3.4 ความไวในการตรวจสอบเครื่องมือจะถูกโดยอัตโนมัติเหมาะเพื่อ fluorescence ของตัวอย่าง
3.4.6 กด ENTER อีกครั้งและอ่านเหลือตัวอย่างกับรีเอเจนต์ว่างตามตัวอย่างแบคทีเรียเพื่อเพิ่มความเข้มข้นแอลกอฮอล์ isopropyl.
3.4.7 สำหรับแต่ละตัวอย่าง บันทึกค่าความเข้ม fluorescence ที่แสดงบนหน้าจอแสดงผล fluorometer จะป้อนกล่องผลใด ๆ photobleaching ใส่ตัวอย่างลงใน fluorometer ที่สำหรับรอบระยะเวลาเท่ากันประมาณ แก้ไขข้อมูลพื้นหลังย้อมโดยการลบค่ารีเอเจนต์ fluorescence ว่างจากแบคทีเรียแต่ละตัวอย่างอ่าน fluorescence ขึ้น
3.5 การวิเคราะห์ข้อมูลและตีความ
3.5.1 สำหรับแต่ละตัวอย่าง แบ่งความเข้มพื้นหลังแก้ไข fluorescence สีเขียว โดยความเข้มพื้นหลังแก้ไข fluorescence สีแดง
3.5.2 ภาพพล็อตอัตราส่วนความเข้มคำนวณ fluorescence สีเขียว/แดง (แกน y) เป็นฟังก์ชันของความเข้มข้นแอลกอฮอล์ isopropyl (แกน x) .
3.5.3 Plotted ข้อมูลควรแสดงการลดลงอัตราส่วนความเข้ม fluorescence สีเขียว/แดงเป็นจำนวนแบคทีเรียตายเพิ่ม (เช่น อัตราส่วนของความเข้มของสีเขียว/แดง fluorescence ถูกคำนวณสำหรับแต่ละตัวอย่าง และพล็อตเทียบกับความเข้มข้นแอลกอฮอล์ isopropyl
4 อ้างอิง
J Appl Bacteriol 72, 410 (1992)
Lett Appl Microbiol 13, 58 (1991)
สกุล Microbiol 4, 321 (1980)
J Microbiol จาก 13, 87 (1991)
5 สิทธิบัตรและเครื่องหมายการค้าข้อมูล
สด/ตายและ SYTO เป็นเครื่องหมายการค้าจดทะเบียนของอณูคลิปปากตะเข้ inc เป็นการเพิ่มความเข้มข้นแอลกอฮอล์ isopropyl รูปที่ 1) .
รูป 1
1 รูป วิเคราะห์ Staphylococcus หมอเทศข้างลายชีวิตต่อหนึ่งชั่วโมงสัมผัสกับความเข้มข้นแตกต่างกันของแอลกอฮอล์ isopropyl Fluorometer ปฏิบัติ TD-700 ที่ใช้แยก quantitate มลพิษ fluorescence สีเขียว และสีแดงผลิต โดยย้อมสีด้วย SYTO 9 และ propidium ไอโอไดด์ตามลำดับ BacLight เป็นเครื่องหมายการค้าของ Molec
3.3.8 For each sample, record the fluorescence intensity value shown on the fluorometer display screen. To equalize any photobleaching effects, insert samples into the fluorometer for approximately equal time periods.1. แนะนำ
เดอะเทอร์เนอร์ BioSystems TD-700 ห้องปฏิบัติ Fluorometer ร่วมกับโมเลกุล Probes' LIVE/ตาย ® BacLightTM แบคทีเรียชีวิตชุดช่วยให้การวิเคราะห์นวนิยายสองสี fluorescence ของชีวิตแบคทีเรียที่ช่วยให้นักวิจัย quantitatively แยกแยะแบคทีเรียอยู่ และตายในนาที แม้ในประชากรผสมประกอบด้วยหลากหลายชนิดของแบคทีเรีย ปกติ assays ตรงจำนวนของแบคทีเรียนี้ขึ้นอยู่กับลักษณะที่เผาผลาญหรือเมมเบรนความ อย่างไรก็ตาม วิธีการอาศัยลักษณะเผาผลาญมักจะทำการย่อยของแบคทีเรีย groups,(1) จำกัดและวิธีการประเมินความสมบูรณ์ของเมมเบรนของแบคทีเรียโดยทั่วไปมีพื้น fluorescence ระดับสูง คราบเหล่านี้แตกต่างกันทั้ง ในลักษณะของสเปกตรัม และความสามารถในการเข้าเซลล์แบคทีเรียเพื่อสุขภาพ ใช้คนเดียว คราบ SYTO 9 ป้ายชื่อแบคทีเรีย ด้วยสารเหมือนเดิม และเสียหาย ในทางตรงกันข้าม ไอโอไดด์ propidium แทรกซึมแบคทีเรียกับเข้าเสียหาย การแข่งขันกับคราบ SYTO 9 กรดนิวคลีอิกรวมเที่ยวเมื่อทั้งสองสีมีอยู่(2) ประสบ determinations ทั้งสองชนิดมีความสำคัญมากในการเจริญเติบโต และสภาพการย้อมสี(3, 4)
วิเคราะห์ที่ LIVE/ตาย BacLight แบคทีเรียนี้ใช้ส่วนผสมของ SYTO ® 9 กรดนิวคลีอิกเรืองแสงสีเขียวคราบและคราบสีแดงเรืองแสงเอ็น ไอโอไดด์ propidium เมื่อผสม สัดส่วน SYTO 9 คราบ และ propidium แนะนำไอโอไดด์ผลิตสีเขียวเรืองแสงย้อมสีของแบคทีเรียกับเยื่อหุ้มเซลล์เหมือนเดิมและสีแดงเรืองแสงย้อมสีของแบคทีเรียด้วยสารเสียหาย พื้นหลังยังคงลุก nonfluorescent ดังนั้น อัตราส่วนของสีเขียวเพื่อการปลดปล่อยก๊าซ fluorescence สีแดงแสดงดัชนีเชิงปริมาณของแบคทีเรียนี้ (รูปที่ 1) .
2 วัสดุที่จำเป็น
เทอร์เนอร์ BioSystems Fluorometer TD-700 ห้องปฏิบัติการกับมาตรฐาน PMT (P/N 7000-009)
ควอตซ์เจน (P/N 7000-930)
13 มม.ปัดเศษหลอดทดสอบการ์ด (P/N 7000-981)
สองคู่ของตัวกรองจำเป็น: คู่แรกรวม: EX 486 nm กรอง (P/N 034-0486) EM 520 nm กรอง (P/N 034-0520) คู่ที่สองมี: EX 520 nm กรอง (P/N 034-0520), EM 325-700 นาโนเมตร (P/N 10 058R) มากกว่า 610 nm กรอง (P/N 10 054R) .
กรองโอริง (P/N 7000-949)
หลอดทดสอบแก้ว borosilicate 13 มม. x 100 มม. (P/N 10-031)
สด/ตาย® BacLight(TM) แบคทีเรียนี้ชุด (แค็ตตาล็อกจำนวน L 7012), จัด โดยโมเลกุลคลิปปากตะเข้ Inc., Eugene, OR ชุดนี้ประกอบด้วยส่วนประกอบที่ 3: ส่วนประกอบ A, 300 µL SYTO 9 มม. 3.34 ใน DMSO ได ส่วนประกอบ B µL 300 ของ 20 มม. propidium ไอโอไดด์ในได DMSO และคอมโพเนนต์ C, 10 mL ของ BacLight ติดตั้งน้ำมัน (คอมโพเนนต์นี้ไม่ได้ใช้ในการทดสอบ fluorometric ที่อธิบายไว้ที่นี่) ชุดหนึ่งเพียงพอสำหรับการวิเคราะห์อย่างประมาณ 65 ที่ใช้โพรโทคอลนี้ จัดการ จัดเก็บและการใช้ reagents ควรดำเนินการตามเอกสารข้อมูลของผลิตภัณฑ์โดยโมเลกุล Probes.
ระงับหมอเทศข้างลาย staphylococcus ที่ประกอบด้วยประมาณ 1 × 10-7 แบคทีเรีย/mL การปรับความเข้มข้นของการระงับเชื้อแบคทีเรีย มีตัวอย่าง 3 mL ใน cuvette 10 มม. × 10 มม. และวัดความหนาแน่นออปติคัลที่ 670 nm (OD670) ใช้เป็นเครื่องทดสอบกรดด่าง 1 × 10-7 แบคทีเรีย/mL ที่สอดคล้องกับ OD670 ~ 0.15 Microcentrifuge (SUREspin(TM) รุ่น 7040 เฮเลนา Labs โบมอนต์ TX) .
แอลกอฮอล์ Isopropyl
3 mL 1 ของ Staphylococcus หมอเทศข้างลายระงับโอนย้ายแต่ละหลอด microfuge ป้าย [A]
3.1.4 Centrifuge หลอด microfuge 3 นาทีที่ 10000 รอบต่อนาที
3.1.5 เอา และละทิ้ง supernatant จากแต่ละหลอด microfuge ใช้แก้ว pipet เมืองบันดุง
3.1.6 แบ่งขึ้นขี้แบคทีเรีย และ resuspend แต่ละใน 1 mL 0, 10, 30, 70 หรือ 100% แอลกอฮอล์ isopropyl/น้ำ (ขั้นตอน 3.1ตารางที่ 1
1 ตาราง เตรียมส่วนผสมของแอลกอฮอล์ isopropyl/น้ำ
3 โพรโทคอลการทดลอง
3.1 หมอเทศข้างลายรักษา Staphylococcus ยาฆ่าเชื้อ ด้วยแอลกอฮอล์ Isopropyl
3.1.1 ในชุด 5 หลอดป้าย เตรียมน้ำยาผสมแอลกอฮอล์ isopropyl/น้ำ 0, 10, 30, 70 และ 100% ตามที่ระบุไว้ในตารางที่ 1.
3.1.2 ป้ายชื่อชุด 5 หลอด microfuge กับ%กำหนด 0, 10, 30, 70 หรือ 100
3.11) ตามที่จะกำหนดในหลอด ตัวอย่าง resuspend เม็ดในหลอด microfuge เครื่อง 10% ใน 1 mL ของ 10% แอลกอฮอล์ isopropyl
3.1.7 ฟักฟโรแบคทีเรียในน้ำยาผสมแอลกอฮอล์/น้ำ 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง
3.1.8 Centrifuge ฟโรแบคทีเรีย 3 นาทีที่ 10000 รอบต่อนาที
3.1แบ่ง 9 ขึ้นขี้แบคทีเรีย และ resuspend ใน 1 mL ของกระบอกกรองน้ำแต่ละ
เครื่องหมุนเหวี่ยง 3.1.10 แบคทีเรียพัก 3 นาทีที่ 10000 รอบต่อนาที
3.1.11 แบ่งขึ้นขี้แบคทีเรีย และ resuspend แต่ละใน 1.5 mL กรองน้ำฆ่าเชื้อ[A]
[A] แม้ว่าการทดลองอธิบายไว้ที่นี่ขึ้นอยู่กับการเปรียบเทียบตัวอย่างที่ประกอบด้วยจำนวนแบคทีเรีย เท่า สามารถเปรียบเทียบชีวิตของตัวอย่างเชื้อแบคทีเรียที่มีความหนาแน่นแตกต่างกันเนื่องจากอัตราส่วนของสีเขียวกับแดง fluorescence จะค่อนข้างขึ้นอยู่กับจำนวนของแบคทีเรียปัจจุบัน
3.2 การย้อมสีแบคทีเรีย
3.2.1 เตรียม 2 X BacLight ย้อมสีโซลูชันจาก reagents ชุดโดย uL 3 ผสมประกอบ A และ uL 3 ของส่วนผสม B ต่อ 1 mL ใส่น้ำ4 โอน 1.5 mL ใส่น้ำกับรีเอเจนต์ว่างท่อ ทำขึ้นจำนวน 3 mL ในหลอดทดสอบนี้
3.2.5 โอนย้าย 1.5 mL ของหมอเทศข้างลาย Staphylococcus แอลกอฮอล์ isopropyl สัมผัสจากหลอด microfuge ไปที่ป้ายเรียบทดสอบหลอด ทำขึ้นจำนวน 3 mL ในหลอดทดสอบละกัน
3.3 วัด Fluorescence (กรี Fluorescence)
3.3 การเตรียมพอย้อมสีโซลูชั่นสำหรับตัวอย่างห้าและหนึ่งรีเอเจนต์ว่างใช้ในการทดลองที่อธิบายไว้ที่นี่ เพิ่ม uL 27 A BacLight คอมโพเนนต์และ uL 27 ของ BacLight ส่วนประกอบ B 9 mL ของกระบอกน้ำ
3.2.2 ป้าย 6 หลอดทดสอบกระจก 13 mm กับรีเอเจนต์ว่าง 0, 10, 30, 70 และ 100%
มลโอน 1.5 3.2.3 2 X BacLight (เตรียมใน 3.2.1) แต่ละป้ายหลอดทดสอบ
3.21 ติดตั้งตัวกรอง nm 486 ในกรอง A EX และ 520 nm ใน A-EM
3.3.2 หมุนถังกรอง TD-700 สามารถวางในการกระตุ้น nm 485 และกรองมลพิษที่ 530 nm path. แสง
3.3.3 คุณจะทำเทียบโหมดปกติ (หมายถึงถ้าของคุณด้วยตนเองจำเป็น) กด "ใส่" จากแป้นพิมพ์ เลือก [1] บนแป้นพิมพ์เพื่อป้อน "ตั้งค่า" แล้วเลือก [1] เพื่อป้อน "โหมด"
3.3 ในการทดลองที่อธิบายไว้ที่นี่ นี้จะเป็นตัวอย่างที่ประกอบด้วย 0% แอลกอฮอล์ isopropyl.
3.3.6 กด [ENTER] ความไวในการตรวจสอบเครื่องมือจะสามารถปรับให้ตรงกับ fluorescence ของตัวอย่างโดยอัตโนมัติ เมื่อหน้าจอบ่งชี้ว่า ตัวอย่าง 500 กด [ENTER] ขณะนี้มีการปรับเทียบของคุณ TD-700.
3.3ใช้แป้นลูกศรเพื่อเลือกโหมด เลือก "ง่าย นั้น [ESC] สองครั้งเพื่อกลับสู่หน้าจอการตั้งค่า/เทียบ 4 เลือก [2], จาก นั้นกด [ENTER] .
3.3.5 TD-700 จะพร้อมท์ให้คุณใส่ตัวอย่างทั่วไป ตัวอย่างที่ประกอบด้วยจำนวนแบคทีเรียสด แทรก อย่างนี้ควรมีความเข้มสูงสุดของ fluorescence สีเขียวที่จะวัด7 กด [ENTER] อีกครั้ง และอ่านตัวอย่างที่เหลือกับรีเอเจนต์ว่างตามตัวอย่างแบคทีเรียเพื่อเพิ่มความเข้มข้นแอลกอฮอล์ isopropyl.
3.3.8 สำหรับแต่ละตัวอย่าง บันทึกค่าความเข้ม fluorescence ที่แสดงบนหน้าจอแสดงผล fluorometer จะป้อนกล่องผลใด ๆ photobleaching ใส่ตัวอย่างลงใน fluorometer ที่สำหรับรอบระยะเวลาเท่ากันประมาณ2 กด [ENTER] บน TD-700 คีย์แผ่น
3.4.3 เลือกเทียบ [2] จากการแสดงตัวเลือกการ
3.4.4 แทรกตัวอย่างที่ประกอบด้วยจำนวนแบคทีเรียตาย อย่างนี้ควรมีความเข้มสูงสุดของ fluorescence สีแดงที่จะวัด ในการทดลองที่อธิบายไว้ที่นี่ นี้จะเป็นตัวอย่างที่ประกอบด้วย 100% แอลกอฮอล์ isopropyl
3.4.5 กดป้อน ข้อมูลพื้นหลังย้อมโดยการลบค่ารีเอเจนต์ fluorescence ว่างจากแบคทีเรียแต่ละตัวอย่าง fluorescence อ่านถูกต้อง
3.4 วัด Fluorescence (แดง Fluorescence)
3.4.1 หมุนถังกรอง TD-700 ถึง 520 nm ในการกระตุ้นและ 325-700 nm มากกว่า 610 nm กรองมลพิษในเส้นทางออปติคอล ("B" ทางด้านซ้ายมือเรียงกัน มีจุดเงิน) .
3.4 ความไวในการตรวจสอบเครื่องมือจะถูกโดยอัตโนมัติเหมาะเพื่อ fluorescence ของตัวอย่าง
3.4.6 กด ENTER อีกครั้งและอ่านเหลือตัวอย่างกับรีเอเจนต์ว่างตามตัวอย่างแบคทีเรียเพื่อเพิ่มความเข้มข้นแอลกอฮอล์ isopropyl.
3.4.7 สำหรับแต่ละตัวอย่าง บันทึกค่าความเข้ม fluorescence ที่แสดงบนหน้าจอแสดงผล fluorometer จะป้อนกล่องผลใด ๆ photobleaching ใส่ตัวอย่างลงใน fluorometer ที่สำหรับรอบระยะเวลาเท่ากันประมาณ แก้ไขข้อมูลพื้นหลังย้อมโดยการลบค่ารีเอเจนต์ fluorescence ว่างจากแบคทีเรียแต่ละตัวอย่างอ่าน fluorescence ขึ้น
3.5 การวิเคราะห์ข้อมูลและตีความ
3.5.1 สำหรับแต่ละตัวอย่าง แบ่งความเข้มพื้นหลังแก้ไข fluorescence สีเขียว โดยความเข้มพื้นหลังแก้ไข fluorescence สีแดง
3.5.2 ภาพพล็อตอัตราส่วนความเข้มคำนวณ fluorescence สีเขียว/แดง (แกน y) เป็นฟังก์ชันของความเข้มข้นแอลกอฮอล์ isopropyl (แกน x) .
3.5.3 Plotted ข้อมูลควรแสดงการลดลงอัตราส่วนความเข้ม fluorescence สีเขียว/แดงเป็นจำนวนแบคทีเรียตายเพิ่ม (เช่น อัตราส่วนของความเข้มของสีเขียว/แดง fluorescence ถูกคำนวณสำหรับแต่ละตัวอย่าง และพล็อตเทียบกับความเข้มข้นแอลกอฮอล์ isopropyl
4 อ้างอิง
J Appl Bacteriol 72, 410 (1992)
Lett Appl Microbiol 13, 58 (1991)
สกุล Microbiol 4, 321 (1980)
J Microbiol จาก 13, 87 (1991)
5 สิทธิบัตรและเครื่องหมายการค้าข้อมูล
สด/ตายและ SYTO เป็นเครื่องหมายการค้าจดทะเบียนของอณูคลิปปากตะเข้ inc เป็นการเพิ่มความเข้มข้นแอลกอฮอล์ isopropyl รูปที่ 1) .
รูป 1
1 รูป วิเคราะห์ Staphylococcus หมอเทศข้างลายชีวิตต่อหนึ่งชั่วโมงสัมผัสกับความเข้มข้นแตกต่างกันของแอลกอฮอล์ isopropyl Fluorometer ปฏิบัติ TD-700 ที่ใช้แยก quantitate มลพิษ fluorescence สีเขียว และสีแดงผลิต โดยย้อมสีด้วย SYTO 9 และ propidium ไอโอไดด์ตามลำดับ BacLight เป็นเครื่องหมายการค้าของ Molec
การแปล กรุณารอสักครู่..
1. Introduction
The Turner BioSystems TD-700 Laboratory Fluorometer in combination with Molecular Probes' LIVE/DEAD® BacLightTM Bacterial Viability Kit provides a novel two-color fluorescence assay of bacterial viability that allows researchers to quantitatively distinguish live and dead bacteria in minutes, even in a mixed population containing a range of bacterial types. Conventional direct-count assays of bacterial viability are based on metabolic characteristics or membrane integrity. However, methods relying on metabolic characteristics often only work for a limited subset of bacterial groups,(1) and methods for assessing bacterial membrane integrity commonly have high levels of background fluorescence.(2) Both types of determinations suffer from being very sensitive to growth and staining conditions.(3,4)
The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability assay utilizes mixtures of SYTO® 9 green fluorescent nucleic acid stain and the red fluorescent nucleic acid stain, propidium iodide. These stains differ both in their spectral characteristics and in their ability to penetrate healthy bacterial cells. When used alone, the SYTO 9 stain labels bacteria with both intact and damaged membranes. In contrast, propidium iodide penetrates only bacteria with damaged membranes, competing with the SYTO 9 stain for nucleic acid binding sites when both dyes are present. When mixed in recommended proportions, SYTO 9 stain and propidium iodide produce green fluorescent staining of bacteria with intact cell membranes and red fluorescent staining of bacteria with damaged membranes. The background remains virtually nonfluorescent. Consequently, the ratio of green to red fluorescence intensities provides a quantitative index of bacterial viability (Figure 1).
2. Materials Required
Turner BioSystems TD-700 Laboratory Fluorometer with standard PMT (P/N 7000-009)
Quartz-halogen lamp (P/N 7000-930)
13 mm round test tube adapter (P/N 7000-981)
Two pairs of filters are required: First pair includes: EX 486 nm filter (P/N 034-0486), EM 520 nm filter (P/N 034-0520). Second pair includes: EX 520 nm filter (P/N 034-0520), EM 325-700 nm (P/N 10-058R) and greater than 610 nm filter (P/N 10-054R).
Filter o-rings (P/N 7000-949)
13 mm x 100 mm borosilicate glass test tubes (P/N 10-031)
LIVE/DEAD® BacLight(TM) Bacterial Viability Kit (catalog number L-7012), supplied by Molecular Probes, Inc., Eugene, OR. This kit consists of three components: Component A, 300 µL of 3.34 mM SYTO 9 in anhydrous DMSO, Component B, 300 µL of 20 mM propidium iodide in anhydrous DMSO, and Component C, 10 mL of BacLight mounting oil (this component is not used in the fluorometric assay described here). One kit is sufficient for analysis of about 65 samples using this protocol. Handling, storage and the use of the reagents should be performed in accordance with the product information sheet supplied by Molecular Probes.
Staphylococcus aureus suspension containing approximately 1 × 10-7 bacteria/mL. To adjust the concentration of the bacterial suspension, take a 3 mL sample in a 10 mm × 10 mm cuvette and measure the optical density at 670 nm (OD670) using a spectrophotometer. 1 × 10-7 bacteria/mL corresponds to OD670 ~0.15. Microcentrifuge (SUREspin(TM) Model 7040, Helena Labs, Beaumont, TX).
Isopropyl alcohol.
Table 1
Table 1. Preparation of isopropyl alcohol/water mixtures
3. Experimental Protocol
3.1. Disinfectant Treatment of Staphylococcus aureus with Isopropyl Alcohol
3.1.1 In a set of 5 labeled tubes, prepare 0, 10, 30, 70 and 100% isopropyl alcohol/water mixtures as outlined in Table 1.
3.1.2 Label a set of 5 microfuge tubes with the designation 0, 10, 30, 70, or 100%.
3.1.3 Transfer 1 mL of Staphylococcus aureus suspension to each of the labeled microfuge tubes[A].
3.1.4 Centrifuge the microfuge tubes for 3 minutes at 10,000 rpm.
3.1.5 Remove and discard the supernatant from each microfuge tube using a glass Pasteur pipet.
3.1.6 Break up the bacterial pellets and resuspend each in 1 mL of 0, 10, 30, 70 or 100% isopropyl alcohol/water (step 3.1.1) according to the designation on the tube. For example, resuspend the pellet in the microfuge tube marked 10% in 1 mL of 10% isopropyl alcohol.
3.1.7 Incubate the bacterial suspensions in alcohol/water mixtures for 1 hour at room temperature.
3.1.8 Centrifuge the bacterial suspensions for 3 minutes at 10,000 rpm.
3.1.9 Break up bacterial pellets and resuspend each in 1 mL of sterile filtered water.
3.1.10 Centrifuge bacterial suspensions for 3 minutes at 10,000 rpm.
3.1.11 Break up bacterial pellets and resuspend each in 1.5 mL of sterile filtered water.[A]
[A] Although the experiment described here is based on a comparison of samples containing equal numbers of bacteria, it is also possible to compare viability of bacterial samples with different densities because the ratio of green to red fluorescence is relatively independent of the number of bacteria present.
3.2 Bacterial Staining
3.2.1 Prepare a 2X BacLight staining solution from the kit reagents by mixing 3 uL of component A and 3 uL of component B per 1 mL of sterile water. To prepare sufficient staining solution for the five samples and one reagent blank used in the experiment described here, add 27 uL of BacLight component A and 27 uL of BacLight component B to 9 mL of sterile water.
3.2.2 Label six 13 mm glass test tubes with reagent blank, 0, 10, 30, 70, and 100%.
3.2.3 Transfer 1.5 mL of 2X BacLight (prepared in 3.2.1) to each labeled test tube.
3.2.4 Transfer 1.5 mL of sterile water to the reagent blank tube, making up a total of 3 mL in this test tube.
3.2.5 Transfer 1.5 mL of the isopropyl alcohol-exposed Staphylococcus aureus from the microfuge tubes to the correspondingly labeled glass test tubes, making up a total of 3 mL in each test tube.
3.3 Fluorescence Measurements (Green Fluorescence)
3.3.1 Install the 486 nm filter in A-EX and 520 nm filter in A-EM.
3.3.2 Rotate the TD-700 filter cylinder to place the 485 nm excitation and 530 nm emission filters in the optical path.
3.3.3 You will be performing a simple mode calibration (refer to your manual if need be). Press "enter" from the keypad. Select [1] on the keypad to enter "setup" then select [1] to enter "mode".
3.3.4 Using the arrow key to choose the mode, select "simple, then [ESC] twice to return to the setup/calibration screen. Select [2], then press [ENTER].
3.3.5 The TD-700 will prompt you to insert a typical sample. Insert the sample containing the largest number of live bacteria; this sample should have the highest intensity of green fluorescence among those to be measured. In the experiment described here, this will be the sample containing 0% isopropyl alcohol.
3.3.6 Press [ENTER]. The instrument detection sensitivity will be automatically optimized to match the fluorescence of the sample. When the screen indicates that the sample is 500, press [ENTER]. Your TD-700 is now calibrated.
3.3.7 Press [ENTER] again and read the remaining samples in the order of reagent blank followed by the bacterial samples in order of increasing isopropyl alcohol concentration.
3.3.8 For each sample, record the fluorescence intensity value shown on the fluorometer display screen. To equalize any photobleaching effects, insert samples into the fluorometer for approximately equal time periods. Correct data for the dye background by subtracting the reagent blank fluorescence value from each bacterial sample fluorescence reading.
3.4 Fluorescence Measurements (Red Fluorescence)
3.4.1 Rotate the TD-700 filter cylinder to place the 520 nm excitation and 325-700 nm and greater than 610 nm emission filters in the optical path ("B" on the left hand side lined up with silver dot).
3.4.2 Press [ENTER] on the TD-700 key pad.
3.4.3 Select [2] CALIBRATION from the displayed options.
3.4.4 Insert the sample containing the largest number of dead bacteria; this sample should have the highest intensity of red fluorescence among those to be measured. In the experiment described here, this will be the sample containing 100% isopropyl alcohol.
3.4.5 Press ENTER. The instrument detection sensitivity will be automatically optimized to match the fluorescence of the sample.
3.4.6 Press ENTER again and read the remaining samples in the order of reagent blank followed by the bacterial samples in order of increasing isopropyl alcohol concentration.
3.4.7 For each sample, record the fluorescence intensity value shown on the fluorometer display screen. To equalize any photobleaching effects, insert samples into the fluorometer for approximately equal time periods. Correct data for the dye background by subtracting the reagent blank fluorescence value from each bacterial sample fluorescence reading.
3.5 Data Analysis and Interpretation
3.5.1 For each sample, divide the background-corrected green fluorescence intensity by the background-corrected red fluorescence intensity.
3.5.2 Plot the calculated green/red fluorescence intensity ratio (Y-axis) as a function of isopropyl alcohol concentration (X-axis).
3.5.3 Plotted data should show decreasing green/red fluorescence intensity ratios as the number of dead bacteria increases (i.e. as the isopropyl alcohol concentration increases; Figure 1).
Figure 1
Figure 1. Analysis of Staphylococcus aureus viability following one hour exposure to varying concentrations of isopropyl alcohol. The TD-700 Laboratory Fluorometer was used to separately quantitate the green and red fluorescence emission produced by staining with SYTO 9 and propidium iodide respectively. The ratio of green/red fluorescence intensity was calculated for each sample and plotted against isopropyl alcohol concentration.
4. References
J Appl Bacteriol 72, 410 (1992)
Lett Appl Microbiol 13, 58 (1991)
Curr Microbiol 4, 321 (1980)
J Microbiol Meth 13, 87 (1991)
5. Patent and Trademark Information
LIVE/DEAD and SYTO are registered trademarks of Molecular Probes, Inc. BacLight is a trademark of Molec
The Turner BioSystems TD-700 Laboratory Fluorometer in combination with Molecular Probes' LIVE/DEAD® BacLightTM Bacterial Viability Kit provides a novel two-color fluorescence assay of bacterial viability that allows researchers to quantitatively distinguish live and dead bacteria in minutes, even in a mixed population containing a range of bacterial types. Conventional direct-count assays of bacterial viability are based on metabolic characteristics or membrane integrity. However, methods relying on metabolic characteristics often only work for a limited subset of bacterial groups,(1) and methods for assessing bacterial membrane integrity commonly have high levels of background fluorescence.(2) Both types of determinations suffer from being very sensitive to growth and staining conditions.(3,4)
The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability assay utilizes mixtures of SYTO® 9 green fluorescent nucleic acid stain and the red fluorescent nucleic acid stain, propidium iodide. These stains differ both in their spectral characteristics and in their ability to penetrate healthy bacterial cells. When used alone, the SYTO 9 stain labels bacteria with both intact and damaged membranes. In contrast, propidium iodide penetrates only bacteria with damaged membranes, competing with the SYTO 9 stain for nucleic acid binding sites when both dyes are present. When mixed in recommended proportions, SYTO 9 stain and propidium iodide produce green fluorescent staining of bacteria with intact cell membranes and red fluorescent staining of bacteria with damaged membranes. The background remains virtually nonfluorescent. Consequently, the ratio of green to red fluorescence intensities provides a quantitative index of bacterial viability (Figure 1).
2. Materials Required
Turner BioSystems TD-700 Laboratory Fluorometer with standard PMT (P/N 7000-009)
Quartz-halogen lamp (P/N 7000-930)
13 mm round test tube adapter (P/N 7000-981)
Two pairs of filters are required: First pair includes: EX 486 nm filter (P/N 034-0486), EM 520 nm filter (P/N 034-0520). Second pair includes: EX 520 nm filter (P/N 034-0520), EM 325-700 nm (P/N 10-058R) and greater than 610 nm filter (P/N 10-054R).
Filter o-rings (P/N 7000-949)
13 mm x 100 mm borosilicate glass test tubes (P/N 10-031)
LIVE/DEAD® BacLight(TM) Bacterial Viability Kit (catalog number L-7012), supplied by Molecular Probes, Inc., Eugene, OR. This kit consists of three components: Component A, 300 µL of 3.34 mM SYTO 9 in anhydrous DMSO, Component B, 300 µL of 20 mM propidium iodide in anhydrous DMSO, and Component C, 10 mL of BacLight mounting oil (this component is not used in the fluorometric assay described here). One kit is sufficient for analysis of about 65 samples using this protocol. Handling, storage and the use of the reagents should be performed in accordance with the product information sheet supplied by Molecular Probes.
Staphylococcus aureus suspension containing approximately 1 × 10-7 bacteria/mL. To adjust the concentration of the bacterial suspension, take a 3 mL sample in a 10 mm × 10 mm cuvette and measure the optical density at 670 nm (OD670) using a spectrophotometer. 1 × 10-7 bacteria/mL corresponds to OD670 ~0.15. Microcentrifuge (SUREspin(TM) Model 7040, Helena Labs, Beaumont, TX).
Isopropyl alcohol.
Table 1
Table 1. Preparation of isopropyl alcohol/water mixtures
3. Experimental Protocol
3.1. Disinfectant Treatment of Staphylococcus aureus with Isopropyl Alcohol
3.1.1 In a set of 5 labeled tubes, prepare 0, 10, 30, 70 and 100% isopropyl alcohol/water mixtures as outlined in Table 1.
3.1.2 Label a set of 5 microfuge tubes with the designation 0, 10, 30, 70, or 100%.
3.1.3 Transfer 1 mL of Staphylococcus aureus suspension to each of the labeled microfuge tubes[A].
3.1.4 Centrifuge the microfuge tubes for 3 minutes at 10,000 rpm.
3.1.5 Remove and discard the supernatant from each microfuge tube using a glass Pasteur pipet.
3.1.6 Break up the bacterial pellets and resuspend each in 1 mL of 0, 10, 30, 70 or 100% isopropyl alcohol/water (step 3.1.1) according to the designation on the tube. For example, resuspend the pellet in the microfuge tube marked 10% in 1 mL of 10% isopropyl alcohol.
3.1.7 Incubate the bacterial suspensions in alcohol/water mixtures for 1 hour at room temperature.
3.1.8 Centrifuge the bacterial suspensions for 3 minutes at 10,000 rpm.
3.1.9 Break up bacterial pellets and resuspend each in 1 mL of sterile filtered water.
3.1.10 Centrifuge bacterial suspensions for 3 minutes at 10,000 rpm.
3.1.11 Break up bacterial pellets and resuspend each in 1.5 mL of sterile filtered water.[A]
[A] Although the experiment described here is based on a comparison of samples containing equal numbers of bacteria, it is also possible to compare viability of bacterial samples with different densities because the ratio of green to red fluorescence is relatively independent of the number of bacteria present.
3.2 Bacterial Staining
3.2.1 Prepare a 2X BacLight staining solution from the kit reagents by mixing 3 uL of component A and 3 uL of component B per 1 mL of sterile water. To prepare sufficient staining solution for the five samples and one reagent blank used in the experiment described here, add 27 uL of BacLight component A and 27 uL of BacLight component B to 9 mL of sterile water.
3.2.2 Label six 13 mm glass test tubes with reagent blank, 0, 10, 30, 70, and 100%.
3.2.3 Transfer 1.5 mL of 2X BacLight (prepared in 3.2.1) to each labeled test tube.
3.2.4 Transfer 1.5 mL of sterile water to the reagent blank tube, making up a total of 3 mL in this test tube.
3.2.5 Transfer 1.5 mL of the isopropyl alcohol-exposed Staphylococcus aureus from the microfuge tubes to the correspondingly labeled glass test tubes, making up a total of 3 mL in each test tube.
3.3 Fluorescence Measurements (Green Fluorescence)
3.3.1 Install the 486 nm filter in A-EX and 520 nm filter in A-EM.
3.3.2 Rotate the TD-700 filter cylinder to place the 485 nm excitation and 530 nm emission filters in the optical path.
3.3.3 You will be performing a simple mode calibration (refer to your manual if need be). Press "enter" from the keypad. Select [1] on the keypad to enter "setup" then select [1] to enter "mode".
3.3.4 Using the arrow key to choose the mode, select "simple, then [ESC] twice to return to the setup/calibration screen. Select [2], then press [ENTER].
3.3.5 The TD-700 will prompt you to insert a typical sample. Insert the sample containing the largest number of live bacteria; this sample should have the highest intensity of green fluorescence among those to be measured. In the experiment described here, this will be the sample containing 0% isopropyl alcohol.
3.3.6 Press [ENTER]. The instrument detection sensitivity will be automatically optimized to match the fluorescence of the sample. When the screen indicates that the sample is 500, press [ENTER]. Your TD-700 is now calibrated.
3.3.7 Press [ENTER] again and read the remaining samples in the order of reagent blank followed by the bacterial samples in order of increasing isopropyl alcohol concentration.
3.3.8 For each sample, record the fluorescence intensity value shown on the fluorometer display screen. To equalize any photobleaching effects, insert samples into the fluorometer for approximately equal time periods. Correct data for the dye background by subtracting the reagent blank fluorescence value from each bacterial sample fluorescence reading.
3.4 Fluorescence Measurements (Red Fluorescence)
3.4.1 Rotate the TD-700 filter cylinder to place the 520 nm excitation and 325-700 nm and greater than 610 nm emission filters in the optical path ("B" on the left hand side lined up with silver dot).
3.4.2 Press [ENTER] on the TD-700 key pad.
3.4.3 Select [2] CALIBRATION from the displayed options.
3.4.4 Insert the sample containing the largest number of dead bacteria; this sample should have the highest intensity of red fluorescence among those to be measured. In the experiment described here, this will be the sample containing 100% isopropyl alcohol.
3.4.5 Press ENTER. The instrument detection sensitivity will be automatically optimized to match the fluorescence of the sample.
3.4.6 Press ENTER again and read the remaining samples in the order of reagent blank followed by the bacterial samples in order of increasing isopropyl alcohol concentration.
3.4.7 For each sample, record the fluorescence intensity value shown on the fluorometer display screen. To equalize any photobleaching effects, insert samples into the fluorometer for approximately equal time periods. Correct data for the dye background by subtracting the reagent blank fluorescence value from each bacterial sample fluorescence reading.
3.5 Data Analysis and Interpretation
3.5.1 For each sample, divide the background-corrected green fluorescence intensity by the background-corrected red fluorescence intensity.
3.5.2 Plot the calculated green/red fluorescence intensity ratio (Y-axis) as a function of isopropyl alcohol concentration (X-axis).
3.5.3 Plotted data should show decreasing green/red fluorescence intensity ratios as the number of dead bacteria increases (i.e. as the isopropyl alcohol concentration increases; Figure 1).
Figure 1
Figure 1. Analysis of Staphylococcus aureus viability following one hour exposure to varying concentrations of isopropyl alcohol. The TD-700 Laboratory Fluorometer was used to separately quantitate the green and red fluorescence emission produced by staining with SYTO 9 and propidium iodide respectively. The ratio of green/red fluorescence intensity was calculated for each sample and plotted against isopropyl alcohol concentration.
4. References
J Appl Bacteriol 72, 410 (1992)
Lett Appl Microbiol 13, 58 (1991)
Curr Microbiol 4, 321 (1980)
J Microbiol Meth 13, 87 (1991)
5. Patent and Trademark Information
LIVE/DEAD and SYTO are registered trademarks of Molecular Probes, Inc. BacLight is a trademark of Molec
การแปล กรุณารอสักครู่..
1 Install the 486 nm filter in A-EX and 520 nm filter in A-EM.
3.3.2 Rotate the TD-700 filter cylinder to place the 485 nm. Excitation and 530 nm emission filters in the optical path.
3.3.3 You will be performing a simple mode calibration (refer. To your manual if need be). "" Press enter from the keypad. Select [] on 1 the keypad to enter "setup" then select [], 1 to Enter mode.
3.3. ""1 . แนะนำ
td-700 เทอร์เนอร์ซึ่งปฏิบัติการฟลู โรมิเตอร์ร่วมกับโมเลกุลโพรบ ' สด / ตาย® baclighttm แบคทีเรีย 1 ชุดให้นวนิยายสองสีเรืองแสง การทดสอบความมีชีวิตของแบคทีเรียที่ช่วยให้นักวิจัยเพื่อใช้แยกแยะมีชีวิตและตายแบคทีเรียในนาทีแม้ในผสมประชากรที่มีช่วงของชนิดของเชื้อแบคทีเรียปกตินับโดยตรงหรือขึ้นอยู่กับลักษณะของแบคทีเรียสามารถสลายหรือเมมเบรน ความซื่อสัตย์ อย่างไรก็ตาม วิธีการอาศัยลักษณะการเผาผลาญมักจะทำงานย่อยจำกัดของกลุ่มแบคทีเรีย ( 1 ) และวิธีการประเมินความสมบูรณ์ของแผ่นมักมีระดับสูงของการเรืองแสงพื้นหลัง( 2 ) มีทั้งชนิดใช้ประสบการมากไวต่อการเจริญเติบโตและการเงื่อนไข ( 3 , 4 )
อยู่ / ตาย baclight ความมีชีวิต assay แบคทีเรียใช้ผสม syto ® 9 เรืองแสงสีเขียวคราบแดงเรืองแสงและกรดนิวคลีอิกกรดนิวคลีอิกคราบ propidium ไอโอไดด์ .คราบเหล่านี้แตกต่างกันทั้งในลักษณะของสเปกตรัมและความสามารถของพวกเขาที่จะเจาะเซลล์แบคทีเรียที่มีสุขภาพดี เมื่อใช้คนเดียว syto 9 คราบแบคทีเรีย มีทั้งป้ายเหมือนเดิม และความเสียหายเยื่อ ในทางตรงกันข้าม propidium ไอโอไดด์แทรกซึมเฉพาะแบคทีเรียกับเสียหาย membranes ประชันกับ syto 9 คราบสำหรับกรดนิวคลีอิกปกเว็บไซต์เมื่อทั้งสองสีอยู่เมื่อผสมในสัดส่วนที่แนะนำ syto 9 คราบ และ propidium ไอโอไดด์ผลิตเรืองแสงสีเขียวคราบแบคทีเรียกับเยื่อหุ้มเซลล์เหมือนเดิมและสีแดงเรืองแสงคราบแบคทีเรียที่ทำลายเยื่อ พื้นหลังยังคงแทบ nonfluorescent . ดังนั้น อัตราส่วนของการเรืองแสงสีเขียวเข้ม สีแดง มีดัชนีเชิงปริมาณของแบคทีเรีย 3 ( รูปที่ 1 ) .
2วัสดุที่ต้องใช้
td-700 เทอร์เนอร์ซึ่งปฏิบัติการฟลู โรมิเตอร์ด้วยมาตรฐาน PMT ( P / N 7000-009 )
โคมไฟฮาโลเจนควอทซ์ ( P / N 7000-930 )
13 มม. รอบหลอดทดสอบ Adapter ( P / N 7000-981 )
2 คู่ของตัวกรองจะถูกบังคับใช้ : คู่แรก รวมถึงอดีตแล้วกรอง nm ( P / N 034-0486 ) เอ็ม 520 nm กรอง ( P / N 034-0520 ) คู่ที่2 : EX 520 nm กรอง ( P / N 034-0520 )300 µ L 20 มม. propidium ไอโอไดด์ในรัส DMSO และส่วนประกอบ ซี 10 มล. baclight ยึดน้ำมัน ( ส่วนนี้ไม่ได้ถูกใช้ในการทดสอบ fluorometric อธิบายที่นี่ ) หนึ่งชุดมีเพียงพอสำหรับการวิเคราะห์ของเกี่ยวกับ 65 ตัวอย่างการใช้โพรโทคอลนี้ การจัดการ , การจัดเก็บและการใช้งานของสารเคมีควรดำเนินการตามข้อมูลผลิตภัณฑ์แผ่นมาจากโมเลกุลโพรบ .
มัน 325-700 nm ( P / N 10-058r ) และมากกว่า 610 nm กรอง ( P / N 10-054r )
- กรอง ( P / N 7000-949 )
13 มม. x 100 มม. borosilicate แก้วหลอดทดลอง ( P / N 10-031 )
/ มีชีวิตอยู่ตาย® baclight ( TM ) แบคทีเรีย ( หมายเลขบัญชีรายชื่อ l-7012 ) 1 ชุด ที่จัดโดยโมเลกุลโพรบ , อิงค์ , ยูจีน , หรือ . ชุดนี้ประกอบด้วยสามส่วน : ส่วน , 300 µ l 3.34 มม. syto 9 ในรัส DMSO ส่วน BStaphylococcus aureus ช่วงล่างที่มีประมาณ 1 × 10-7 แบคทีเรีย / ml เพื่อปรับความเข้มข้นของสารแขวนลอย แบคทีเรีย ใช้ 3 ml จำนวน 10 มิลลิเมตร×พิทยาพล 10 มม. และวัดความหนาแน่นของแสงที่ 670 นาโนเมตร ( od670 ) โดยใช้วัสดุ 1 × 10-7 แบคทีเรีย / ml ที่สอดคล้องกับ od670 ~ 0.15 ตามลำดับ ไมโครเซนตริฟิวจ์ ( surespin ( TM ) รุ่น 7040 เฮเลน่า Labs , Beaumont , TX )
ไอโซโพรพิลแอลกอฮอล์ตารางที่ 1
โต๊ะ 1 การเตรียม isopropyl แอลกอฮอล์ผสมน้ำ /
3 ทดลองโปร
1 . การฆ่าเชื้อของ Staphylococcus aureus ด้วยไอโซโพรพิลแอลกอฮอล์
3.1.1 ในชุด 5 ป้ายท่อเตรียม 0 , 10 , 30 , 70 และ 100 % isopropyl แอลกอฮอล์ผสมน้ำตามที่ระบุไว้ในตารางที่ 1
ดาวน์โหลดฉลากชุด 5 microfuge หลอดกับชื่อ 0 , 10 , 30 , 70 หรือ 100 %
1 .1 ) ตามชื่อในหลอด ตัวอย่างเช่น resuspend เม็ดใน microfuge หลอดเครื่องหมาย 10% ใน 1 ml 10% ไอโซโพรพิลแอลกอฮอล์
3.1.7 ฟักไข่สารแขวนลอยที่มีส่วนผสมแอลกอฮอล์ / น้ำ 1 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิห้อง
3.1.8 แก่นแก้วของช่วงล่าง 3 นาทีที่ 10 , 000 รอบต่อนาที
1 .3 โอน 1 มิลลิลิตรของ Staphylococcus aureus และระงับของแต่ละป้าย microfuge หลอด [ ] .
3.1.4 centrifuge ที่ microfuge หลอดสำหรับ 3 นาทีที่ 10 , 000 รอบต่อนาที
3.1.5 ลบและทิ้งนำจากแต่ละ microfuge ใช้ปิเปตปาสเตอร์หลอดแก้ว
3.1.6 ทำลายเชื้อแบคทีเรียและ resuspend ครั้งละ 1 เม็ด 4 0 , 10 , 30 , 70 หรือ 100 % isopropyl แอลกอฮอล์ / น้ำ ( ขั้นตอน 3.1 .9 ทำลายแบคทีเรีย และ resuspend แต่ละเม็ดใน 1 มิลลิลิตร กรองน้ำ ผ่าน
3.1.10 centrifuge แบคทีเรียช่วงล่าง 3 นาทีที่ 10 , 000 รอบต่อนาที
3.1.11 ทำลายแบคทีเรียและในแต่ละเม็ด resuspend 1.5 มิลลิลิตร กรองน้ำ ผ่าน [ ]
[ ] ถึงแม้ว่าการทดลองที่อธิบายไว้ที่นี่จะขึ้นอยู่กับ การเปรียบเทียบกลุ่มตัวอย่างที่มีเท่ากับตัวเลขของแบคทีเรียนอกจากนี้ยังเป็นไปได้ที่จะเปรียบเทียบชีวิตของตัวอย่างแบคทีเรียที่มีความหนาแน่นแตกต่างกัน เพราะอัตราส่วนของสีเขียวเรืองแสงสีแดงเป็นอิสระค่อนข้างจำนวนของแบคทีเรียอยู่
3.2 แบคทีเรียคราบ
ดำเนินงานเตรียม 2x baclight staining โซลูชั่นจากชุด reagents โดยผสม 3 UL ของชิ้นส่วนและส่วนประกอบ B 1 3 UL มิลลิลิตรของน้ำหมันเพื่อเตรียมการแก้ไขห้าตัวอย่างเพียงพอและสารเคมีเปล่าใช้ในการทดลองที่อธิบายที่นี่ , เพิ่ม 27 UL ของ baclight ส่วนประกอบและ 27 UL ของ baclight องค์ประกอบ B 9 มิลลิลิตรของน้ำหมัน
6 13 มม. 3.2.2 ป้ายแก้วหลอดทดลองกับสารเคมีว่าง , 0 , 10 , 30 , 70 , และ 100%
3.2.3 โอน 1.5 มิลลิลิตร baclight 2x ( ที่เตรียมไว้ในดำเนินงาน ) แต่ละป้ายหลอด
2 .4 โอน 1.5 มิลลิลิตรของน้ำหมันกับสารเคมีเปล่าหลอด ทำทั้งหมด 3 มล. ในหลอดทดลองนี้
งานการโอน 1.5 ml ของ isopropyl แอลกอฮอล์สัมผัสเชื้อ Staphylococcus aureus จาก microfuge หลอดเพื่อต้องกันว่า แก้ว หลอดทดลองสร้างขึ้นทั้งหมด 3 มล. ในแต่ละหลอด
3.3 การวัดฟลูออเรสเซนซ์ ( fluorescence ) สีเขียว
3 .1 ติดตั้ง 486 nm กรองและตัวกรองใน a-ex 520 nm ใน a-em.
3.3.2 หมุน td-700 กรองกระบอกที่ 485 nm ไทเทเนียมกรอง 530 nm มลพิษทางแสง
3.3.3 ท่านจะแสดงการปรับโหมดง่าย ( ดูคู่มือของคุณถ้าจำเป็น ) กด " Enter " จากปุ่มกด เลือก [ 1 ] บนแป้นพิมพ์เพื่อป้อนการตั้งค่า " " จากนั้นเลือก [ 1 ] เพื่อเข้าสู่ " โหมด "
3.3 .4 ใช้ปุ่มลูกศรเพื่อเลือกโหมดให้เลือก " ง่ายแล้ว [ ESC ] สองครั้งเพื่อกลับสู่หน้าจอการติดตั้ง / สอบเทียบ เลือก [ 2 ] แล้วกด [ Enter ]
3.3.5 การ td-700 จะพร้อมท์ให้คุณแทรกตัวอย่างทั่วไป แทรกตัวอย่างที่มีหมายเลขที่ใหญ่ที่สุดของแบคทีเรียที่มีชีวิต ; ตัวอย่างนี้ควรมีความเข้มของการเรืองแสงสีเขียวสูงที่สุดในหมู่ผู้ถูกวัดในการทดลองที่อธิบายไว้ที่นี่ นี่เป็นตัวอย่างที่มี 0% isopropyl แอลกอฮอล์ .
3.3.6 กด [ Enter ] อุปกรณ์ตรวจจับความไวจะได้โดยอัตโนมัติ ปรับให้ตรงกับการเรืองแสงของตัวอย่าง เมื่อหน้าจอแสดงให้เห็นว่าตัวอย่าง 500 , กด [ Enter ] td-700 ของคุณคือตอนนี้ สอบเทียบ
3.3 .7 กด [ Enter ] อีกครั้ง และอ่านตัวอย่างที่เหลืออยู่ในลำดับของรีเอเจนต์ว่างตามด้วยตัวอย่างแบคทีเรียเพื่อเพิ่มความเข้มข้นของแอลกอฮอล์ isopropyl .
3.3.8 สำหรับแต่ละตัวอย่าง บันทึกการเรืองแสงฟลู โรมิเตอร์ค่าความหนาแน่นที่แสดงบนหน้าจอแสดง เกลี่ยๆ photobleaching ผลแทรกตัวอย่างในฟลู โรมิเตอร์สำหรับช่วงเวลาประมาณเท่ากับข้อมูลที่ถูกต้อง สำหรับสีพื้นหลังโดยการลบสารเคมีว่างค่าจากแต่ละตัวอย่างแบคทีเรียเรืองแสงเรืองแสงอ่าน
3.4 เรืองการวัด ( เรืองแสงสีแดง )
3.4.1 หมุน td-700 กรองกระบอกที่ 520 nm ไทเทเนียม 325-700 nm และใหญ่กว่า 610 nm สารมลพิษตัวกรองในเส้นทางของแสง ( " B " ด้าน มือซ้ายมีจุดสีเงิน ) .
3.4 .2 กด [ Enter ] บน td-700 คีย์แพด .
3.4.3 เลือก [ 2 ] การสอบเทียบจากแสดงตัวเลือก .
3.4.4 แทรกตัวอย่างที่มีจำนวนมากที่สุดที่ตายแล้วแบคทีเรีย ; ตัวอย่างนี้ควรมีความเข้มของการเรืองแสงสีแดงสูงสุดในหมู่ผู้ถูกวัด ในการทดลองที่อธิบายไว้ที่นี่ นี่เป็นตัวอย่างที่มี 100% isopropyl แอลกอฮอล์ .
3.4.5 กด Enterอุปกรณ์ตรวจจับความไวจะได้โดยอัตโนมัติ ปรับให้ตรงกับการเรืองแสงของตัวอย่าง .
3.4.6 กด Enter อีกครั้ง และอ่านตัวอย่างที่เหลืออยู่ในลำดับของรีเอเจนต์ว่างตามด้วยตัวอย่างแบคทีเรียเพื่อเพิ่มความเข้มข้นของแอลกอฮอล์ isopropyl .
3.4.7 สำหรับแต่ละตัวอย่าง บันทึกการเรืองแสงฟลู โรมิเตอร์ค่าความหนาแน่นที่แสดงบนหน้าจอแสดงเกลี่ยๆ photobleaching ผลแทรกตัวอย่างในฟลู โรมิเตอร์สำหรับช่วงเวลาประมาณเท่ากับ ข้อมูลที่ถูกต้อง สำหรับสีพื้นหลังโดยการลบสารเคมีว่างค่าจากแต่ละตัวอย่างแบคทีเรียเรืองแสงเรืองแสงอ่าน
3.5 ข้อมูลการวิเคราะห์และการตีความ
ที่สำคัญสำหรับแต่ละตัวอย่างแบ่งพื้นหลังเรืองแสงสีเขียวเข้มแก้ไขโดยพื้นหลังติดตามเข้มเรืองแสงสีแดง
3.5.2 พล็อตค่าสีเขียว / แดงเรือง อัตราส่วนความเข้มของแสง ( แกน Y ) เป็นฟังก์ชันของไอโซโพรพิลแอลกอฮอล์ความเข้มข้น ( แกน X )
3.5.3 วางแผนข้อมูลที่ควรจะแสดงการเรืองแสงสีเขียว / แดงเข้ม อัตราส่วนของจำนวนแบคทีเรียตายเพิ่มขึ้น ( เช่นเป็น isopropyl แอลกอฮอล์ความเข้มข้นเพิ่มขึ้น ; รูปที่ 1 ) .
รูปที่ 1
1 รูป การวิเคราะห์เชื้อ Staphylococcus aureus และต่อไปนี้การหนึ่งชั่วโมงที่ความเข้มข้นแตกต่างกันของไอโซโพรพิลแอลกอฮอล์ การ td-700 ห้องปฏิบัติการฟลู โรมิเตอร์ถูกใช้เพื่อแยก กับสีเขียว และการเรืองแสงสีแดงที่ย้อมด้วย syto 9 และ propidium ไอโอไดด์ ตามลำดับอัตราส่วนของการเรืองแสงสีเขียว / แดงเข้มถูกคำนวณสำหรับแต่ละตัวอย่างและงัดข้อกับไอโซโพรพิลแอลกอฮอล์ความเข้มข้น .
4 . อ้างอิง
J App bacteriol 72 , 410 ( 1992 )
จดหมายแอปเปิ้ล ธนิดา เหรียญทอง B Sc 13 , 58 ( 1991 )
curr ธนิดา เหรียญทอง B Sc 4 , 321 ( 1980 )
J ธนิดา เหรียญทอง B Sc ยาบ้า 13 , 87 ( 1991 )
5 สิทธิบัตรและเครื่องหมายการค้าข้อมูล
ชีวิต / ตายและ syto เป็นเครื่องหมายการค้าจดทะเบียนของโมเลกุลโพรบ , Incbaclight เป็นเครื่องหมายการค้าของ molec
3.3.2 Rotate the TD-700 filter cylinder to place the 485 nm. Excitation and 530 nm emission filters in the optical path.
3.3.3 You will be performing a simple mode calibration (refer. To your manual if need be). "" Press enter from the keypad. Select [] on 1 the keypad to enter "setup" then select [], 1 to Enter mode.
3.3. ""1 . แนะนำ
td-700 เทอร์เนอร์ซึ่งปฏิบัติการฟลู โรมิเตอร์ร่วมกับโมเลกุลโพรบ ' สด / ตาย® baclighttm แบคทีเรีย 1 ชุดให้นวนิยายสองสีเรืองแสง การทดสอบความมีชีวิตของแบคทีเรียที่ช่วยให้นักวิจัยเพื่อใช้แยกแยะมีชีวิตและตายแบคทีเรียในนาทีแม้ในผสมประชากรที่มีช่วงของชนิดของเชื้อแบคทีเรียปกตินับโดยตรงหรือขึ้นอยู่กับลักษณะของแบคทีเรียสามารถสลายหรือเมมเบรน ความซื่อสัตย์ อย่างไรก็ตาม วิธีการอาศัยลักษณะการเผาผลาญมักจะทำงานย่อยจำกัดของกลุ่มแบคทีเรีย ( 1 ) และวิธีการประเมินความสมบูรณ์ของแผ่นมักมีระดับสูงของการเรืองแสงพื้นหลัง( 2 ) มีทั้งชนิดใช้ประสบการมากไวต่อการเจริญเติบโตและการเงื่อนไข ( 3 , 4 )
อยู่ / ตาย baclight ความมีชีวิต assay แบคทีเรียใช้ผสม syto ® 9 เรืองแสงสีเขียวคราบแดงเรืองแสงและกรดนิวคลีอิกกรดนิวคลีอิกคราบ propidium ไอโอไดด์ .คราบเหล่านี้แตกต่างกันทั้งในลักษณะของสเปกตรัมและความสามารถของพวกเขาที่จะเจาะเซลล์แบคทีเรียที่มีสุขภาพดี เมื่อใช้คนเดียว syto 9 คราบแบคทีเรีย มีทั้งป้ายเหมือนเดิม และความเสียหายเยื่อ ในทางตรงกันข้าม propidium ไอโอไดด์แทรกซึมเฉพาะแบคทีเรียกับเสียหาย membranes ประชันกับ syto 9 คราบสำหรับกรดนิวคลีอิกปกเว็บไซต์เมื่อทั้งสองสีอยู่เมื่อผสมในสัดส่วนที่แนะนำ syto 9 คราบ และ propidium ไอโอไดด์ผลิตเรืองแสงสีเขียวคราบแบคทีเรียกับเยื่อหุ้มเซลล์เหมือนเดิมและสีแดงเรืองแสงคราบแบคทีเรียที่ทำลายเยื่อ พื้นหลังยังคงแทบ nonfluorescent . ดังนั้น อัตราส่วนของการเรืองแสงสีเขียวเข้ม สีแดง มีดัชนีเชิงปริมาณของแบคทีเรีย 3 ( รูปที่ 1 ) .
2วัสดุที่ต้องใช้
td-700 เทอร์เนอร์ซึ่งปฏิบัติการฟลู โรมิเตอร์ด้วยมาตรฐาน PMT ( P / N 7000-009 )
โคมไฟฮาโลเจนควอทซ์ ( P / N 7000-930 )
13 มม. รอบหลอดทดสอบ Adapter ( P / N 7000-981 )
2 คู่ของตัวกรองจะถูกบังคับใช้ : คู่แรก รวมถึงอดีตแล้วกรอง nm ( P / N 034-0486 ) เอ็ม 520 nm กรอง ( P / N 034-0520 ) คู่ที่2 : EX 520 nm กรอง ( P / N 034-0520 )300 µ L 20 มม. propidium ไอโอไดด์ในรัส DMSO และส่วนประกอบ ซี 10 มล. baclight ยึดน้ำมัน ( ส่วนนี้ไม่ได้ถูกใช้ในการทดสอบ fluorometric อธิบายที่นี่ ) หนึ่งชุดมีเพียงพอสำหรับการวิเคราะห์ของเกี่ยวกับ 65 ตัวอย่างการใช้โพรโทคอลนี้ การจัดการ , การจัดเก็บและการใช้งานของสารเคมีควรดำเนินการตามข้อมูลผลิตภัณฑ์แผ่นมาจากโมเลกุลโพรบ .
มัน 325-700 nm ( P / N 10-058r ) และมากกว่า 610 nm กรอง ( P / N 10-054r )
- กรอง ( P / N 7000-949 )
13 มม. x 100 มม. borosilicate แก้วหลอดทดลอง ( P / N 10-031 )
/ มีชีวิตอยู่ตาย® baclight ( TM ) แบคทีเรีย ( หมายเลขบัญชีรายชื่อ l-7012 ) 1 ชุด ที่จัดโดยโมเลกุลโพรบ , อิงค์ , ยูจีน , หรือ . ชุดนี้ประกอบด้วยสามส่วน : ส่วน , 300 µ l 3.34 มม. syto 9 ในรัส DMSO ส่วน BStaphylococcus aureus ช่วงล่างที่มีประมาณ 1 × 10-7 แบคทีเรีย / ml เพื่อปรับความเข้มข้นของสารแขวนลอย แบคทีเรีย ใช้ 3 ml จำนวน 10 มิลลิเมตร×พิทยาพล 10 มม. และวัดความหนาแน่นของแสงที่ 670 นาโนเมตร ( od670 ) โดยใช้วัสดุ 1 × 10-7 แบคทีเรีย / ml ที่สอดคล้องกับ od670 ~ 0.15 ตามลำดับ ไมโครเซนตริฟิวจ์ ( surespin ( TM ) รุ่น 7040 เฮเลน่า Labs , Beaumont , TX )
ไอโซโพรพิลแอลกอฮอล์ตารางที่ 1
โต๊ะ 1 การเตรียม isopropyl แอลกอฮอล์ผสมน้ำ /
3 ทดลองโปร
1 . การฆ่าเชื้อของ Staphylococcus aureus ด้วยไอโซโพรพิลแอลกอฮอล์
3.1.1 ในชุด 5 ป้ายท่อเตรียม 0 , 10 , 30 , 70 และ 100 % isopropyl แอลกอฮอล์ผสมน้ำตามที่ระบุไว้ในตารางที่ 1
ดาวน์โหลดฉลากชุด 5 microfuge หลอดกับชื่อ 0 , 10 , 30 , 70 หรือ 100 %
1 .1 ) ตามชื่อในหลอด ตัวอย่างเช่น resuspend เม็ดใน microfuge หลอดเครื่องหมาย 10% ใน 1 ml 10% ไอโซโพรพิลแอลกอฮอล์
3.1.7 ฟักไข่สารแขวนลอยที่มีส่วนผสมแอลกอฮอล์ / น้ำ 1 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิห้อง
3.1.8 แก่นแก้วของช่วงล่าง 3 นาทีที่ 10 , 000 รอบต่อนาที
1 .3 โอน 1 มิลลิลิตรของ Staphylococcus aureus และระงับของแต่ละป้าย microfuge หลอด [ ] .
3.1.4 centrifuge ที่ microfuge หลอดสำหรับ 3 นาทีที่ 10 , 000 รอบต่อนาที
3.1.5 ลบและทิ้งนำจากแต่ละ microfuge ใช้ปิเปตปาสเตอร์หลอดแก้ว
3.1.6 ทำลายเชื้อแบคทีเรียและ resuspend ครั้งละ 1 เม็ด 4 0 , 10 , 30 , 70 หรือ 100 % isopropyl แอลกอฮอล์ / น้ำ ( ขั้นตอน 3.1 .9 ทำลายแบคทีเรีย และ resuspend แต่ละเม็ดใน 1 มิลลิลิตร กรองน้ำ ผ่าน
3.1.10 centrifuge แบคทีเรียช่วงล่าง 3 นาทีที่ 10 , 000 รอบต่อนาที
3.1.11 ทำลายแบคทีเรียและในแต่ละเม็ด resuspend 1.5 มิลลิลิตร กรองน้ำ ผ่าน [ ]
[ ] ถึงแม้ว่าการทดลองที่อธิบายไว้ที่นี่จะขึ้นอยู่กับ การเปรียบเทียบกลุ่มตัวอย่างที่มีเท่ากับตัวเลขของแบคทีเรียนอกจากนี้ยังเป็นไปได้ที่จะเปรียบเทียบชีวิตของตัวอย่างแบคทีเรียที่มีความหนาแน่นแตกต่างกัน เพราะอัตราส่วนของสีเขียวเรืองแสงสีแดงเป็นอิสระค่อนข้างจำนวนของแบคทีเรียอยู่
3.2 แบคทีเรียคราบ
ดำเนินงานเตรียม 2x baclight staining โซลูชั่นจากชุด reagents โดยผสม 3 UL ของชิ้นส่วนและส่วนประกอบ B 1 3 UL มิลลิลิตรของน้ำหมันเพื่อเตรียมการแก้ไขห้าตัวอย่างเพียงพอและสารเคมีเปล่าใช้ในการทดลองที่อธิบายที่นี่ , เพิ่ม 27 UL ของ baclight ส่วนประกอบและ 27 UL ของ baclight องค์ประกอบ B 9 มิลลิลิตรของน้ำหมัน
6 13 มม. 3.2.2 ป้ายแก้วหลอดทดลองกับสารเคมีว่าง , 0 , 10 , 30 , 70 , และ 100%
3.2.3 โอน 1.5 มิลลิลิตร baclight 2x ( ที่เตรียมไว้ในดำเนินงาน ) แต่ละป้ายหลอด
2 .4 โอน 1.5 มิลลิลิตรของน้ำหมันกับสารเคมีเปล่าหลอด ทำทั้งหมด 3 มล. ในหลอดทดลองนี้
งานการโอน 1.5 ml ของ isopropyl แอลกอฮอล์สัมผัสเชื้อ Staphylococcus aureus จาก microfuge หลอดเพื่อต้องกันว่า แก้ว หลอดทดลองสร้างขึ้นทั้งหมด 3 มล. ในแต่ละหลอด
3.3 การวัดฟลูออเรสเซนซ์ ( fluorescence ) สีเขียว
3 .1 ติดตั้ง 486 nm กรองและตัวกรองใน a-ex 520 nm ใน a-em.
3.3.2 หมุน td-700 กรองกระบอกที่ 485 nm ไทเทเนียมกรอง 530 nm มลพิษทางแสง
3.3.3 ท่านจะแสดงการปรับโหมดง่าย ( ดูคู่มือของคุณถ้าจำเป็น ) กด " Enter " จากปุ่มกด เลือก [ 1 ] บนแป้นพิมพ์เพื่อป้อนการตั้งค่า " " จากนั้นเลือก [ 1 ] เพื่อเข้าสู่ " โหมด "
3.3 .4 ใช้ปุ่มลูกศรเพื่อเลือกโหมดให้เลือก " ง่ายแล้ว [ ESC ] สองครั้งเพื่อกลับสู่หน้าจอการติดตั้ง / สอบเทียบ เลือก [ 2 ] แล้วกด [ Enter ]
3.3.5 การ td-700 จะพร้อมท์ให้คุณแทรกตัวอย่างทั่วไป แทรกตัวอย่างที่มีหมายเลขที่ใหญ่ที่สุดของแบคทีเรียที่มีชีวิต ; ตัวอย่างนี้ควรมีความเข้มของการเรืองแสงสีเขียวสูงที่สุดในหมู่ผู้ถูกวัดในการทดลองที่อธิบายไว้ที่นี่ นี่เป็นตัวอย่างที่มี 0% isopropyl แอลกอฮอล์ .
3.3.6 กด [ Enter ] อุปกรณ์ตรวจจับความไวจะได้โดยอัตโนมัติ ปรับให้ตรงกับการเรืองแสงของตัวอย่าง เมื่อหน้าจอแสดงให้เห็นว่าตัวอย่าง 500 , กด [ Enter ] td-700 ของคุณคือตอนนี้ สอบเทียบ
3.3 .7 กด [ Enter ] อีกครั้ง และอ่านตัวอย่างที่เหลืออยู่ในลำดับของรีเอเจนต์ว่างตามด้วยตัวอย่างแบคทีเรียเพื่อเพิ่มความเข้มข้นของแอลกอฮอล์ isopropyl .
3.3.8 สำหรับแต่ละตัวอย่าง บันทึกการเรืองแสงฟลู โรมิเตอร์ค่าความหนาแน่นที่แสดงบนหน้าจอแสดง เกลี่ยๆ photobleaching ผลแทรกตัวอย่างในฟลู โรมิเตอร์สำหรับช่วงเวลาประมาณเท่ากับข้อมูลที่ถูกต้อง สำหรับสีพื้นหลังโดยการลบสารเคมีว่างค่าจากแต่ละตัวอย่างแบคทีเรียเรืองแสงเรืองแสงอ่าน
3.4 เรืองการวัด ( เรืองแสงสีแดง )
3.4.1 หมุน td-700 กรองกระบอกที่ 520 nm ไทเทเนียม 325-700 nm และใหญ่กว่า 610 nm สารมลพิษตัวกรองในเส้นทางของแสง ( " B " ด้าน มือซ้ายมีจุดสีเงิน ) .
3.4 .2 กด [ Enter ] บน td-700 คีย์แพด .
3.4.3 เลือก [ 2 ] การสอบเทียบจากแสดงตัวเลือก .
3.4.4 แทรกตัวอย่างที่มีจำนวนมากที่สุดที่ตายแล้วแบคทีเรีย ; ตัวอย่างนี้ควรมีความเข้มของการเรืองแสงสีแดงสูงสุดในหมู่ผู้ถูกวัด ในการทดลองที่อธิบายไว้ที่นี่ นี่เป็นตัวอย่างที่มี 100% isopropyl แอลกอฮอล์ .
3.4.5 กด Enterอุปกรณ์ตรวจจับความไวจะได้โดยอัตโนมัติ ปรับให้ตรงกับการเรืองแสงของตัวอย่าง .
3.4.6 กด Enter อีกครั้ง และอ่านตัวอย่างที่เหลืออยู่ในลำดับของรีเอเจนต์ว่างตามด้วยตัวอย่างแบคทีเรียเพื่อเพิ่มความเข้มข้นของแอลกอฮอล์ isopropyl .
3.4.7 สำหรับแต่ละตัวอย่าง บันทึกการเรืองแสงฟลู โรมิเตอร์ค่าความหนาแน่นที่แสดงบนหน้าจอแสดงเกลี่ยๆ photobleaching ผลแทรกตัวอย่างในฟลู โรมิเตอร์สำหรับช่วงเวลาประมาณเท่ากับ ข้อมูลที่ถูกต้อง สำหรับสีพื้นหลังโดยการลบสารเคมีว่างค่าจากแต่ละตัวอย่างแบคทีเรียเรืองแสงเรืองแสงอ่าน
3.5 ข้อมูลการวิเคราะห์และการตีความ
ที่สำคัญสำหรับแต่ละตัวอย่างแบ่งพื้นหลังเรืองแสงสีเขียวเข้มแก้ไขโดยพื้นหลังติดตามเข้มเรืองแสงสีแดง
3.5.2 พล็อตค่าสีเขียว / แดงเรือง อัตราส่วนความเข้มของแสง ( แกน Y ) เป็นฟังก์ชันของไอโซโพรพิลแอลกอฮอล์ความเข้มข้น ( แกน X )
3.5.3 วางแผนข้อมูลที่ควรจะแสดงการเรืองแสงสีเขียว / แดงเข้ม อัตราส่วนของจำนวนแบคทีเรียตายเพิ่มขึ้น ( เช่นเป็น isopropyl แอลกอฮอล์ความเข้มข้นเพิ่มขึ้น ; รูปที่ 1 ) .
รูปที่ 1
1 รูป การวิเคราะห์เชื้อ Staphylococcus aureus และต่อไปนี้การหนึ่งชั่วโมงที่ความเข้มข้นแตกต่างกันของไอโซโพรพิลแอลกอฮอล์ การ td-700 ห้องปฏิบัติการฟลู โรมิเตอร์ถูกใช้เพื่อแยก กับสีเขียว และการเรืองแสงสีแดงที่ย้อมด้วย syto 9 และ propidium ไอโอไดด์ ตามลำดับอัตราส่วนของการเรืองแสงสีเขียว / แดงเข้มถูกคำนวณสำหรับแต่ละตัวอย่างและงัดข้อกับไอโซโพรพิลแอลกอฮอล์ความเข้มข้น .
4 . อ้างอิง
J App bacteriol 72 , 410 ( 1992 )
จดหมายแอปเปิ้ล ธนิดา เหรียญทอง B Sc 13 , 58 ( 1991 )
curr ธนิดา เหรียญทอง B Sc 4 , 321 ( 1980 )
J ธนิดา เหรียญทอง B Sc ยาบ้า 13 , 87 ( 1991 )
5 สิทธิบัตรและเครื่องหมายการค้าข้อมูล
ชีวิต / ตายและ syto เป็นเครื่องหมายการค้าจดทะเบียนของโมเลกุลโพรบ , Incbaclight เป็นเครื่องหมายการค้าของ molec
การแปล กรุณารอสักครู่..
ภาษาอื่น ๆ
การสนับสนุนเครื่องมือแปลภาษา: กรีก, กันนาดา, กาลิเชียน, คลิงออน, คอร์สิกา, คาซัค, คาตาลัน, คินยารวันดา, คีร์กิซ, คุชราต, จอร์เจีย, จีน, จีนดั้งเดิม, ชวา, ชิเชวา, ซามัว, ซีบัวโน, ซุนดา, ซูลู, ญี่ปุ่น, ดัตช์, ตรวจหาภาษา, ตุรกี, ทมิฬ, ทาจิก, ทาทาร์, นอร์เวย์, บอสเนีย, บัลแกเรีย, บาสก์, ปัญจาป, ฝรั่งเศส, พาชตู, ฟริเชียน, ฟินแลนด์, ฟิลิปปินส์, ภาษาอินโดนีเซี, มองโกเลีย, มัลทีส, มาซีโดเนีย, มาราฐี, มาลากาซี, มาลายาลัม, มาเลย์, ม้ง, ยิดดิช, ยูเครน, รัสเซีย, ละติน, ลักเซมเบิร์ก, ลัตเวีย, ลาว, ลิทัวเนีย, สวาฮิลี, สวีเดน, สิงหล, สินธี, สเปน, สโลวัก, สโลวีเนีย, อังกฤษ, อัมฮาริก, อาร์เซอร์ไบจัน, อาร์เมเนีย, อาหรับ, อิกโบ, อิตาลี, อุยกูร์, อุสเบกิสถาน, อูรดู, ฮังการี, ฮัวซา, ฮาวาย, ฮินดี, ฮีบรู, เกลิกสกอต, เกาหลี, เขมร, เคิร์ด, เช็ก, เซอร์เบียน, เซโซโท, เดนมาร์ก, เตลูกู, เติร์กเมน, เนปาล, เบงกอล, เบลารุส, เปอร์เซีย, เมารี, เมียนมา (พม่า), เยอรมัน, เวลส์, เวียดนาม, เอสเปอแรนโต, เอสโทเนีย, เฮติครีโอล, แอฟริกา, แอลเบเนีย, โคซา, โครเอเชีย, โชนา, โซมาลี, โปรตุเกส, โปแลนด์, โยรูบา, โรมาเนีย, โอเดีย (โอริยา), ไทย, ไอซ์แลนด์, ไอร์แลนด์, การแปลภาษา.
- as well as
- Effect of recombinant growth hormone (GH
- ธุรกิจส่วนตัว
- A novel approach for a natural dyeing pr
- My wife died 2 years ago
- Remind my heart don't let love cut too d
- 'What did I say?' shouted Francois to Pe
- stay in touch of me.
- sum
- กลุ่มตัวอย่าง
- แล้วรอส่งของที่นั่น
- ฉันเข้าใจคุณเวลาเมา
- Ask me to find before!
- ฉันเคยอาศัยอยู่ที่ชัยภูมิ
- Age-dependent and jasmonic acid-induced
- Your third hint!
- I love those pics of you.. sent to me
- น้ำผัก
- พวกเขาเป็นไอดอลของฉัน
- i want you too
- If you have more free time
- ขอดูหน่อย
- The instant he says that.
- ขอหารูปก่อน
