Extraction of fungal DNAThirty mg o

Extraction of fungal DNA
Thirty mg of freeze-dried mycelium was ground to a fine
powder in an Eppendorf tube in liquid nitrogen using a
pre-cooled pestle (Eppendorf no. 0030120973). The ground
mycelium was resuspended and lysed in 500ml of lysis buffer
(40 mmol/l Tris-acetate, 20 mmol/l sodium acetate,
1 mmol/l EDTA, 1% w/v SDS pH 7·8) (Lerner and Model
1981) by pipetting with a Gilson P 1000 pipetman (set to
1000ml) until the viscosity of the suspension was significantly
reduced and the formation of froth indicated the detachment
of DNA from polysaccharides. For most fungi five cycles of
gentle pipetting were sufficient; however, forN. loliiat least
30 cycles of vigorous pipetting was necessary. RNAse A (2ml
of 10 mg/ml; Sigma, St Louis, MO, USA) was added and
the mixture was incubated for 5 min at 37 °C. To facilitate
the precipitation of most polysaccharides, protein and cell
debris, 165ml of 5 mol/l NaCl solution was added and the
components mixed by inverting the tube several times. The
suspension was centrifuged at 13 000 rev min
−1
for 20 min at
4 °C, the supernatant was immediately transferred to a fresh
tube and 400ml of chloroform and 400ml of phenol were
added. The solution was mixed by gently inverting the tube
until the solution became milky (usually50 times). After
centrifugation for 20 min, the aqueous phase was removed
and extracted with an equal volume of chloroform. The DNA
in the aqueous supernatant was precipitated with two volumes
of 95% ethanol. To free the DNA from polysaccharide the
precipitate was resuspended in 500ml of lysis buffer and
mixed by gentle pipetting. Then 165ml of 5 mol/l NaCl
was added and the tube gently inverted several times. The
suspension was then chloroform-extracted as described
above. Usually, after centrifugation for 10 min, the aqueous
phase was clear and the DNA was precipitated with 95%
ethanol. On rare occasions the aqueous phase was still cloudy,
in which case it was re-extracted with one volume of chloroform before the DNA was precipitated. The precipitated
DNA was washed three times with 70% ice-cold ethanol,
dried and dissolved in 50ml TE buffer (10 mmol/l Tris-HCl,
0·1 mmol/l EDTA pH 7·8) and stored at−20 °C

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การสกัดดีเอ็นเอจากเชื้อรา
สามสิบมิลลิกรัมเส้นใยแห้งพื้นดินได้รับการปรับ
ผงในหลอด Eppendorf ในไนโตรเจนเหลวโดยใช้
สากก่อนระบายความร้อน (Eppendorf ไม่มี. 0030120973) พื้น
เส้นใยถูก resuspended และ lysed ใน 500ml ของ buffer สลาย
(40 มิลลิโมล / ลิตร Tris-acetate 20 มิลลิโมล / ลิตร acetate โซเดียม
1 มิลลิโมล / ลิตร EDTA, 1% w / v SDS ค่า pH 7 · 8) (Lerner และรุ่น
ปี 1981 ) โดยมีปิเปต Gilson P pipetman 1000 (กำหนดให้
1000ml) จนกระทั่งความหนืดของการระงับอย่างมีนัยสำคัญ
ที่ลดลงและการก่อตัวของฟองระบุออก
ของดีเอ็นเอจาก polysaccharides สำหรับเชื้อรามากที่สุดห้ารอบของ
ปิเปตอ่อนโยนเพียงพอ; แต่ Forn loliiat อย่างน้อย
30 รอบของการปิเปตแข็งแรงเป็นสิ่งจำเป็น RNase (2ml
10 mg / ml; ซิกเซนต์หลุยส์, MO, USA) ได้รับการเพิ่มและ
ส่วนผสมที่ถูกบ่มเป็นเวลา 5 นาทีที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เพื่ออำนวยความสะดวก
การตกตะกอนของ polysaccharides ที่สุดโปรตีนและเซลล์
เศษ 165ml 5 โมล / ลิตรแก้ปัญหาโซเดียมคลอไรด์ถูกบันทึกและ
ส่วนประกอบผสมโดย inverting หลอดหลายครั้ง
ถูกระงับการหมุนเหวี่ยงที่ 13 000 รอบต่อนาที
-1
เป็นเวลา 20 นาทีที่
4 องศาเซลเซียสใสถูกย้ายทันทีที่สด
และหลอด 400ml คลอโรฟอร์มและ 400ml ของฟีนอลถูก
เพิ่ม วิธีการแก้ปัญหาที่ได้รับการผสมโดย inverting หลอดเบา ๆ
จนกลายเป็นวิธีการแก้ปัญหาน้ำนม (ปกติ 50 ครั้ง) หลังจากที่
ปั่นเป็นเวลา 20 นาที, เฟสน้ำจะถูกลบออก
และสกัดด้วยปริมาณที่เท่ากันของคลอโรฟอร์ม ดีเอ็นเอ
ในสารละลายน้ำได้รับการตกตะกอนกับสองเล่ม
ของเอทานอล 95% ที่จะเป็นอิสระดีเอ็นเอจาก polysaccharide
ตะกอนถูก resuspended ใน 500ml ของ buffer สลายและ
ผสมโดยปิเปตอ่อนโยน จากนั้น 165ml 5 โมล / ลิตรโซเดียมคลอไรด์
ถูกบันทึกและหลอดคว่ำเบา ๆ หลายครั้ง
ระงับแล้วสกัดคลอโรฟอร์มตามที่อธิบายไว้
ข้างต้น โดยปกติแล้วหลังจากที่ปั่นเป็นเวลา 10 นาที, น้ำ
ขั้นตอนที่ชัดเจนและ DNA ถูกตกตะกอนด้วย 95%
เอทานอล ในโอกาสที่หายากเฟสน้ำเป็นเมฆยังคง
ซึ่งในกรณีนี้เป็นอีกครั้งหนึ่งที่สกัดด้วยคลอโรฟอร์มปริมาณของดีเอ็นเอก่อนที่จะได้รับการตกตะกอน ตกตะกอน
ดีเอ็นเอถูกล้างสามครั้งกับเอทานอลเย็น 70%,
แห้งและละลายใน 50ml บัฟเฟอร์ TE (10 มิลลิโมล / ลิตร Tris-HCl,
0 · 1 มิลลิโมล / ลิตร EDTA พีเอช 7 · 8) และเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 20 องศาเซลเซียส

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การสกัดดีเอ็นเอของเชื้อรา
สามสิบมิลลิกรัม เส้นใยแห้งถูกพื้นดินให้ละเอียด
ผงในหลอดเพนดอร์ฟในไนโตรเจนเหลวโดยใช้
Pre ด้วยสาก ( เพนดอร์ฟ ไม่ 0030120973 ) พื้นดิน
เส้นใยคือ resuspended lysed 500ml ของบัฟเฟอร์และในการสลาย
( 40 มิลลิโมล / ลิตรซึ่งอะซี 20 mmol / L โซเดียมอะซิเตท ,
1 mmol / L ตามลำดับ , 1% w / v SDS ที่ pH 7 ด้วย ( 8 ) และแบบจำลอง
เลิร์นเนอร์1981 ) โดย pipetting กับ Gilson P 1000 pipetman ( ตั้งค่า
1000ml ) จนกระทั่งความหนืดของสารแขวนลอยอย่างมีนัยสำคัญ
ลดลงและการก่อตัวของฟองพบกอง
ของดีเอ็นเอจากพอลิแซ็กคาไรด์ . สำหรับเชื้อรามากที่สุดห้ารอบ
อ่อนโยน pipetting ได้เพียงพอ อย่างไรก็ตาม พื้นที่ . loliiat อย่างน้อย
30 รอบแข็งแรง pipetting จำเป็น เลส ( 2ml
10 mg / ml ; Sigma , เซนต์ หลุยส์ โมสหรัฐอเมริกา ) คือการเพิ่มและ
ส่วนผสมบ่มเป็นเวลา 5 นาทีที่ 37 องศา เพื่อความสะดวกในการตกตะกอนโพลีแซคคาไรด์มากที่สุด

โปรตีนและเซลล์เศษ 165ml 5 mol / L NaCl สารละลายจะเพิ่มและ
ส่วนประกอบผสมโดยกลับหัวหลอดหลายๆ ครั้ง
ระงับได้ระดับที่ 13 000 ป๋ามิน

− 1 สำหรับ 20 นาทีที่
4 ° C , นำทันทีย้ายไปสด
ท่อและ 400ml ของคลอโรฟอร์ม และ 400ml ฟีนอลเป็น
เพิ่ม สารละลายที่ผสมเบา ๆกลับหัวหลอด
จนถึงโซลูชั่นกลายเป็นน้ำนม ( มักจะ  50 ครั้ง ) หลังจาก
ปั่นนาน 20 นาที ระยะที่น้ำถูกลบออก
และสกัดด้วยปริมาณเท่ากัน คลอโรฟอร์ม ดีเอ็นเอ
ในน่านน้ำมาตกตะกอนด้วย 2 เล่ม
เอทานอล 95%ฟรีดีเอ็นเอพอลิแซคคาไรด์
ตกตะกอนเป็น resuspended 500ml ของบัฟเฟอร์ และในการสลาย
ผสมอ่อนโยน pipetting . แล้ว 165ml 5 mol / L NaCl
เพิ่มและท่อเบา ๆแบบ หลายๆ ครั้ง
ถูกระงับแล้วคลอโรฟอร์มสกัด
ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น โดยปกติ หลังจากปั่นมา 10 นาที น้ำ
เฟสมีความชัดเจน และดีเอ็นเอตกตะกอนด้วยเอทานอล 95%
.ในโอกาสที่หายาก ระยะน้ำยังเมฆ
ซึ่งในกรณีนี้ก็เป็นอีกครั้งที่สกัดด้วยคลอโรฟอร์ม ก่อนที่ปริมาณดีเอ็นเอตกตะกอน . ตกตะกอน
DNA ซักสามครั้งกับ 70% เย็นแห้งและละลายในเอทานอล
50ml TE buffer ( 10 mmol / L หรือ HCl ,
0 ด้วย 1 มิลลิโมล / ลิตร EDTA pH 7 ด้วย 8 ) และเก็บรักษาที่ − 20 ° C