2.3.2. DNA analysis by comet assayT

2.3.2. DNA analysis by comet assay

The DNA strand breaks were detected with comet assay. The comet assay was applied with several modifications as previously described by Singh et al. (1988) and Collins et al. (1997). Conventional end-frosted slides were pre-coated with 1% normal melting agarose and allowed to dry overnight. Cells were re-suspended in PBS at a concentration of 1 × 106 cells/ml. Forty microliters of this suspension were mixed with 140 μl of 0.6% pre-warmed (37 °C) low melting point agarose and two drops of 70 μl of this mixture were placed on a microscope slide. A cover slip (24 × 60 mm) was put on the drops and the gels were allowed to solidify for 5 min at 4 °C. All steps were performed under minimal yellow light at working room temperature adjusted to 22 °C ± 2. Once the gels had become solidified, the cover slip was removed and the slides were dipped into freshly prepared lysis solution jars at 4 °C (2.5 M NaCl, 0.1 M disodium EDTA and 0.01 M Trizma base, pH = 10.5. Triton X-100 1% and DMSO 10% added just before use, for a minimum of 1 h at 4 °C) for at least 1 h. The positive control slide cells was dipped into H2O2 (50 and 100 μM in PBS) solution for 5 min at 4 °C, then washed with cold PBS and introduced into a lysis solution in a separate jar for at least 1 h at 4 °C. After lysis, slides were aligned in a horizontal gel electrophoresis tank (CSL-COM20, Cleaver Scientific, UK) connected to recirculating cooler (FL300, Julabo, Germany) set at 4 °C filled with freshly made alkaline electrophoresis solution (300 mM NaOH, 1 mM disodium EDTA, pH > 13) to a level of 0.25 cm over the slides. Slides were equilibrated and DNA was allowed to unwind for 40 min in the alkaline solution and electrophoresis (CS-300V, Cleaver Scientific, UK) was then carried out at approximately 1 V/cm for 20 min. After electrophoresis, the slides were washed two times for 10 min. with neutralizing buffer (0.4 M Tris-HCl buffer, pH 7.5). After washing, the slides were fixed with 50%, 75% and 90% ethanol (for 5 min each) then they were allowed to dry at room temperature prior to staining with 70 μl of ethidium bromide solution (20 μg/ml).

For visualization of DNA damage, slides were examined at 400-fold magnification under fluorescence microscope (DM3000, Leica, Germany). Measurements of tail intensity and tail moment of ‘comets’ were made by a computer-based image analysis system (Comet Assay IV, Perceptive Instruments, UK) for 100 randomly selected cells, i.e. 50 cells from each of two gels from each sample. Scoring was performed by moving the slide in a zig-zag motion to avoid scoring the same cells twice. % Tail DNA and Mean Tail Moment parameters were used to assess the DNA damage. % Tail DNA was defined as the percentage of DNA that had migrated from the head of the comet into the tail. Mean Tail Moment was defined as the product of the proportion of tail intensity and the displacement of tail center of mass relative to the centre of the head (Olive et al., 1992). The mean value of these parameters was calculated and used for the evaluation of DNA damage.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.3.2 การวิเคราะห์ DNA โดยวิเคราะห์ดาวหางThe DNA strand breaks were detected with comet assay. The comet assay was applied with several modifications as previously described by Singh et al. (1988) and Collins et al. (1997). Conventional end-frosted slides were pre-coated with 1% normal melting agarose and allowed to dry overnight. Cells were re-suspended in PBS at a concentration of 1 × 106 cells/ml. Forty microliters of this suspension were mixed with 140 μl of 0.6% pre-warmed (37 °C) low melting point agarose and two drops of 70 μl of this mixture were placed on a microscope slide. A cover slip (24 × 60 mm) was put on the drops and the gels were allowed to solidify for 5 min at 4 °C. All steps were performed under minimal yellow light at working room temperature adjusted to 22 °C ± 2. Once the gels had become solidified, the cover slip was removed and the slides were dipped into freshly prepared lysis solution jars at 4 °C (2.5 M NaCl, 0.1 M disodium EDTA and 0.01 M Trizma base, pH = 10.5. Triton X-100 1% and DMSO 10% added just before use, for a minimum of 1 h at 4 °C) for at least 1 h. The positive control slide cells was dipped into H2O2 (50 and 100 μM in PBS) solution for 5 min at 4 °C, then washed with cold PBS and introduced into a lysis solution in a separate jar for at least 1 h at 4 °C. After lysis, slides were aligned in a horizontal gel electrophoresis tank (CSL-COM20, Cleaver Scientific, UK) connected to recirculating cooler (FL300, Julabo, Germany) set at 4 °C filled with freshly made alkaline electrophoresis solution (300 mM NaOH, 1 mM disodium EDTA, pH > 13) to a level of 0.25 cm over the slides. Slides were equilibrated and DNA was allowed to unwind for 40 min in the alkaline solution and electrophoresis (CS-300V, Cleaver Scientific, UK) was then carried out at approximately 1 V/cm for 20 min. After electrophoresis, the slides were washed two times for 10 min. with neutralizing buffer (0.4 M Tris-HCl buffer, pH 7.5). After washing, the slides were fixed with 50%, 75% and 90% ethanol (for 5 min each) then they were allowed to dry at room temperature prior to staining with 70 μl of ethidium bromide solution (20 μg/ml).For visualization of DNA damage, slides were examined at 400-fold magnification under fluorescence microscope (DM3000, Leica, Germany). Measurements of tail intensity and tail moment of ‘comets’ were made by a computer-based image analysis system (Comet Assay IV, Perceptive Instruments, UK) for 100 randomly selected cells, i.e. 50 cells from each of two gels from each sample. Scoring was performed by moving the slide in a zig-zag motion to avoid scoring the same cells twice. % Tail DNA and Mean Tail Moment parameters were used to assess the DNA damage. % Tail DNA was defined as the percentage of DNA that had migrated from the head of the comet into the tail. Mean Tail Moment was defined as the product of the proportion of tail intensity and the displacement of tail center of mass relative to the centre of the head (Olive et al., 1992). The mean value of these parameters was calculated and used for the evaluation of DNA damage.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.3.2 การวิเคราะห์ดีเอ็นเอด้วยวิธีดาวหางแบ่งดีเอ็นเอที่ตรวจพบมีการทดสอบดาวหาง การทดสอบดาวหางถูกนำมาใช้กับการปรับเปลี่ยนหลายตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้โดยซิงห์และอัล (1988) และคอลลินและอัล (1997) สไลด์ปลายน้ำค้างแข็งธรรมดาก่อนถูกเคลือบด้วยละลายปกติ 1% agarose และได้รับอนุญาตให้แห้งในชั่วข้ามคืน เซลล์ที่ถูกระงับอีกครั้งในพีบีเอสที่ความเข้มข้น 1 × 106 เซลล์ / มิลลิลิตร สี่สิบ microliters ของการระงับนี้ผสมกับ 140 ไมโครลิตร 0.6% ก่อนอุ่น (37 ° C) จุดหลอมเหลวต่ำ agarose และสองหยด 70 ไมโครลิตรของส่วนผสมนี้ถูกวางไว้บนสไลด์กล้องจุลทรรศน์ ลื่นปก (24 × 60 มิลลิเมตร) ที่วางอยู่บนหยดและเจลได้รับอนุญาตให้แข็งเป็นเวลา 5 นาทีที่ 4 ° C ทุกขั้นตอนได้ดำเนินการภายใต้แสงไฟสีเหลืองน้อยที่สุดที่อุณหภูมิห้องทำงานปรับถึง 22 ° C ± 2 เมื่อเจลได้กลายเป็นผลึกใบปกจะถูกลบออกและภาพนิ่งถูกจุ่มลงไปในขวดสลายการแก้ปัญหาที่ปรุงสดใหม่ที่ 4 ° C (2.5 ล้าน โซเดียมคลอไรด์ 0.1 M EDTA disodium และ 0.01 M ฐาน Trizma ค่า pH = 10.5. Triton X-100 1% และ 10% DMSO เพิ่มเพียงก่อนการใช้งานเป็นเวลาอย่างน้อย 1 ชั่วโมงที่ 4 ° C) เป็นเวลาอย่างน้อย 1 ชั่วโมง การควบคุมบวกเซลล์สไลด์ถูกจุ่มลงไปใน H2O2 (50 และ 100 ไมครอนในพีบีเอส) สำหรับ 5 นาทีที่ 4 ° C ล้างแล้วกับพีบีเอสที่หนาวเย็นและนำเข้าสู่การแก้ปัญหาสลายในขวดที่แยกจากกันเป็นเวลาอย่างน้อย 1 ชั่วโมงที่ 4 ° C . หลังจากที่สลายสไลด์ถูกจัดชิดในถังข่าวคราวแนวนอน (CSL-COM20, ตวิทยาศาสตร์สหราชอาณาจักร) เชื่อมต่อกับหมุนเวียนเย็น (FL300, Julabo, เยอรมนี) ตั้งไว้ที่ 4 องศาเซลเซียสเต็มไปด้วยความสดใหม่แก้ปัญหาอิอัลคาไลน์ (300 มิลลิ NaOH, 1 มิลลิ disodium EDTA, ค่า pH> 13) ไปที่ระดับ 0.25 ซมมากกว่าภาพนิ่งที่ ภาพนิ่งถูก equilibrated และ DNA ได้รับอนุญาตให้ผ่อนคลาย 40 นาทีในสารละลายด่างและ electrophoresis (CS-300V, ตวิทยาศาสตร์สหราชอาณาจักร) จากนั้นก็ดำเนินการประมาณ 1 V / cm สำหรับ 20 นาที หลังจากที่อิสไลด์ถูกล้างสองครั้งเป็นเวลา 10 นาที กับ neutralizing บัฟเฟอร์ (0.4 M บัฟเฟอร์ Tris-HCl, pH 7.5) หลังจากล้างภาพนิ่งได้รับการแก้ไข 50%, 75% และเอทานอล 90% (เป็นเวลา 5 นาทีในแต่ละ) แล้วพวกเขาก็จะได้รับอนุญาตให้แห้งที่อุณหภูมิห้องก่อนที่จะมีการย้อมสี 70 ไมโครลิตรของ ethidium แก้ปัญหาโบรไมด์ (20 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร). สำหรับ การสร้างภาพของความเสียหายของดีเอ็นเอภาพนิ่งมีการตรวจสอบที่กำลังขยาย 400 เท่าภายใต้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง (DM3000, Leica, เยอรมนี) การวัดความเข้มของหางและช่วงเวลาที่หางของดาวหาง 'ถูกสร้างขึ้นมาโดยระบบการวิเคราะห์ภาพคอมพิวเตอร์ที่ใช้ (ดาวหาง Assay IV, เฉลียวเครื่องมือสหราชอาณาจักร) 100 เซลล์สุ่มเลือกคือ 50 เซลล์จากแต่ละสองเจลจากแต่ละตัวอย่าง เกณฑ์การให้คะแนนที่ได้ดำเนินการโดยการเลื่อนสไลด์ในการเคลื่อนไหวซิกแซกเพื่อหลีกเลี่ยงการให้คะแนนเซลล์เดียวกันสองครั้ง % ดีเอ็นเอหางและพารามิเตอร์หมายถึงช่วงเวลาที่หางถูกนำมาใช้เพื่อประเมินความเสียหายดีเอ็นเอ % ดีเอ็นเอหางถูกกำหนดเป็นอัตราร้อยละของดีเอ็นเอที่ได้อพยพมาจากหัวของดาวหางเข้าสู่หาง หมายถึงช่วงเวลาที่หางถูกกำหนดเป็นผลิตภัณฑ์จากสัดส่วนของความเข้มหางและการกำจัดของศูนย์หางของญาติจำนวนมากไปยังศูนย์กลางของหัว (มะกอก et al., 1992) ค่าเฉลี่ยของพารามิเตอร์เหล่านี้ที่คำนวณได้และใช้สำหรับการประเมินผลของความเสียหายของดีเอ็นเอ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.3.2 . การวิเคราะห์ดีเอ็นเอ โดยดาวหางวิเคราะห์

ตรวจพบดีเอ็นเอเกลียวเชือกแบ่งกับดาวหาง ตามลำดับ ดาวหาง ( ที่ใช้กับการปรับเปลี่ยนหลายที่อธิบายไว้ก่อนหน้าโดย Singh et al . ( 1988 ) และคอลลินส์ et al . ( 1997 ) จบแบบสไลด์เป็นฝ้าก่อนเคลือบด้วย 1% ปกติละลาย , อนุญาตให้แห้งข้ามคืน เซลล์ก็จะถูกระงับใน PBS ที่ความเข้มข้น 1 × 106 เซลล์ / มิลลิลิตร2.3.2 . การวิเคราะห์ดีเอ็นเอ โดยดาวหางวิเคราะห์

ตรวจพบดีเอ็นเอเกลียวเชือกแบ่งกับดาวหาง ตามลำดับ ดาวหาง ( ที่ใช้กับการปรับเปลี่ยนหลายที่อธิบายไว้ก่อนหน้าโดย Singh et al . ( 1988 ) และคอลลินส์ et al . ( 1997 ) จบแบบสไลด์เป็นฝ้าก่อนเคลือบด้วย 1% ปกติละลาย , อนุญาตให้แห้งข้ามคืน เซลล์ก็จะถูกระงับใน PBS ที่ความเข้มข้น 1 × 106 เซลล์ / มิลลิลิตร2.3.2 . การวิเคราะห์ดีเอ็นเอ โดยดาวหางวิเคราะห์

ตรวจพบดีเอ็นเอเกลียวเชือกแบ่งกับดาวหาง ตามลำดับ ดาวหาง ( ที่ใช้กับการปรับเปลี่ยนหลายที่อธิบายไว้ก่อนหน้าโดย Singh et al . ( 1988 ) และคอลลินส์ et al . ( 1997 ) จบแบบสไลด์เป็นฝ้าก่อนเคลือบด้วย 1% ปกติละลาย , อนุญาตให้แห้งข้ามคืน เซลล์ก็จะถูกระงับใน PBS ที่ความเข้มข้น 1 × 106 เซลล์ / มิลลิลิตร2.3.2 . การวิเคราะห์ดีเอ็นเอ โดยดาวหางวิเคราะห์

ตรวจพบดีเอ็นเอเกลียวเชือกแบ่งกับดาวหาง ตามลำดับ ดาวหาง ( ที่ใช้กับการปรับเปลี่ยนหลายที่อธิบายไว้ก่อนหน้าโดย Singh et al . ( 1988 ) และคอลลินส์ et al . ( 1997 ) จบแบบสไลด์เป็นฝ้าก่อนเคลือบด้วย 1% ปกติละลาย , อนุญาตให้แห้งข้ามคืน เซลล์ก็จะถูกระงับใน PBS ที่ความเข้มข้น 1 × 106 เซลล์ / มิลลิลิตร2.3.2 . การวิเคราะห์ดีเอ็นเอ โดยดาวหางวิเคราะห์

ตรวจพบดีเอ็นเอเกลียวเชือกแบ่งกับดาวหาง ตามลำดับ ดาวหาง ( ที่ใช้กับการปรับเปลี่ยนหลายที่อธิบายไว้ก่อนหน้าโดย Singh et al . ( 1988 ) และคอลลินส์ et al . ( 1997 ) จบแบบสไลด์เป็นฝ้าก่อนเคลือบด้วย 1% ปกติละลาย , อนุญาตให้แห้งข้ามคืน เซลล์ก็จะถูกระงับใน PBS ที่ความเข้มข้น 1 × 106 เซลล์ / มิลลิลิตร2.3.2 . การวิเคราะห์ดีเอ็นเอ โดยดาวหางวิเคราะห์

ตรวจพบดีเอ็นเอเกลียวเชือกแบ่งกับดาวหาง ตามลำดับ ดาวหาง ( ที่ใช้กับการปรับเปลี่ยนหลายที่อธิบายไว้ก่อนหน้าโดย Singh et al . ( 1988 ) และคอลลินส์ et al . ( 1997 ) จบแบบสไลด์เป็นฝ้าก่อนเคลือบด้วย 1% ปกติละลาย , อนุญาตให้แห้งข้ามคืน เซลล์ก็จะถูกระงับใน PBS ที่ความเข้มข้น 1 × 106 เซลล์ / มิลลิลิตร2.3.2 . การวิเคราะห์ดีเอ็นเอ โดยดาวหางวิเคราะห์

ตรวจพบดีเอ็นเอเกลียวเชือกแบ่งกับดาวหาง ตามลำดับ ดาวหาง ( ที่ใช้กับการปรับเปลี่ยนหลายที่อธิบายไว้ก่อนหน้าโดย Singh et al . ( 1988 ) และคอลลินส์ et al . ( 1997 ) จบแบบสไลด์เป็นฝ้าก่อนเคลือบด้วย 1% ปกติละลาย , อนุญาตให้แห้งข้ามคืน เซลล์ก็จะถูกระงับใน PBS ที่ความเข้มข้น 1 × 106 เซลล์ / มิลลิลิตร2.3.2 . การวิเคราะห์ดีเอ็นเอ โดยดาวหางวิเคราะห์

ตรวจพบดีเอ็นเอเกลียวเชือกแบ่งกับดาวหาง ตามลำดับ ดาวหาง ( ที่ใช้กับการปรับเปลี่ยนหลายที่อธิบายไว้ก่อนหน้าโดย Singh et al . ( 1988 ) และคอลลินส์ et al . ( 1997 ) จบแบบสไลด์เป็นฝ้าก่อนเคลือบด้วย 1% ปกติละลาย , อนุญาตให้แห้งข้ามคืน เซลล์ก็จะถูกระงับใน PBS ที่ความเข้มข้น 1 × 106 เซลล์ / มิลลิลิตร2.3.2 . การวิเคราะห์ดีเอ็นเอ โดยดาวหางวิเคราะห์

ตรวจพบดีเอ็นเอเกลียวเชือกแบ่งกับดาวหาง ตามลำดับ ดาวหาง ( ที่ใช้กับการปรับเปลี่ยนหลายที่อธิบายไว้ก่อนหน้าโดย Singh et al . ( 1988 ) และคอลลินส์ et al . ( 1997 ) จบแบบสไลด์เป็นฝ้าก่อนเคลือบด้วย 1% ปกติละลาย , อนุญาตให้แห้งข้ามคืน เซลล์ก็จะถูกระงับใน PBS ที่ความเข้มข้น 1 × 106 เซลล์ / มิลลิลิตร