2.2. Isolation and identification o

2.2. Isolation and identification of fungi
Soil fungi were isolated from 2 g of fresh soil using the plate
dilution method with Beer wort agar (Merck, Germany) enriched
with rose Bengal to prevent the growth of bacteria (Smith and
Dawson, 1944). After 7 d of incubation at 28 C, all morphologically
different colonies from each soil were transferred onto fresh
Beer wort agar plates (without rose Bengal) to obtain pure fungal
isolates. Pure fungal isolates (maximum 2 weeks old) were stored
using the silica gel storage method (Nakasone et al., 2004) at room
temperature prior to subsequent analysis.
Identification of isolates was provided by sequencing of the ITS
region of the ribosome encoding operon (Nilsson et al., 2009). DNA
from fungal mycelium was extracted using the NucleoSpin® Soil kit
(MachereyeNagel, Germany) (standard protocol with SL1 buffer
and SX enhancer). PCR was performed with the primer pair ITS1FITS4
(White et al., 1990; Gardes and Bruns, 1993) in a total volume
of 50 ml containing: 1 ml of template DNA, 25 ml of 2x Master Mix
(Thermo Scientific, USA), 2 ml of each 10 mMprimer (East Port Praha
s.r.o, Czech Republic) and 20 ml of MilliQ water. PCR products were
checked by agarose gel electrophoresis (1.0% w/v agarose; 110 V,
45 min) with GelRed™ staining. After purification (Diffinity RapidTip
®2, Diffinity Genomics, Inc., USA), PCR products were directly
sequenced with ITS1F as the sequencing primer (SEQme s.r.o.,
Czech Republic). A sequence similarity search was performed using
the BLASTN 2.2.23 þ program (Zhang et al., 2000) on the NCBI web
interface (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) to compare nucleotide
sequences to sequence databases (Altschul et al., 1990). A species
name was assigned to a specimen according to the match with the
highest query coverage and maximum identities of nucleotides
(Supplementary Table S1).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.2 การแยกและระบุของเชื้อราเชื้อราในดินได้แยกจาก g 2 ของใช้แผ่นดินสดวิธีการเจือจางเบียร์ wort agar (เมอร์ค เยอรมนี) อุดมไปด้วยกับกุหลาบเบงกอลเพื่อป้องกันการเจริญเติบโตของแบคทีเรีย (สมิธ และดอว์สัน 1944) หลัง d 7 ของการบ่มที่ 28 C, morphologically ทั้งหมดอาณานิคมต่าง ๆ จากดินแต่ละถูกโอนย้ายไปยังสดAgar wort เบียร์แผ่น (ไม่ มีกุหลาบเบงกอล) ล้วนได้รับเชื้อราแยก บริสุทธิ์เชื้อราที่แยกได้ (สูงสุด 2 สัปดาห์) ถูกเก็บไว้โดยใช้วิธีจัดเก็บซิลิก้าเจล (Nakasone et al., 2004) ห้องอุณหภูมิก่อนที่จะวิเคราะห์ต่อไปให้ระบุแยกตามลำดับของการภูมิภาคของไรโบโซมที่เข้ารหัส operon (Nilsson et al., 2009) ดีเอ็นเอจาก mycelium เชื้อราถูกสกัดโดยใช้ชุดดิน NucleoSpin ®(MachereyeNagel เยอรมนี) (มาตรฐาน protocol ด้วยบัฟเฟอร์ SL1กเพิ่ม SX) ทำ PCR กับคู่รองพื้น ITS1FITS4(สีขาวและ al., 1990 Gardes และบรันซ์ 1993) ในไดรฟ์ข้อมูลทั้งหมดบรรจุ 50 ml: ml 1 แม่แบบดีเอ็นเอ 25 ml 2 x หลักผสม(เทอร์โมวิทยาศาสตร์ สหรัฐอเมริกา), 2 ml ของแต่ละ mMprimer 10 (ตะวันออกพอร์ต Prahas.r.o สาธารณรัฐเช็ก) และ MilliQ น้ำ 20 ml ผลิตภัณฑ์ PCRถูก electrophoresis agarose เจล (agarose 1.0% w/v; 110 V45 นาที) ด้วย GelRed ™ย้อมสี หลังจากฟอก (Diffinity RapidTip® 2, Diffinity Genomics, Inc., USA), ผลิตภัณฑ์ PCR ได้โดยตรงเรียงลำดับ ด้วย ITS1F เป็นพื้นลำดับ (s.r.o. SEQmeสาธารณรัฐเช็กสาธารณรัฐ) ทำการค้นหาความคล้ายคลึงกันของลำดับโดยใช้BLASTN 2.2.23 þโปรแกรม (Zhang et al., 2000) บนเว็บ NCBIอินเทอร์เฟซ (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) เพื่อเปรียบเทียบนิวคลีโอไทด์ลำดับที่ลำดับฐาน (Altschul และ al., 1990) ชนิดชื่อถูกกำหนดให้เป็นตัวอย่างตามการจับคู่กับการสูงสุดแบบสอบถามสูงสุดและความครอบคลุมรหัสประจำตัวของนิวคลีโอไทด์(S1 ตารางเสริม)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.2 การแยกและบัตรประจำตัวของเชื้อราเชื้อราดินที่แยกได้จาก 2 กรัมของดินสดโดยใช้แผ่นวิธีเจือจางกับวุ้นเบียร์สาโท(เมอร์ค, เยอรมนี) อุดมไปด้วยดอกกุหลาบเบงกอลเพื่อป้องกันการเจริญเติบโตของแบคทีเรีย(สมิ ธ และดอว์สัน, 1944) หลังจาก 7 วันของการบ่มที่ 28 องศาเซลเซียสทุก morphologically อาณานิคมจากดินที่แตกต่างกันในแต่ละถูกโอนไปยังสดแผ่นวุ้นเบียร์สาโท (โดยไม่ต้องเพิ่มขึ้นเบงกอล) ที่จะได้รับเชื้อราบริสุทธิ์สายพันธุ์ สายพันธุ์เชื้อราบริสุทธิ์ (สูงสุด 2 สัปดาห์) ได้รับการจัดเก็บไว้โดยใช้วิธีการจัดเก็บข้อมูลซิลิกาเจล(Nakasone et al., 2004) ณ ห้องอุณหภูมิก่อนที่จะวิเคราะห์ที่ตามมา. บัตรประจำตัวของสายพันธุ์ได้รับจากการจัดลำดับของ ITS ภูมิภาค operon เข้ารหัสไรโบโซม ( ค๊ et al., 2009) ดีเอ็นเอจากเส้นใยของเชื้อราถูกสกัดโดยใช้NucleoSpin®ชุดดิน(MachereyeNagel เยอรมนี) (โปรโตคอลมาตรฐานที่มีบัฟเฟอร์ SL1 และเพิ่ม SX) PCR ได้ดำเนินการกับคู่ไพรเมอร์ ITS1FITS4 (สีขาว, et al, 1990; Gardes และบรู, 1993.) ในปริมาณ50 มล. ที่มี: 1 มิลลิลิตรของดีเอ็นเอแม่แบบ 25 มิลลิลิตร 2x โทผสม(เทอร์โมวิทยาศาสตร์ USA) 2 มิลลิลิตรละ 10 mMprimer (ตะวันออกพอร์ตปรากs.ro, สาธารณรัฐเช็ก) และ 20 ml ของน้ำ MilliQ ผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ได้รับการตรวจสอบโดยข่าวคราว agarose (1.0% w / v agarose; 110 V, 45 นาที) โดยมีการย้อมสี GelRed ™ หลังจากที่การทำให้บริสุทธิ์ (Diffinity RapidTip ®2, Diffinity ฟังก์ชั่นอิงค์สหรัฐอเมริกา) ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกโดยตรงติดใจกับITS1F เป็นไพรเมอร์ลำดับ (SEQme sro การ, สาธารณรัฐเช็ก) ค้นหาความคล้ายคลึงกันตามลำดับได้รับการดำเนินการโดยใช้กล่าวหา 2.2.23 þโปรแกรม (Zhang et al., 2000) ในเว็บ NCBI อินเตอร์เฟซ (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) เพื่อเปรียบเทียบเบื่อหน่ายลำดับลำดับฐานข้อมูล(Altschul et al., 1990) ชนิดชื่อได้รับมอบหมายให้ชิ้นงานที่เป็นไปตามการแข่งขันที่มีความคุ้มครองแบบสอบถามสูงสุดและตัวตนของนิวคลีโอสูงสุด(S1 ตารางเสริม)