PCR conditions, procedures and gel

PCR conditions, procedures and gel analysis methods

All FPNI-PCR procedures were arranged in three stages. The first stage involved a PCR step which was performed in a total volume of 20 μL, and contained 1-2 μL of the DNA products (i.e. 2 μL DNA extraction solution from the NaOH fast extraction method), 0.2 μM gene-specific primers (SP1), 1.0 μM fusion arbitrary degenerate primers and 1 U rTaq (Takara). Between 9-18 PCR cycles were performed using annealing temperatures ranging between 28°C and 52°C (full details of the conditions used are given in Table ​Table2).2). In the second and third PCR stages, gene-specific primers (SP2 and SP3) and adaptor-specific primers (FSP1 and FSP2) were used in place of the SP1 and fusion arbitrary degenerate primers, respectively; the schematic arrangement of these primer pairs with respect to the target genomic DNA is illustrated in Figure ​Figure2a.2a. Due to the exact primer-template match for the primer pairs used in the second and third PCR steps, high stringency cycles were employed in these two latter stages (details shown in Table ​Table2).2). For the second PCR step, a 1.0 μL aliquot of the first PCR product pool was used as the template. Following this second round of selective amplification, the secondary PCR products were diluted 50-fold with MQ water and 1 μL of the dilution was added as template to 20 μL volumes of the tertiary PCR mixtures. For visualisation of the products amplified following the second or third FPNI-PCR steps, a 5-8 μL aliquot was separated by electrophoresis in a 1.5% agarose TAE gel, then stained with ethidium bromide and observed under a UV illumination system.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

pcr เงื่อนไขวิธีการและวิธีการวิเคราะห์เจล

ทุกขั้นตอน fpni-PCR ถูกจัดอยู่ในขั้นตอนที่สาม ขั้นตอนแรกที่เกี่ยวข้องกับขั้นตอนวิธี PCR ซึ่งได้รับการดำเนินการในปริมาณจำนวน 20 ไมโครลิตรและมี 1-2 ไมโครลิตรของ dna ผลิตภัณฑ์ (เช่น 2 ไมโครลิตรการแก้ปัญหาการสกัดดีเอ็นเอจาก NaOH วิธีการสกัดอย่างรวดเร็ว), 0.2 ไมโครเมตรไพรเมอร์ยีนที่เฉพาะเจาะจง ( SP1), 10 ไมโครเมตรฟิวชั่นไพรเมอร์คนเลวโดยพลการและ 1 u rtaq (TAKARA) ระหว่าง 9-18 รอบ pcr ถูกดำเนินการโดยใช้อุณหภูมิการหลอมระหว่าง 28 ° C และ 52 ° C (รายละเอียดของเงื่อนไขที่นำมาใช้จะได้รับใน table2 ตาราง) 2) ในที่สองและสามขั้นตอน pcr,ไพรเมอร์ยีนที่เฉพาะเจาะจง (sp2 และ SP3) และไพรเมอร์อะแดปเตอร์เฉพาะ (fsp1 และ fsp2) ถูกนำมาใช้ในสถานที่ของ sp1 และฟิวชั่นไพรเมอร์คนเลวโดยพลการตามลำดับการจัดแผนผังของคู่ไพรเมอร์เหล่านี้ด้วยความเคารพไปยังเป้าหมายดีเอ็นเอจีโนมเป็นภาพประกอบ ในรูป figure2a.2a เนื่องจากการจับคู่ไพรเมอร์ที่แน่นอนแม่แบบคู่ไพรเมอร์ที่ใช้ในขั้นตอน pcr ที่สองและสามรอบเข้มงวดสูงที่ถูกว่าจ้างในทั้งสองขั้นตอนหลัง (รายละเอียดแสดงในตาราง table2) .2) สำหรับขั้นตอน pcr ที่สองหาร 1.0 ไมโครลิตรของสระว่ายน้ำของผลิตภัณฑ์ pcr ครั้งแรกที่ถูกนำมาใช้เป็นแม่แบบ ต่อไปรอบที่สองนี้ของการขยายการคัดเลือกผลิตภัณฑ์ pcr รองถูกเจือจาง 50 เท่าด้วยน้ำ MQ และ 1 ไมโครลิตรของเจือจางถูกบันทึกเป็นแม่ถึง 20 ไมโครลิตรปริมาณของส่วนผสม pcr อุดมศึกษา สำหรับการแสดงของผลิตภัณฑ์ที่ขยายตามขั้นตอน fpni-pcr ที่สองหรือสามหาร 5-8 ไมโครลิตรถูกแยกออกโดยอิในเจล 1.5% agarose tae,แล้วย้อมด้วยสี ethidium โบรไมด์และสังเกตเห็นภายใต้ระบบแสงยูวี

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

PCR เงื่อนไข ขั้นตอน และวิธีการวิเคราะห์เจ

ถูกจัดทั้งหมด FPNI-PCR ขั้นตอนสามขั้นตอน ระยะแรกเกี่ยวข้องกับขั้นตอนของ PCR ซึ่งทำในปริมาตรรวมของ 20 μL และ μL 1-2 ของผลิตภัณฑ์ DNA (เช่น 2 μL ดีเอ็นเอแยกโซลูชันจากวิธีรวดเร็วแยก NaOH), อยู่ 0.2 μM ยีนเฉพาะไพรเมอร์ (SP1), 1ไพร 0 μM ฟิวชั่นอำเภอใจ degenerate เมอร์และ 1 U rTaq (Takara) ระหว่าง 9-18 PCR วงจรดำเนินใช้หลอมอุณหภูมิระหว่าง 28 ° C และ 52 ° C (รายละเอียดทั้งหมดของเงื่อนไขที่ใช้ได้ในตาราง Table2) 2) ในขั้นการ PCR ที่สอง และสาม ยีนเฉพาะไพรเมอร์ (SP2 และ SP3) และอะแดปเตอร์เฉพาะไพรเมอร์ (FSP1 และ FSP2) ได้ใช้ SP1 และฟิวชั่นอำเภอใจเสื่อมโทรมไพรเมอร์ ตามลำดับ มีแสดงการจัดแผนผังวงจรของคู่เหล่านี้รองพื้นกับเป้าหมาย genomic DNA ในรูป Figure2a.2a เนื่องจากการจับคู่แบบรองพื้นแน่นอนสำหรับคู่รองพื้นใช้ในตอน PCR ที่สอง และสาม รอบสูง stringency ถูกจ้างในระยะหลังนี้สอง (รายละเอียดแสดงในตาราง Table2) 2) สำหรับขั้นตอนสอง PCR ส่วนลงตัว μL 1.0 สระว่ายน้ำผลิตภัณฑ์ PCR ครั้งแรกถูกใช้เป็นแม่แบบ ต่อนี้รอบที่สองของงานขยาย มีผสมผลิตภัณฑ์ PCR รอง 50-fold มี MQ μL 1 ของการเจือจางและน้ำถูกเพิ่มเป็นแม่ 20 μL ปริมาณของส่วนผสม PCR ต่อ สำหรับการสร้างมโนภาพของผลิตภัณฑ์ขยายขั้นที่สอง หรือสามตอน FPNI PCR, μL 5-8 aliquot ถูกคั่น ด้วย electrophoresis ใน agarose 1.5% เจเต้ สีกับโบรไมด์ ethidium แล้วสังเกตภายใต้ระบบ UV แสงสว่าง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ขั้นตอน pcr ขั้นตอนเงื่อนไขและวิธีการการวิเคราะห์เจ ล

fpni ทั้งหมด - pcr ถูกจัดในสามขั้นตอน ขั้นตอนแรกที่เกี่ยวข้องกับขั้นตอนที่ pcr ซึ่งได้ดำเนินการในระดับเสียงทั้งหมด 20 μl 1-2 1-2 และที่อยู่ของดีเอ็นเอ μl ผลิตภัณฑ์ (เช่น 2 โซลูชัน μl สกัดดีเอ็นเอจากโซดาไฟได้อย่างรวดเร็วการขุดวิธี) 0.2 μ m ยีนเฉพาะ primers ( SP 1 ) 10 การผสมผสานμ m ตาม อำเภอ ใจเสื่อมทราม primers และ 1 U rtaq ( takara ) ระหว่าง 9-18 รอบ pcr นั้นดำเนินการโดยใช้ อุณหภูมิ annealing หลากหลายระหว่าง 28 ° C และ 52 ° C (รายละเอียดของเงื่อนไขที่ใช้จะได้รับในตาราง ​ โต๊ะ 2 ) 2 ) ในขั้นตอนที่สองและที่สาม pcr ได้ยีน - เฉพาะ primers ( SP 2 และ SP 3 )และอะแดปเตอร์ - เฉพาะ primers ( FSP 1 และ FSP 2 )ได้ถูกนำมาใช้ในที่ที่ติดตั้ง SP 1 และการผสมผสานตาม อำเภอ ใจเสื่อมทราม primers ,ตามลำดับ;ซึ่งมีลักษณะเป็นแผนการจัดเหล่านี้เชื้อปะทุเป็นคู่ด้วยความเคารพในเป้าหมาย genomic ดีเอ็นเอได้แสดงไว้ในรูปที่ ​ รูปที่ 2 A 2 A . การแข่งขันเนื่องจากเชื้อปะทุที่แน่นอนที่เทมเพลตสำหรับคู่เชื้อปะทุที่ใช้ในขั้นตอนที่สองและที่สาม pcr ได้รอบ(กฎสูงก็ยังใช้ในสองขั้นตอนหลังนี้(รายละเอียดที่แสดงในตาราง ​ โต๊ะ 2 ) 2 ) สำหรับขั้นตอนที่ pcr ที่สอง 1.0 aliquot μl ของสระน้ำ ผลิตภัณฑ์ pcr ครั้งแรกที่ถูกใช้เป็นเทมเพลต ต่อไปนี้รอบที่สองนี้การขยายสัญญาณเสียงมีทางเลือกผลิตภัณฑ์ pcr รองได้เจือจาง 50 เท่ากับน้ำ MQ และ 1 μl ของเจือจางได้เพิ่มเป็นเทมเพลตปริมาณ 20 μl ของส่วนผสม pcr ขั้นที่ สำหรับดูสถานะของสินค้าที่แอมพลิฟายตามขั้นตอน fpni - pcr ที่สองหรือที่สาม 5-8 5-8 5-8 aliquot μl ที่ถูกแยกโดย electrophoresis ในเจลเทควันโด agarose 1.5%แล้วแต้มสีพร้อมด้วยสำหรับอัดรูปถ่าย ethidium และปฏิบัติตามระบบแสง UV ที่.