Indian Journal of Experimental Biol

Indian Journal of Experimental Biology
Vol. 47, May 2009, pp. 327-332
Mouse acquired HPV tumor using dorsal skin -fold window chamber
Monthon Lertworapreechal, Suthiluk Patumraj2, Somchai Niruthisard3,
Pokrath Hansasuta4& Parvapan Bhattarakosor
'inter -Department of Medical Microbiology, Graduate School, Departments of 2Physiology, 3Gynaecology and
4 Microbiology, Faculty of Medicine, Chulalongkorn University, Rama 4 road, Bangkok 10330, Thailand
Received 27 November 2008; revised 24 February 2009
Human papillomavirus (HPV) plays important role in developing several types of cancer especially cervical cancer. In
order to understand the viral pathogenesis, the animal model of HPV infection is very necessary. This communication
reports establishment of an animal model carrying implanted HeLa cells, a human cervical cancer cell line via dorsal skin-
fold window chambers. Nude mice were divided into 4 groups; each group contained different amount of HeLa cells,
2.5x 105 , 5x10 5, and lx106 cells, and cell free medium (control), respectively. The results showed that even using the low
number of HeLa cells (2.5x10 5 ), the tumor microvasculature was developed at 2 weeks after implantation with the enlarged
tumor margin which then progressed to tumor mass in the following week. The existing tumor was confirmed to be HeLa-
cell type by PCR, in situ hybridization, and HPV genotyping. By using linear regression analysis, it indicated that means of
tumor size from each group significantly increased in relation to number of HeLa cells used (R2= 0.98, y = 0.117 1 x+4.35).
This mouse model will be useful for the further HPV studies particularly anti -cancer drugs efficacy.
Keywords: Dorsal skin -fold window chamber, HPV Tumor, Mouse model
Human papillomavinis (HPV) is a naked, icosahedral human cervical cancer cells was conducted. The
capsid, about 8 kb circular double stranded DNA virus, implanted mice were monitored for their weight
belonging to the family Papillomaviridael. At present changes and size of tumor. The tumor
more than 150 different HPV types have been reported2. microvasculature was also investigated under an
Approximately 40 types of HPV involve in anogenital intravital fluorescence videomicroscope. In addition,
tract infection and they can be classified as high risk (i.e., tumor lesion was then confirmed to be HeLa mass by
HPV 16, 18, 31, 33, and 35) and low risk (i.e., HPV 6 and using PCR technique, in situ hybridization, and HPV
11) types according to the spectrums of their abilities to genotyping.
induce cancers2'3 . Unlike other viruses, HPV is highly
host -specific, unable to propagate in normal cell culture Materials and Methods
and its replication cycle requires the differentiation Animals—Female BALB/c-nude mice from
process of keratinocytes 2'4 . Thus, the interaction of National Laboratory Animal Center of Salaya
virus and host is not well understood. Many attempts Campus, Mahidol University, Bangkok, Thailand
have been made using several means to develop aged 4-8 weeks and weighing 20-25 g were used. The
animal model, starting from direct inoculation of HPV animals were handled as recommended by the guide
extracted from naturally human lesion to human for the care and use of experimental animals 1996,
neonatal foreskin and then grafted underneath the Institute of Laboratory Animal Resources,
renal capsule of athymic mices, direct transplant Commission on Life Sciences, National Research
tumor tissue by xenograft technique and development Council, USA.
of transgenic mice containing HPV E6 gene 6'7. An
Cervical cancer cell line—HeLa cell is a human
attempt has been made by inoculating HPV
cervical cancer cell line which contains integrated
transformed cervical cell line, HeLa, into dorsal skin-
HPV-18 genome approximately 10-30 copies/ce118. fold window chamber. An animal model carrying
The cells were cultured in MEM medium (HyClone;
USA) supplemented with 10% heat -inactivated fetal
*Correspondent author bovine serum (HyClone, USA), penicillin (50 unit/m1)
Telephone: [phone]; ext. 616 and streptomycin (50 µg/ml) with split ratio of 1:3.
Fax: [phone]
E-mail: [e-mail] They were subcultured every 2-3 days regularly to
328 INDIAN J EXP BIOL, MAY 2009
maintain log phase. The cells were trypsinized into TTT and L1C2; TACCCTAAATACTCTGTATTG9
single cells before use. and house keeping gene of human beta-globin, PC04;
HeLa-implantation in mice—Mouse was CAACTTCATCCACGTTCACC and GH20;
anaesthetized with pentobarbital sodium (50 mg/kg GAAGAGCCAAGGACAGGTAC 10. Those primers
body weight, ip). The dorsal skin -fold window were purchased from Invitrogen, Hong Kong. A
chamber was fixed on the dorsal of each mouse. The reaction for each primer set was the same, i.e.,
different amount of HeLa cells (2.5x10 5, 5x105 and 100 mM KC1, 20 mM Tris, 1.5 mM MgC1 2 , 200 pM
1 x106) were inoculated into the dorsal skin -fold dNTPs, 25 pM primer each, 1.25 units of Taq
window chamber. Each group contained 5 mice. Mice polymerase (Fermentas, Lithuania) and 1 Al of DNA
in the control group received only MEM medium. All sample in total volume of 50 pl. The amplification
the mice were regularly weighed every week condition for HPV-L1 was 95°C, 10 min for a cycle,
continuously until 8 weeks and observed for the then denaturation at 95°C, 1.5 min, annealing 40°C, 1.5
tumor development. The size of tumor mass was also min and extension 72°C, 2 min, repeated for
measured. 40 cycles followed by another extension at 72°C, for 10
Intravital fluorescence videomicroscopy—For the min. The HPV-L1 product size was 250 bps. For
study of tumor angiogenesis, intravital fluorescence human beta-globin, the amplification conditions was
videomicroscopy was used. Two weeks after 1 x10 6 94°C, 10 min for a cycle, then denaturation at 94°C, 30
HeLa-inoculation, the mice were anaesthesized with sec, annealing 62°C, 1 min and extension 68°C,
1 min, repeated for 40 cycles followed by another an ip injection of sodium pentobarbitol (50 mg/kg). A
catheter was inserted into a jugular vein for an extension at 68 ° C for 10 min. The amplified product
application of fluorescence tracers [FITC-dextran, size of human beta-globin was 268 bps. Detection of
mol. wt=200,000, 0.5% (Sigma Chemical, USA)]. the amplicons was done by agarose gel electrophoresis.
The tumor microvasculature was observed under an HPV genotyping—DNA extracted from tumor cells
intravital fluorescence microscope (Nikon, Japan) was analyzed for HPV genotyping by using HPV
equipped with a videocamera (Sony SIT68, Japan) genotyping kit (Inno-Lipa HPV Genotyping V2;
and video -recorder (Sony SVT-124P, Japan). The 10x Irmogenetics; Germany). The principle of this
objective lens was used to observe microvessels technique is based on the reverse hybridization. A part
within the tumor -bearing chamber. Based on the of L 1 region of the HPV genome was amplified and
recorded videoimages, the tumor microvascular denatured biotinylated amplicons were hybridized
networks including neocapillary density were with specific oligonucleotide probes which were
analyzed by using digital image processing software immobilized as parallel lines on membrane strips. The
(Global Lab II). procedure of test was performed as recommendation
Tumor size, tumor weight and histopathological by company.
examination—Tumor size was assessed using vernier In situ hybridization of HPV-DNA—The presence
calipers (VWR, St. Louis, MO) after the mice were of HPV-DNA in cells was detected by in situ
anesthesized with an ip injection of sodium hybridization using a probe specific to HPV-16/18
pentobarbitol (50 mg/kg). An over dose of sodium obtained from the Enzo Diagnostics kit (USA) in
pentobarbital was used for euthanasia the mice, tumor combination with the Dako GenPoint kit (Denmark).
mass was carefully collected immediately, weighed The system is colorimetric detection using tyramide
and fixed into neutral buffer formalin (4% formalin, reporter molecule to amplify the number of biotin
0.4% NaH 2PO4, 0.65% Na2 HPO4 ). Formalin-fixed, which enhances binding of streptavidin-horseradish
paraffin -embedded tissue samples were cut in 5 gm peroxidase (HRP) complex and 3,3' diaminobenzidine
thick sections on a microtome with a disposable blade (DAB) was used as substrate. Then, the tissue was
and fixed with Hematoxylin and Eosin (H&E) stains. counterstained with Hematoxilin. The protocol was
HPV-DNA detection—The tissue sections from performed according to the manufacturer's
tumor were extracted by using Qiagen DNA extraction recommendation. This assay was kindly performed by
kit (Qiagen, USA). The extracted DNA was then Professor Dr. Wasun Chantratita, Division of
determined for the presence of HPV genome by Molecular Virology, Department of Pathology,
polymerase chain reaction using specific HPV-L1 Ramathibodi Hospital, Mahidol University, Bangkok
primers, L1C1; CGTAAACGTTTTCCCTATTTT- 10400, Thailand.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

อินเดียสมุดทดลองวิชาชีววิทยา
ปี 47, 2552 พฤษภาคม นำ 327-332
เมาส์มาเนื้องอกมะเร็งปากมดลูกใช้ dorsal ผิว - พับหน้าต่างหอ
Lertworapreechal มณฑล Suthiluk Patumraj2 สมชาย Niruthisard3,
Pokrath Hansasuta4& Parvapan Bhattarakosor
' อินเตอร์ - แผนกภาควิชาทางการแพทย์จุลชีววิทยา บัณฑิตวิทยาลัย ของ 2Physiology, 3Gynaecology และ
4 จุลชีววิทยา คณะแพทยศาสตร์ จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย ถนนพระราม 4 กรุงเทพ 10330 ประเทศไทย
รับ 27 2551 พฤศจิกายน แก้ไข 24 กุมภาพันธ์
มนุษย์ papillomavirus (HPV) บทบาทสำคัญในการพัฒนาหลายชนิดของมะเร็งโดยเฉพาะมะเร็งปากมดลูก ใน
สั่งเข้าใจพยาธิกำเนิดไวรัส รูปสัตว์ติดเชื้อ HPV มีความจำเป็นมากขึ้น การสื่อสารนี้
รายงานจัดดำเนินการแบบจำลองสัตว์ implanted เซลล์ HeLa บรรทัดเซลล์มะเร็งปากมดลูกมนุษย์ผ่าน dorsal ผิว-
พับหน้าต่างห้อง หนูเปลือยกายถูกแบ่งออกเป็น 4 กลุ่ม แต่ละกลุ่มประกอบด้วยจำนวนแตกต่างกันที่เซลล์ HeLa,
2.5 x 105, 5 x 10 5 และ lx106 และเซลล์เซลล์ฟรีขนาดกลาง (ตัวควบคุม), ตามลำดับ ผลพบว่าแม้ใช้ต่ำสุด
จำนวนเซลล์ HeLa (2.5x10 5), microvasculature เนื้องอกถูกพัฒนาขึ้นใน 2 สัปดาห์หลังจากการประดิษฐ์ด้วยการขยาย
ขอบเนื้องอกที่แล้ว หน้าไปเพียงใดให้มวลเนื้องอกในสัปดาห์ต่อไปนี้ เนื้องอกที่มีอยู่ได้รับการยืนยันเป็น HeLa-
เซลล์ชนิด ทาง PCR ใน situ hybridization, HPV genotyping โดยใช้การวิเคราะห์การถดถอยเชิงเส้น มันระบุว่า ของ
ขนาดเนื้องอกแต่ละกลุ่มอย่างมีนัยสำคัญเพิ่มขึ้นโดยสัมพันธ์กับจำนวนเซลล์ HeLa (R2 = 0.98, y = 1 0.117 x 4.35) .
เมาส์รุ่นนี้จะเป็นประโยชน์สำหรับการศึกษามะเร็งปากมดลูกเพิ่มเติมโดยเฉพาะอย่างยิ่งต่อต้าน - ประสิทธิภาพยามะเร็ง
คำสำคัญ: Dorsal ผิว - พับหน้าต่างหอการค้า เนื้องอกมะเร็งปากมดลูก เมาส์รุ่น
papillomavinis มนุษย์ (HPV) เป็นเปลือย เซลล์มะเร็งปากมดลูกมนุษย์ icosahedral ถูกดำเนินการ ใน
capsid คู่กลมควั่น DNA ไวรัส 8 kb ลิฟต์หนูถูกตรวจสอบสำหรับน้ำหนักของ
ของครอบครัว Papillomaviridael ในปัจจุบันการเปลี่ยนแปลงและขนาดของเนื้องอก เนื้องอก
HPV มากกว่า 150 ชนิดมี reported2 microvasculature ยังถูกสอบสวนภายใต้การ
ประมาณ 40 ชนิดของ HPV ที่เกี่ยวข้องกับใน anogenital intravital fluorescence videomicroscope นอกจากนี้,
ติดเชื้อทางเดินอาหารและพวกเขาสามารถจำแนกได้เป็นความเสี่ยงสูง (เช่น แผลเนื้องอกได้แล้วยืนยัน จำนวนมาก HeLa โดย
HPV 16, 18, 31, 33 และ 35) และความเสี่ยงต่ำ (เช่น HPV 6 และการใช้ PCR เทคนิค ใน situ hybridization และมะเร็งปากมดลูก
11) ชนิดตามการ spectrums ความสามารถการ genotyping
ก่อให้เกิด cancers2'3 ซึ่งแตกต่างจากไวรัสอื่น ๆ มะเร็งปากมดลูกคือ
โฮสต์ - เฉพาะ ไม่สามารถเผยแพร่ในงานเพาะเลี้ยงเซลล์ปกติวัสดุและวิธีการ
และวงจรจำลองต้องการสร้างความแตกต่างสัตว์ — หนูหญิง BALB/c-nude จาก
กระบวนการของ keratinocytes 2'4 ดังนั้น การโต้ตอบของชาติปฏิบัติสัตว์ศูนย์ของศาลายา
ไวรัสและโฮสต์ไม่เป็นดีที่เข้าใจ หลายคนพยายามมหาวิทยาลัย มหาวิทยาลัยมหิดล กรุงเทพ ไทย
มีการทำโดยใช้หลายวิธีพัฒนาอายุ 4-8 สัปดาห์ และน้ำหนัก 20-25 g ใช้ ใน
รูปสัตว์ เริ่มต้นจาก inoculation โดยตรงของมะเร็งปากมดลูกสัตว์ถูกจัดการแนะนำ โดยไกด์
แยกจากแผลตามธรรมชาติมนุษย์เพื่อมนุษย์สำหรับการดูแลและการใช้สัตว์ทดลอง 1996,
หนังหุ้มปลายที่ทารกแรกเกิดแล้ว grafted ภายใต้สถาบันของห้องปฏิบัติการสัตว์ทรัพยากร,
ไตแคปซูลของ athymic mices กรรมาธิการวิทยาศาสตร์สุขภาพ วิจัยแห่งชาติโดยตรงปลูก
เนื้องอกเยื่อ xenograft เทคนิคและพัฒนาสภา สหรัฐอเมริกา
ของหนูถั่วเหลืองที่ประกอบด้วยยีน HPV E6 6'7 การ
รายการเซลล์มะเร็งปากมดลูกซึ่งเซลล์ HeLa เป็นมนุษย์
พยายาม โดย inoculating HPV
รวมบรรทัดในเซลล์มะเร็งปากมดลูกซึ่งประกอบด้วย
แปลงเซลล์ปากมดลูกบรรทัด HeLa ใน dorsal ผิว-
HPV 18 กลุ่มประมาณ 10-30 สำเนา/ce118 พับหน้าต่างห้อง ดำเนินการแบบจำลองสัตว์
เซลล์มีอ่างในหน่วยความจำ (HyClone;
USA) เสริม ด้วย 10% ความร้อน - ยกเลิกครรภ์
* ผู้เขียนผู้สื่อข่าววัวเซรั่ม (HyClone สหรัฐอเมริกา), ยาเพนนิซิลลิน (50 หน่วย/m1)
โทรศัพท์: 66-2-256-4132 ต่อ 616 และ streptomycin (50 ไมโครกรัมเป็นเครื่อง/มล) มีอัตราส่วนการแบ่งของ 1:3.
โทรสาร: 66-2-252-5952
อีเมล์: [e-mail] จะมี subcultured ทุก 2-3 วันเป็นประจำถึง
328 อินเดีย J EXP BIOL, 2552 พฤษภาคม
รักษาขั้นตอนการบันทึก เซลล์ถูก trypsinized ในทีและ L1C2 TACCCTAAATACTCTGTATTG9
เดียวเซลล์ก่อนที่จะใช้ และบ้านรักษายีนของมนุษย์ที่เบต้า-globin, PC04;
HeLa-ฤทธิ์ในหนูตัวเมาส์เป็น CAACTTCATCCACGTTCACC และ GH20;
anaesthetized กับโซเดียม pentobarbital (50 mg/kg GAAGAGCCAAGGACAGGTAC 10 ไพรเมอร์ที่
น้ำหนัก ip) ใน dorsal ผิว - พับหน้าต่างซื้อจาก Invitrogen, Hong Kong A
กำหนดใน dorsal ของเมาส์แต่ละห้อง ที่สำหรับแต่ละชุดพื้นปฏิกิริยาเดียวกัน i.e.,
different จำนวนเซลล์ HeLa (2.5x10 5, 5 x 105 และ 100 มม. KC1 ตรี MgC1 2, 1.5 มม. 20 มม. 200 pM
1 x 106) มี inoculated เป็น dorsal ผิว - พับ dNTPs, 25 น.รองพื้นแต่ละ Taq 1.25 หน่วย
หน้าต่างหอ แต่ละกลุ่มประกอบด้วย 5 หนู หนูพอลิเมอเรส (Fermentas ลิทัวเนีย) และอัล 1 เอ็น
ในการควบคุม กลุ่มเฉพาะหน่วยความจำกลางที่ได้รับการ ทั้งหมดตัวอย่างในปริมาตรรวม 50 pl ขยายการ
หนูออกกำลังเป็นประจำน้ำหนักเงื่อนไขทุกสัปดาห์สำหรับมะเร็งปากมดลูก-L1 ได้ 95° C, 10 นาทีสำหรับรอบ,
อย่างต่อเนื่องจนถึงสัปดาห์ที่ 8 และสังเกตการ denaturation แล้วที่ 95° C ° C 40 หลอม 1.5, 1.5 นาที
พัฒนาเนื้องอก ขนาดของเนื้องอก โดยรวมยังเป็นนาที และทำซ้ำขยาย 72° C, 2 นาที สำหรับ
วัด รอบ 40 ตาม ด้วยนามสกุลอื่นที่° C 72, 10
videomicroscopy Intravital fluorescence ซึ่งในนาที ขนาดผลิตภัณฑ์มะเร็งปากมดลูก-L1 ได้ 250 bps สำหรับ
ศึกษาเนื้องอก angiogenesis มีเงื่อนไขขยายเบต้ามนุษย์ของ intravital fluorescence-globin
videomicroscopy ใช้ สองสัปดาห์หลัง 1 x 10 6 94° C, 10 นาทีสำหรับรอบ แล้ว denaturation ที่ 94° C, 30
HeLa inoculation หนูจะได้ราคา anaesthesized sec หลอม 62° C, 1 นาที และส่วนขยาย 68° C,
1 นาที ซ้ำสำหรับรอบ 40 ตามอีกฉีด ip ของโซเดียม pentobarbitol (50 mg/kg) A
พัฒนาโปรแกรมฐานข้อมูลถูกใส่เข้าไปในหลอดเลือดดำ jugular สำหรับส่วนขยายที่ 68 ° C สำหรับ 10 นาที ผลิตภัณฑ์เอาต์
ใช้ของ fluorescence tracers [FITC เดกซ์แทรน ขนาดของมนุษย์เบต้า-globin ได้ 268 bps ตรวจ
mol. wt = 200, 000, 0.5% (ซิกเคมี สหรัฐอเมริกา)] amplicons ที่ทำ โดย agarose electrophoresis เจ.
Microvasculature เนื้องอกถูกสังเกตภายใต้การ HPV genotyping — ดีเอ็นเอที่สกัดจากเซลล์เนื้องอก
intravital fluorescence กล้องจุลทรรศน์ (Nikon ญี่ปุ่น) ได้วิเคราะห์ความ HPV genotyping โดยมะเร็งปากมดลูก
พร้อมชุด genotyping videocamera (Sony SIT68 ญี่ปุ่น) (ลิ Inno HPV Genotyping V2;
และ วิดีโอ - บันทึก (Sony SVT - 124P ญี่ปุ่น) 10 x Irmogenetics เยอรมนี) หลักการนี้
ออปเจคทีฟเลนส์ถูกใช้ในการปฏิบัติใช้ microvessels เทคนิค hybridization ย้อน ส่วน
ภายในเนื้องอก-เรืองหอการค้า ตามถูกขยายขอบเขตของกลุ่มมะเร็งปากมดลูก 1 L และ
videoimages เนื้องอก microvascular denatured biotinylated amplicons ได้เป็นบันทึก
neocapillary ความหนาแน่นรวมถึงเครือข่ายได้ ด้วยคลิปปากตะเข้ oligonucleotide เฉพาะซึ่ง
วิเคราะห์ โดยใช้ซอฟต์แวร์ประมวลผลภาพดิจิตอลที่ตรึงเป็นเส้นขนานบนแผ่นเมมเบรน
(Global Lab II) ขั้นตอนของการทดสอบทำตามคำแนะนำ
ขนาดเนื้องอก เนื้องอกน้ำหนัก และ histopathological โดยบริษัท
สอบ — ขนาดเนื้องอกถูกประเมินโดยใช้ hybridization ใน situ ต่าง ๆ ของ HPV DNA ซึ่งอยู่
calipers (VWR, St. Louis MO) หลังจากหนูได้ของ HPV DNA ในเซลล์พบใน situ
anesthesized ด้วยการฉีดโซเดียม hybridization ใช้โพรบที่เฉพาะ HPV-16/18 ip
pentobarbitol (50 mg/kg) กว่ายาโซเดียมที่ได้จากชุดวินิจฉัย Enzo (สหรัฐอเมริกา) ใน
ใช้ pentobarbital สำหรับการุณยฆาตหนู เนื้องอกพร้อมกับชุด Dako GenPoint (เดนมาร์ก) .
มวลถูกรวบรวมอย่างละเอียดทันที น้ำหนักระบบถูกตรวจสอบเทียบเคียงใช้ tyramide
และถาวรใน formalin บัฟเฟอร์กลาง (4% formalin โปรแกรมรายงานโมเลกุลขยายจำนวน biotin
0.4% 2PO4 NaH, 0.65% Na2 HPO4) Formalin ถาวร ซึ่งช่วยผูกของ streptavidin horseradish
พาราฟิน - เนื้อเยื่อที่ฝังตัวตัวอย่างถูกตัดซับซ้อน peroxidase (HRP) 5 กรัมและ 33' diaminobenzidine
ส่วนหนาบน microtome กับใบมีดทิ้ง (เล็กน้อย) ถูกใช้เป็นพื้นผิว แล้ว เนื้อเยื่อถูก
และถาวรกับคราบ Hematoxylin และ Eosin (H&E) counterstained กับ Hematoxilin โพรโทคอลถูก
ตรวจหา HPV DNA — ส่วนเนื้อเยื่อจากปฏิบัติตามของผู้ผลิต
เนื้องอกถูกสกัดโดย Qiagen DNA สกัดแนะนำ ทดสอบนี้ได้กรุณาดำเนินการโดย
ชุด (Qiagen สหรัฐอเมริกา) ดีเอ็นเอที่แยกได้แล้วดร. Wasun Chantratita กอง
ตามสำหรับของ HPV กลุ่มโมเลกุลชเป็น ภาควิชาพยาธิวิทยา,
ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสที่ใช้เฉพาะมะเร็งปากมดลูก-L1 รพรามาธิบดี มหาวิทยาลัยมหิดล กรุงเทพมหานคร
ไพรเมอร์ L1C1 CGTAAACGTTTTCCCTATTTT - 10400 ประเทศไทย

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วารสารวิจัยชีววิทยา
ฉบับที่ 47 , พฤษภาคม 2552 อินเดีย , pp . 327-332
เมาส์มาใช้ทางผิวหนังเนื้องอก HPV - ห้อง
หน้าต่างพับมณฑล lertworapreechal สุทธิชัย patumraj2 , สมชาย niruthisard3
pokrath , hansasuta4 &ประสิทธิ์ bhattarakosor
'inter - ภาควิชาจุลชีววิทยาทางการแพทย์ บัณฑิตวิทยาลัย และหน่วยงานของ 2physiology 3gynaecology ,
4 จุลชีววิทยา คณะ ของยาจุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย , ถนน พระราม 4 กรุงเทพฯ 10330
ได้รับ 27 พฤศจิกายน 2551 ; แก้ไข 24 กุมภาพันธ์ 2552
Human papillomavirus ( HPV ) มีบทบาทสำคัญในการพัฒนาโรคมะเร็งหลายชนิด โดยเฉพาะมะเร็งปากมดลูก ใน
เพื่อให้เข้าใจรูปแบบของโรคไวรัสสัตว์ติดเชื้อ HPV เป็นสิ่งที่จำเป็น สื่อสารนี้
รายงานการจัดตั้งสัตว์แบบแบกใส่ล่าเซลล์ มนุษย์ มะเร็งปากมดลูก เซลล์เส้นผ่านทางผิวหนัง -
พับหน้าต่างห้อง หนูเปลือยถูกแบ่งออกเป็น 4 กลุ่ม แต่ละกลุ่มมีจำนวนแตกต่างกันของ Hela cells
บาท 105 , 5x10 5 และ lx106 เซลล์ , และสื่อมือถือฟรี ( การควบคุม ) , ตามลำดับ ผลการศึกษาพบว่า แม้แต่การใช้จำนวนน้อยของ Hela ( RNA ในเซลล์
5 )เนื้องอก microvasculature ถูกพัฒนาใน 2 สัปดาห์หลังจากการปลูกด้วยการขยาย
ขอบซึ่งก้าวหน้ามวลเนื้องอกเนื้องอกในสัปดาห์ต่อไปนี้ เนื้องอกที่มีอยู่เป็นที่ยืนยันว่า Hela -
ชนิดเซลล์โดยวิธี PCR ใน situ hybridization และ HPV เขต . โดยใช้การวิเคราะห์การถดถอยเชิงเส้น พบว่าวิธีการของ
ขนาดของเนื้องอกจากแต่ละกลุ่มเพิ่มขึ้นในความสัมพันธ์กับจำนวนเซลล์ Hela ใช้ ( R2 = 0.98 , Y = 0.117 1 x 4.35 ) .
รูปแบบเมาส์ นี้จะเป็นประโยชน์สำหรับการศึกษาโดยเฉพาะอย่างยิ่ง HPV ป้องกันมะเร็งยาประสิทธิภาพ .
คำสำคัญ : บนผิว - ห้องหน้าต่างพับเนื้องอก การติดเชื้อ HPV , เมาส์แบบ
มนุษย์ papillomavinis ( HPV ) เป็นเซลล์มะเร็งปากมดลูกของมนุษย์เปลือยกาย icosahedral เป็น เปลือก
,เกี่ยวกับ 8 KB วงกลมคู่ติดไวรัสดีเอ็นเอเพื่อตรวจสอบน้ำหนักของหนู papillomaviridael
ที่เป็นของครอบครัว ที่เปลี่ยนแปลงในปัจจุบัน และขนาดของเนื้องอก เนื้องอก
มากกว่า 150 แตกต่างกัน HPV ประเภทได้รับ reported2 . microvasculature ศึกษาภายใต้
ประมาณ 40 ชนิดของการติดเชื้อ HPV กับการร่วมเพศทางทวารหนัก intravital videomicroscope . นอกจากนี้
การติดเชื้อระบบทางเดิน และพวกเขาสามารถจัดเป็นความเสี่ยงสูง เช่น เนื้องอก แผลก็ยืนยันได้ถึงมวลโดย
HPV 16 , 18 , 31 , 33 , 35 ) และความเสี่ยงต่ำ ( เช่น การติดเชื้อ HPV 6 และการใช้เทคนิค PCR ใน situ hybridization และ HPV
11 ) ประเภทตามการสเปกตรัมของ ความสามารถของตนเพื่อส่งเสริมให้เกิด cancers2 .
' . ซึ่งแตกต่างจากไวรัส HPV เป็นโฮสต์ที่เฉพาะเจาะจง - สูง
,ไม่สามารถเผยแพร่ในวัสดุเพาะเลี้ยงเซลล์ปกติและวิธีการและวงจรของการใช้
สัตว์แยกย่อยหญิง balb / c-nude
หนูจากกระบวนการของคีราติโนไซต์ 2 4 . ดังนั้น การปฏิสัมพันธ์ของศูนย์สัตว์ทดลองแห่งชาติของไวรัสศาลายา
และโฮสต์จะไม่เข้าใจ ความพยายามมากมหาวิทยาลัย , มหาวิทยาลัยมหิดล
มีให้ใช้หลายวิธีเพื่อพัฒนาอายุ 4-8 สัปดาห์ และน้ำหนัก 20-25 กรัมมาใช้
สัตว์รูปแบบ เริ่มจากการฉีดวัคซีน HPV โดยตรงของสัตว์ที่ถูกจัดการตามที่แนะนำโดยคู่มือ
สกัดจากรอยโรคเพื่อมนุษย์ธรรมชาติของมนุษย์สำหรับการดูแลและการใช้สัตว์ทดลอง พ.ศ. 2539
เกิดแล้วโดยใต้หนังหุ้มปลายสถาบันทรัพยากรสัตว์ในห้องปฏิบัติการ
แคปซูลไตของหนู athymic คณะกรรมการการโดยตรงในวิทยาศาสตร์ชีวิต , เนื้องอก
วิจัยแห่งชาติเนื้อเยื่อด้วยเทคนิคอมเงินและพัฒนาแห่งสหรัฐอเมริกา
หนูดัดแปลงพันธุกรรมที่มี HPV E6 ยีน 6 ' 7 . เป็นเซลล์มะเร็งที่ปากมดลูก เซลล์ Hela บรรทัด

เป็นความพยายามของมนุษย์ได้โดยการฉีดวัคซีน HPV ที่ปากมดลูก เซลล์มะเร็งซึ่งประกอบด้วยเส้น

เปลี่ยนสายแบบเซลล์ Hela cervical ,ลงบนผิวหนัง --
hpv-18 จีโนมประมาณ 10-30 แผ่น / ce118 . ห้องพับหน้าต่าง สัตว์แบบพก
เซลล์เพาะเลี้ยงในเมมขนาดกลาง ( hyclone ;
USA ) เสริมด้วย 10% - inactivated ความร้อนของทารกในครรภ์
* นักข่าวเขียนวัว เซรั่ม ( hyclone , USA ) , ยา ( 50 หน่วย / 1 )
โทรศัพท์ : 66-2-256-4132 ; ต่อ แล้วก็เหมือนเคย ( 50 µ g / ml ) ด้วยอัตราส่วนแบ่ง 1 : 3 .

66-2-252-5952 โทรสาร :อีเมล : [e-mail] พวกเขา subcultured ทุก 2-3 วันเสมอ

แต่อินเดีย J Exp วท บ วท พฤษภาคม 2009
รักษาระยะที่เข้าสู่ระบบ เซลล์ก็ trypsinized ใน TTT และ l1c2 ; taccctaaatactctgtattg9
เซลเดี่ยวก่อนใช้ บ้านและการรักษาของยีนเบต้าโกลบินของมนุษย์ , pc04 ;
ถึงการปลูกฝังในเมาส์หนูก็ caacttcatccacgttcacc และ gh20 ;
ให้ยาสลบโดยมีโซเดียม เพน ( 50 มิลลิกรัม / กิโลกรัม gaagagccaaggacaggtac 10 ผู้ที่น้ำหนักตัวไพรเมอร์
, IP ) หลังผิว - หน้าต่างพับ ซื้อจาก Invitrogen , ฮ่องกง a
ห้องถาวรบนหลังของแต่ละเมาส์ ปฏิกิริยาของแต่ละสีชุดเดียวกัน เช่น
ยอดเงินที่แตกต่างกันของ Hela ( RNA ในเซลล์ 5 , 5x105 และ KC1 , 100 มม. หรือ 20 มม. 1.5 มม. mgc1 2 , 200 PM
1 x106 ) เชื้อหลังผิว - พับ dntps 25 น. รองพื้นแต่ละ 1.25 หน่วยหน้าต่างห้อง
แทค . แต่ละกลุ่มมี 5 หนู หนูใช้ ( fermentas , ลิทัวเนีย ) และ 1 อัลดีเอ็นเอ
ในกลุ่มควบคุมได้รับอาหารแหม่มเท่านั้น ตัวอย่างทั้งหมดในปริมาตรรวมของ 50 ต้นโดยการเพิ่ม
หนูหมั่นชั่งน้ำหนักทุกสัปดาห์ สภาพ hpv-l1 95 องศา C 10 นาทีสำหรับวงจร
อย่างต่อเนื่องจนถึง 8 สัปดาห์ ตามลำดับ สำหรับแล้ว ( ที่ 95 องศา C 1.5 นาที อบ 40 ° C , การพัฒนาเนื้องอก 1.5

ขนาดของมวลเนื้องอกยังมิน และส่วนขยาย 72 ° C 2 นาที ซ้ำสำหรับ
วัด 40 รอบ ตามด้วยนามสกุลอื่นที่ 72 ° C , 10
intravital เรืองแสง videomicroscopy สำหรับนาที hpv-l1 ผลิตภัณฑ์ขนาดทดลอง 250 bps สำหรับการศึกษาของ angiogenesis เนื้องอก
,intravital เรืองแสงมนุษย์เบตาโกลบิน , เงื่อนไข ( ถูก
videomicroscopy ถูกใช้ สองสัปดาห์หลังจาก 1 x10 6 94 ° C 10 นาทีต่อรอบ แล้ว ( ที่ 94 ° C ถึง 30
เชื้อหนูเป็น anaesthesized กับวินาที annealing 62 ° C , 1 นาที 68 ° C )
1 นาที , 40 รอบซ้ำตามมาอีก ไอพี ฉีดโซเดียม pentobarbitol ( 50 mg / kg )
เป็นคือแทรกสายสวนเส้นเลือดดำใหญ่สำหรับส่วนขยายที่ 68 ° C 10 นาทีการขยายผลิตภัณฑ์
การเรืองแสงที่ตามมา [ fitc dextran , ขนาดของเบต้าโกลบินมนุษย์เป็น 268 2007 การตรวจหา
มอล wt = 200000 0.5 % ( Sigma เคมี , USA ) ] การ amplicons โดยใช้เจลอิเล็กโตรโฟรีซิส .
เนื้องอก microvasculature พบ HPV DNA ในเขตที่สกัดจากเซลล์เนื้องอก
intravital fluorescence microscope ( Nikon , ญี่ปุ่น ) วิเคราะห์เพื่อส่งเสริมโดยใช้เชื้อ HPV
พร้อมกับวีดีโอคาเมรา ( Sony sit68 , ญี่ปุ่น ) ชุดโครงการส่งเสริมการอ่าน ( Design Report V2 ;
และวิดีโอบันทึก ( Sony svt-124p , ญี่ปุ่น ) 10x irmogenetics เยอรมนี ) หลักการนี้
เลนส์วัตถุถูกใช้เพื่อสังเกตเทคนิคเพียร์ขึ้นอยู่กับ reverse hybridization . ส่วน
ภายในเนื้องอก - แบริ่ง ห้อง อยู่บนพื้นฐานของชั้น 1 เขตของ HPV genome คือขยายและ
บันทึก videoimages , เนื้องอกของหลอดเลือดเกิดเป็นไล amplicons
เครือข่ายรวมทั้งความหนาแน่น neocapillary กับเฉพาะ ซึ่งวิธีการที่
วิเคราะห์ข้อมูลโดย ใช้ดิจิตอลซอฟต์แวร์ประมวลผลภาพที่ตรึงเป็นเส้นขนานบนแผ่นเมมเบรน
( Lab 2 ทั่วโลก ) ขั้นตอนของการทดสอบการปฏิบัติเป็นขนาดเนื้องอกแนะนำ
, น้ำหนักและขนาดของเซลล์มะเร็ง โดย บริษัท ตรวจประเมิน การใช้เวอร์เนียร์
มะเร็งใน situ hybridization ของ HPV DNA ตน
เปอร์ ( อนาคีเมีย เซนต์หลุยส์โม ) หลังจากหนูของ hpv-dna ในเซลล์ที่ตรวจพบโดยใน situ
anesthesized กับ IP การฉีดโซเดียม hybridization โดยใช้ probe ที่เฉพาะเจาะจงที่จะศึกษา / 18
pentobarbitol ( 50 mg / kg ) มีปริมาณโซเดียมที่ได้รับจาก Enzo วินิจฉัย Kit ( USA ) ใน
ไม่ใช้ขนาดที่หนูงอกร่วมกับทางหนึ่งชุด genpoint
( เดนมาร์ก )มวลคือการเก็บรวบรวมอย่างระมัดระวังทันที หนัก 7.4 ระบบตรวจจับการใช้ tyramide
และคงที่ในบัฟเฟอร์ฟอร์มาลีนเป็นกลาง ( 4% ฟอร์มาลิน นักข่าวโมเลกุลเพื่อขยายจำนวนของไบโอติน
0.4% ไม่ 2po4 , 0.65 % N hpo4 ) ฟอร์มาลินถาวร ซึ่งจะช่วยเพิ่มการเชื่อมโยงของ streptavidin .
พาราฟิน - ฝังเนื้อเยื่อที่ถูกตัดใน 5 กรัมเปอร์ออกซิเดส ( HRP ) ที่ 33 diaminobenzidine
ส่วนหนาบนเครื่องตัดชิ้นเนื้อด้วยมีดทิ้ง ( DAB ) ใช้เป็นวัตถุดิบ หลังจากนั้น เนื้อเยื่อ
และแก้ไขด้วยย้อมและ eosin ( H & E ) คราบ counterstained กับ hematoxilin . โพรโทคอลคือ
ตรวจจับ hpv-dna เนื้อเยื่อส่วนจากการปฏิบัติตามเนื้องอกของ
ผู้ผลิตถูกสกัดโดยใช้การสกัดดีเอ็นเอเพิ่มแนะนำวิธีนี้กรุณาแสดงโดย
ชุด ( เพิ่ม , USA ) สกัดดีเอ็นเอแล้ว ศาสตราจารย์ ดร. วาสุกรี , กอง
มุ่งมั่นสำหรับการปรากฏตัวของ HPV genome โดยไวรัสวิทยาโมเลกุล ภาควิชาพยาธิวิทยา
การใช้ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส โดยใช้ hpv-l1 เฉพาะคณะแพทยศาสตร์โรงพยาบาลรามาธิบดี มหาวิทยาลัยมหิดล
ไพรเมอร์ l1c1 ; cgtaaacgttttccctatttt - 10400