3. Results and discussion3.1. ELISA

3. Results and discussion
3.1. ELISA optimisation and cross reactivity test
A spectrophotometric ELISA used to asses immunoassay sensitivity
and specificity of Mab. The developed ELISA protocol was
similar to that applied by Ammida et al. (Ammida, Micheli, &
Palleschi, 2004), with minor modifications. Standard curves were
produced using standard solutions of AFB1 (0, 5, 10, 20 and
50 ng ml
1 ). To achieve the optimal condition for assay, Mab
antibody gradually titrated from 1: 10 000 to 1:35 000 (v/v) dilution.
In the Fig. 1 generated calibration curves has been shown.
Detection limit of optimised ELISA defined as the concentration
corresponding to the f(x) value obtained by subtracting three times
the standard deviation of the zero standard measurement from
standard curve (Ammida et al., 2004). Using this formula sensitivity
of developed ELISA determined as 0.7 ng g
1. The specificity of
ELISA was evaluated by determining the cross-reactivity of Mab
with AFB1, AFB2, AFG1 and AFG2. The IC50 was obtained from the
standard curves. The calculated cross-reactivity measured as 100%,
72%, 35% and 32% for AFB1, AFB2, AFG1 and AFG2, respectively. High
cross-reactivity obtained from AFB2 showing that Mab should be
re-consider for selective detection of AFB1.
3.2. Optimization on toxin microarray
Utilizing the dot blot technique, the concentration of
100 mgml
1 of AFB1-BSA and the concentrations of 0.33 mgml
1 of
monoclonal antibody and 0.01 mg ml
1 of IgG-Cy3 (positive controls)
were chosen for printing on FAST nitrocellulose slides. To
establish the working range in the microarray format, further titrations
of monoclonal antibody were performed. The four final
optimised dilution of monoclonal antibody applied on the sub arrays
were 1:150 000, 1:160 00, 1:170 000 and 1:180 000 (v/v) and
were evaluated by generating standard competition curves for
AFB1. Comparison of the calibration curves generated using the
toxin microarray indicated that the dilution of 1: 170 000 (v/v)
(equal to the concentration of 0.19 mg ml
1) can be used for
quantitative detection of AFB1 (Fig. 2). The minimum antibody
dilution used for ELISAwas 1: 35 000 (v/v) (0.94 mg ml
1) indicates
that the toxin microarray has the advantage of a reduction of
analytical usage and consumable costs by requiring near 5 fold less
of expensive Mab. Several microarrays were screened without
competitors in order to evaluate the experimental variation in spot
intensities among each array. Relative standard deviation no higher
than 10% was observed. The variation across the slide is affected by
the distance of the slide from microtitre plate, and the exact location
on the slide.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

3. ผลลัพธ์ และสนทนา3.1 การเพิ่มประสิทธิภาพ ELISA และเกิดปฏิกิริยาไขว้ทดสอบSpectrophotometric ELISA ใช้ประเมิน immunoassay ไวและ specificity มาบ โพรโทคอ ELISA ที่พัฒนาคล้ายกับที่ใช้โดย Ammida et al. (Ammida, Micheli, &Palleschi, 2004) มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย มีเส้นโค้งมาตรฐานผลิตโดยใช้วิธีมาตรฐานของ AFB1 (0, 5, 10, 20 และ50 ng มล 1) เพื่อให้ได้เงื่อนไขดีที่สุดสำหรับทดสอบ มาบแอนติบอดีค่อย ๆ titrated จาก 1:10 000 การเจือจาง 1:35 000 (v/v)ในการปรับเทียบ 1 Fig. สร้าง เส้นโค้งได้ถูกแสดงกำหนดขีดจำกัดตรวจสอบ ELISA บวมเป็นความเข้มข้นที่สอดคล้องกับค่า f(x) ที่ได้รับ โดยการลบสามครั้งส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานของการเป็นศูนย์ประเมินมาตรฐานจากมาตรฐานเส้นโค้ง (Ammida et al., 2004) ใช้ความไวสูตรนี้ของ ELISA ที่พัฒนาขึ้นเป็น 0.7 ng g 1 Specificity ของELISA ถูกประเมิน โดยกำหนด cross-reactivity ของมาบAFB1, AFB2, AFG1 และ AFG2 IC50 ได้รับจากการเส้นโค้งมาตรฐาน Cross-reactivity คำนวณวัดเป็น 100%72%, 35% และ 32% AFB1, AFB2, AFG1 และ AFG2 ตามลำดับ สูงcross-reactivity ได้จาก AFB2 แสดงว่า ควรจะมาบการพิจารณาเลือกตรวจ AFB13.2 การเพิ่มประสิทธิภาพบน microarray พิษใช้เทคนิคการจุดคืนในตา ความเข้มข้นของ100 mgml 1 ของบีเอสเอ AFB1 และความเข้มข้นของ mgml 0.33 1 ของmonoclonal แอนติบอดีและ 0.01 mg ml 1 ของ IgG Cy3 (บวกควบคุม)ถูกเลือกสำหรับการพิมพ์บนภาพนิ่ง nitrocellulose อย่างรวดเร็ว ถึงสร้างช่วงทำงานในรูปแบบ microarray, titrations เพิ่มเติมของแอนติบอดี monoclonal ดำเนินการ สุดท้ายสี่เจือจางบวมของแอนติบอดี monoclonal ใช้กับอาร์เรย์ย่อย1:150 000, 1:160 00, 1:170 000 และ 1:180 000 (v/v) และถูกประเมิน โดยการสร้างเส้นโค้งมาตรฐานแข่งขันสำหรับAFB1 เปรียบเทียบเส้นโค้งโดยระบุพิษ microarray ที่เจือจางของ 1:170 000 (v/v)(เท่ากับความเข้มข้นของมล 0.19 มิลลิกรัม 1) ใช้สำหรับตรวจสอบเชิงปริมาณ AFB1 (Fig. 2) แอนติบอดีต่ำสุดระบุว่า ใช้สำหรับ ELISAwas 1:35 000 (v/v) (0.94 มิลลิกรัมมล. 1) เจือจางว่า microarray พิษมีประโยชน์จากการลดลงของวิเคราะห์การใช้งานและค่าใช้จ่ายบริโภค โดยต้องใกล้ 5 พับน้อยของราคาแพงมาบ หลาย microarrays ได้ฉายโดยไม่ต้องคู่แข่งเพื่อประเมินการเปลี่ยนแปลงที่ทดลองในจุดปลดปล่อยก๊าซในแต่ละแถว เบี่ยงเบนมาตรฐานสัมพัทธ์ไม่สูงกว่า 10% ถูกตรวจสอบ จะมีผลต่อการเปลี่ยนแปลงในภาพนิ่งระยะห่างของภาพนิ่งจากจาน microtitre และตำแหน่งแน่นอนบนภาพนิ่ง

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

3. ผลการอภิปรายและ
3.1 การเพิ่มประสิทธิภาพของวิธี ELISA และการทดสอบปฏิกิริยาข้าม
ELISA สเปกที่ใช้ในการประเมินความไว immunoassay
และความจำเพาะของบ ที่พัฒนาโปรโตคอล ELISA
เป็นแบบเดียวกับที่ใช้โดยAmmida et al, (Ammida, Micheli และ
Palleschi, 2004) ที่มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย เส้นโค้งมาตรฐานการผลิตโดยใช้สารละลายมาตรฐานของ AFB1 (0, 5, 10, 20 และ 50 นาโนกรัมต่อมิลลิลิตร 1) เพื่อให้บรรลุถึงสภาวะที่เหมาะสมสำหรับการทดสอบที่บแอนติบอดีไตเตรทเรื่อย ๆ จาก 1: 10 000 000 1:35 (v / v) เจือจาง. ในรูป 1 สร้างเส้นโค้งการสอบเทียบได้รับการแสดง. ขีด จำกัด ของการตรวจหาที่ดีที่สุดวิธี ELISA กำหนดให้เป็นความเข้มข้นที่สอดคล้องกับf (x) ค่าที่ได้จากการลบสามครั้งส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานของศูนย์การวัดมาตรฐานจากกราฟมาตรฐาน(Ammida et al., 2004) การใช้ความไวสูตรนี้ในการพัฒนาวิธี ELISA กำหนดเป็น 0.7 นาโนกรัม 1 ความจำเพาะของวิธี ELISA ถูกประเมินโดยการกำหนดปฏิกิริยาข้ามของบกับAFB1, AFB2, AFG1 และ AFG2 IC50 ที่ได้รับจากเส้นโค้งมาตรฐาน คำนวณปฏิกิริยาข้ามวัด 100%, 72%, 35% และ 32% สำหรับ AFB1, AFB2, AFG1 และ AFG2 ตามลำดับ สูงปฏิกิริยาข้ามที่ได้รับจาก AFB2 แสดงให้เห็นว่าไฟควรจะพิจารณาอีกครั้งสำหรับการตรวจเลือกของAFB1. 3.2 การเพิ่มประสิทธิภาพใน microarray สารพิษที่ใช้เทคนิคblot จุดความเข้มข้นของ100 mgml 1 ของ AFB1-BSA และความเข้มข้น 0.33 mgml 1 ของแอนติบอดีและ0.01 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร 1 ของ IgG-Cy3 (ควบคุมบวก) ได้รับเลือกสำหรับการพิมพ์ บนสไลด์ nitrocellulose FAST เพื่อสร้างความหลากหลายในการทำงานในรูปแบบ microarray ที่ไตเตรทต่อไปของโมโนโคลนอลแอนติบอดีที่ได้ดำเนินการ ทั้งสี่คนสุดท้ายการลดสัดส่วนการเพิ่มประสิทธิภาพของโมโนโคลนอลแอนติบอดีที่ใช้กับอาร์เรย์ย่อยคือ1: 150 000, 1: 160 00, 1: 170 000 และ 1: 180 000 (v / v) และได้รับการประเมินโดยการสร้างเส้นโค้งการแข่งขันมาตรฐานAFB1 เปรียบเทียบเส้นโค้งการสอบเทียบที่สร้างขึ้นโดยใช้microarray สารพิษชี้ให้เห็นว่าการลดสัดส่วน 1: 170 000 (v / v) (เท่ากับความเข้มข้นของมล. 0.19 มก. 1) สามารถใช้สำหรับการตรวจสอบเชิงปริมาณของAFB1. (รูปที่ 2) แอนติบอดีขั้นต่ำเจือจางใช้สำหรับ ELISAwas 1: 35 000 (v / v) (0.94 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร 1) ระบุว่าmicroarray พิษได้ประโยชน์จากการลดลงของการใช้งานและค่าใช้จ่ายในการวิเคราะห์บริโภคโดยการกำหนดให้ใกล้5 เท่าน้อยของบมีราคาแพง microarrays หลายคนถูกคัดเลือกโดยไม่มีคู่แข่งในการประเมินรูปแบบการทดลองในจุดที่เข้มระหว่างกันอาร์เรย์ ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานสัมพัทธ์ไม่สูงกว่า 10% พบว่า รูปแบบทั่วสไลด์ได้รับผลกระทบโดยระยะทางจากแผ่นสไลด์ microtitre และสถานที่ตั้งบนภาพนิ่ง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

3 . ผลและการอภิปราย
3.1 . วิธีเพิ่มประสิทธิภาพและทดสอบปฏิกิริยาข้าม
เป็นวิธีที่มีความไว ) ใช้ลา
และมาบ specificity การพัฒนาวิธี ELISA โพรโทคอลคือ
คล้ายกับที่ใช้โดย ammida et al . ( ammida มิเคลี& , ,
palleschi , 2004 ) มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย เส้นโค้งมาตรฐาน
ผลิตโดยใช้โซลูชั่นมาตรฐานของสาร ( 0 , 5 , 10 , 20 และ 50 นาโนกรัม

1 )เพื่อให้ได้ภาพที่เหมาะสมสำหรับการตรวจสอบแอนติบอดีมาบ
ค่อยๆตลอดเวลาจาก 1 : 10 , 000 ถึง 1 : 35 000 ( v / v ) 4 .
ในรูปที่ 1 สร้างเส้นโค้งสอบเทียบได้ถูกแสดง .
จำกัดการค้นหาของการปรับปรุง ELISA กำหนดความเข้มข้น
สอดคล้องกับ f ( x ) ได้ โดยการลบค่าสามครั้ง
ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานของศูนย์มาตรฐานการวัดจาก
มาตรฐานเส้นโค้ง ( ammida et al . , 2004 ) ใช้สูตรนี้พัฒนาขึ้นไว
) ว่าเป็น 0.7 นาโนกรัม
1 ความจำเพาะของ
) ประเมินโดยกำหนดขอประทานมาบ
ด้วยสาร afb2 afg1 , และ , afg2 . การ ic50 ได้จาก
เส้นโค้งมาตรฐาน คำนวนขอประทานวัดเป็น 100 %
72% , 35% และ 32% สำหรับสาร afb2 afg1 , และ , afg2 ตามลำดับ สูง
ขอประทานได้จาก afb2 แสดง ซึ่งควรตรวจหาสาร
กำลังพิจารณาเลือก .
2 . เพิ่มประสิทธิภาพในการใช้สารพิษ microarray
dot blot เทคนิค ความเข้มข้นของ
100 mgml
1 afb1-bsa และความเข้มข้น 0.33 mgml
1 ของโมโนโคลนอลแอนติบอดีและ 0.01 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร

1 igg-cy3 ( ควบคุมบวก )
ถูกเลือกสำหรับการพิมพ์บนแผ่นไนโตรเซลลูโลสอย่างรวดเร็ว

สร้างช่วงทำงานใน microarray รูปแบบเพิ่มเติม titrations
โมโนโคลนอลแอนติบอดีในการวิจัย 4 สุดท้าย
- เจือจางของโมโนโคลนอลแอนติบอดีที่ใช้ในเรือดำน้ำ เรย์
ถูก 1:150 000 , 000 และ 1:180 1:170 1:160 00 , 000 ( v / v ) และมีการประเมินโดยการสร้างเส้นโค้ง

สารมาตรฐานสำหรับการแข่งขัน . การเปรียบเทียบเส้นโค้งสอบเทียบ
สร้างขึ้นโดยใช้สารพิษไมโคร เรย์พบว่าเจือจาง 1 : 170 , 000 ( v / v )
( เท่ากับความเข้มข้น 0.19 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร
1 ) สามารถใช้สำหรับการตรวจหาปริมาณสาร
( รูปที่ 2 ) ขั้นต่ำที่ใช้สำหรับ elisawas แอนติบอดี
เจือจาง 1 : 1 , 000 ( v / v ) ( 0.94 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร
1 ) บ่งชี้
ว่าสารพิษ microarray ได้ประโยชน์จากการลดการใช้และค่าใช้จ่ายสิ้นเปลือง
วิเคราะห์โดยให้ใกล้น้อย
5 พับของนางแพง การแสดงมีหลายโดยไม่
คู่แข่งเพื่อประเมินรูปแบบการทดลองในจุดระหว่างแต่ละ
เข้มเรย ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานสัมพัทธ์ไม่สูงกว่า
กว่า 10% ถูกสังเกต การเปลี่ยนแปลงผ่านภาพนิ่งผลกระทบโดย
ระยะทางของภาพนิ่งจาก microtitre จาน , และตำแหน่งที่แน่นอน
บนสไลด์