2.6. Influenza A viruses for the em

2.6. Influenza A viruses for the empirical test and multiplex RT-PCR

For the empirical RT-PCR tests for the selected primer sets, the following 46 viral samples, which cover a wide range of periods and geographical regions, were prepared: 16 avian (H1–H16), 9 human, 8 swine, 9 equine, and 4 canine influenza viruses (for virus information, see Appendix Table 1). For the test, the 46 reference viruses were propagated in10-day-old embryo specific pathogen free (SPF) chicken eggs (VALO, Maryland, USA), and three days after, their allantoic fluid was harvested. RNA extraction was carried out manually from the allantoic fluids using an RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, California, USA) according to the manufacturer instructions.

The RT-PCR assays were performed with a commercial kit in a one-step protocol, AccuPower® RocketPlex RT-PCR PreMix (Bioneer Corp., South Korea). It was performed in a 20 μL volume, in which the reaction mixture contained 3–4 μL of RNAs, 3–4 μL of multiple primer mixturepairs(each 10 pmol/μL) and 12–14 μL of RNase-Free Water (Welgene, South Korea). Each RT-PCR was carried out in a Biometra T3000 thermal cycler (Biometra, Westburg, Netherlands). The reaction temperature and time for the reverse transcription phase was set at 50 °C for 30 min. Sequentially, PCR cycling protocols consisted of initial denaturing at 95 °C for 5 min; 30 cycles of denaturing at 95 °C for 30 s and annealing at 55 °C for 30 s, followed by an extension at 72 °C for 30 s; and a final extension step at 72 °C for 5 min. PCR products were run in a 1 ∼ 1.5% SeaKem LE agarose gel (Lonza, Rockland ME, USA) and stained with RedSafe™ Nucleic Acid Staining Solution (20,000x, iNtRon Biotechnology, Seongnam, South Korea) in 0.5X TAE buffer.

The diagnostic performance of the primers was evaluated with each primer pair and eight sets amplifying four segment combinations using the prepared viral samples. The specificity of the RT-PCR was evaluated by examining the amplified product sizes of the EIV genome segments (Table 1).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.6. ไข้หวัดใหญ่ไวรัสที่ค่าทดสอบ และล็กซ์ RT-PCRสำหรับการทดสอบเชิงประจักษ์ของ RT-PCR รองพื้นเลือก ชุด ตัวอย่างต่อไปนี้ 46 ไวรัส ซึ่งครอบคลุมระยะเวลาและขอบเขตทางภูมิศาสตร์หลากหลาย มีเตรียม: 16 นก (H1 – ผม H16), 9 คน หมู 8, 9 ม้า และไวรัสไข้หวัดใหญ่สุนัข 4 (สำหรับข้อมูลไวรัส ดูภาคผนวกตารางที่ 1) สำหรับการทดสอบ การอ้างอิงที่ 46 ถูกไวรัสแพร่กระจาย in10 วันเก่าอ่อนเชื้อเฉพาะฟรี (SPF) ไข่ไก่ (VALO แมรี่แลนด์ สหรัฐอเมริกา), และวันที่สามหลัง ของเหลว allantoic ถูกเก็บเกี่ยว สกัด RNA ดำเนินการด้วยตนเองจากสาร allantoic ที่ใช้โดยใช้การ RNeasy มินิชุด (Qiagen, Valencia แคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา) ตามคำแนะนำของผู้ผลิตAssays RT-PCR ได้ดำเนิน ด้วยชุดเชิงพาณิชย์ในโพรโทคอขั้น พรีมิกซ์ RT-PCR AccuPower ® RocketPlex (Bioneer Corp. เกาหลีใต้) ทำในไดรฟ์ข้อมูล 20 μL ที่ผสมปฏิกิริยาอยู่ 3-4 μL ของ RNAs, μL 3-4 ของหลายรองพื้น mixturepairs (แต่ละ 10 pmol/μL) และ 12 – 14 μL น้ำฟรี RNase (Welgene เกาหลีใต้) RT-PCR แต่ละถูกดำเนินการในความร้อน cycler Biometra T3000 (Biometra, Westburg เนเธอร์แลนด์) ปฏิกิริยาอุณหภูมิและเวลาสำหรับขั้นตอนการถอดรหัสย้อนกลับถูกตั้งค่าที่ 50 ° C 30 นาทีตามลำดับ โปรโตคอจักรยาน PCR ประกอบ denaturing เริ่มต้นที่ 95 ° C 5 นาที รอบ 30 denaturing 95 ° c 30 s และการหลอมที่อุณหภูมิ 55 ° C 30 s ตาม ด้วยนามสกุล 72 ° c 30 s และขั้นตอนสุดท้ายขยาย 72 ° c 5 นาทีผลิตภัณฑ์ PCR ถูกเรียกใช้ใน 1 เดือน 1.5% เจ agarose เลอ SeaKem (Lonza รอคแลนด์ ME สหรัฐอเมริกา) และย้อมสี ด้วย RedSafe ™กรดนิวคลีอิกย้อมสี (20, 000 x เทคโนโลยีชีวภาพ นัม iNtRon เกาหลี) ในบัฟเฟอร์ X TAE 0.5การวินิจฉัยของไพรเมอร์ที่รับการประเมินแต่ละคู่ไพรเมอร์ และแปดชุดชุดสี่ส่วนขยายตัวอย่างไวรัสที่เตรียมโดยใช้ ความของ RT-PCR ถูกประเมิน โดยการตรวจสอบขนาดของผลิตภัณฑ์ภาคขยายของส่วนพันธุ EIV (ตารางที่ 1)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.6 ไข้หวัดใหญ่ไวรัสสำหรับการทดสอบเชิงประจักษ์และ multiplex RT-PCR สำหรับการทดสอบเชิงประจักษ์ RT-PCR สำหรับชุดไพรเมอร์ที่เลือกต่อไปนี้ 46 ตัวอย่างเชื้อไวรัสซึ่งครอบคลุมหลากหลายของระยะเวลาและพื้นที่ทางภูมิศาสตร์ที่ถูกจัดทำขึ้น: 16 นก (H1- H16), 9 มนุษย์ 8 สุกรม้า 9 และ 4 ไวรัสไข้หวัดใหญ่สุนัข (สำหรับข้อมูลไวรัสดูที่ภาคผนวกตารางที่ 1) สำหรับการทดสอบไวรัสอ้างอิง 46 ถูกแพร่กระจาย IN10 วันเก่าตัวอ่อนเฉพาะเชื้อโรคฟรี (SPF) ไข่ไก่ (องอาจ, Maryland, USA) และสามวันหลังจากของเหลว allantoic ของพวกเขาได้รับการเก็บเกี่ยว การสกัดอาร์เอ็นเอได้ดำเนินการด้วยตนเองจากของเหลว allantoic ใช้ชุด RNeasy มินิ (Qiagen, วาเลนเซีย, California, USA) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต. ตรวจ RT-PCR ได้ดำเนินการกับชุดในเชิงพาณิชย์ในโปรโตคอลขั้นตอนเดียว, AccuPower® RocketPlex RT-PCR พรีมิกซ์ (Bioneer คอร์ปเกาหลีใต้) มันได้รับการดำเนินการในปริมาณ 20 ไมโครลิตรซึ่งผสมปฏิกิริยาที่มีอยู่ 3-4 ไมโครลิตรของ RNAs 3-4 ไมโครลิตรของ mixturepairs ไพรเมอร์หลาย ๆ (ละ 10 pmol / ไมโครลิตร) และวันที่ 12-14 ไมโครลิตรของ RNase ฟรีน้ำ (Welgene, เกาหลีใต้). แต่ละ RT-PCR ได้ดำเนินการในการระบายความร้อน Cycler Biometra T3000 (Biometra, Westburg, เนเธอร์แลนด์) อุณหภูมิปฏิกิริยาและเวลาสำหรับขั้นตอนการถอดรหัสแบบย้อนกลับถูกกำหนดไว้ที่ 50 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 นาที ลำดับ PCR โปรโตคอลการขี่จักรยานประกอบด้วยขั้นเปลี่ยนเริ่มต้นที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที; 30 รอบของ denaturing ที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาทีและการอบที่ 55 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาทีตามด้วยนามสกุลที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาที; และขั้นตอนสุดท้ายส่วนขยายที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที ผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ได้รับการทำงานใน 1 ~ 1.5% SeaKem LE agarose เจล (Lonza, ร็อกแลนด์ ME, USA) และย้อมด้วยสี RedSafe ™นิวคลีอิกกรดย้อมสีโซลูชัน (20,000x, intron เทคโนโลยีชีวภาพ, ซอง, เกาหลีใต้) ใน 0.5 เท่า TAE บัฟเฟอร์. ประสิทธิภาพการวินิจฉัยของไพรเมอร์ได้รับการประเมินกับแต่ละคู่ไพรเมอร์และแปดชุดขยายรวมกันสี่ส่วนโดยใช้ตัวอย่างไวรัสที่เตรียมไว้ ความจำเพาะของ RT-PCR ถูกประเมินโดยการตรวจสอบขนาดสินค้าขยายในกลุ่ม EIV จีโนม (ตารางที่ 1)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.6 ไข้หวัดใหญ่ไวรัสสำหรับการทดสอบเชิงประจักษ์และ multiplex RT-PCRสำหรับการทดสอบนี้เชิงประจักษ์เพื่อเลือกรองพื้นชุด 46 ตัวอย่างไวรัสต่อไปนี้ซึ่งครอบคลุมช่วงกว้างของระยะเวลาและภูมิภาคเตรียม : 16 ( H1 ) นกี่ ) , 9 คน 9 ม้า 8 สุกร และไข้หวัดใหญ่ 4 เขี้ยว ( สำหรับรายละเอียดไวรัสดูภาคผนวก ตาราง 1 ) สำหรับการทดสอบ 46 อ้างอิงไวรัสไป 10 วัน อายุตัวอ่อนเฉพาะปลอดโรค ( SPF ) ไข่ไก่ ( ไลท์ , Maryland , USA ) , และสามวันหลังจากนั้น ของเหลว allantoic ของพวกเขาคือการเก็บเกี่ยว การสกัดอาร์เอ็นเอได้ดำเนินการด้วยตนเองจากของเหลว allantoic โดยใช้ชุดมินิ rneasy ( QIAGEN , Valencia , California , USA ) ตามที่ผู้ผลิตแนะนำวิธี RT-PCR แสดงกับชุดเชิงพาณิชย์ในขั้นตอนหนึ่งขั้นตอน accupower ® rocketplex RT-PCR พรีมิกซ์ ( bioneer Corp . เกาหลี มันแสดงใน 20 μ L ปริมาณซึ่งในปฏิกิริยาของส่วนผสมที่มีอยู่ 3 – 4 μ l RNAs 3 – 4 μ l mixturepairs รองพื้นหลายละ 10 pmol / μ L ) และ 12 – 14 μลิตรน้ำเลสฟรี ( welgene , เกาหลีใต้ ) แต่ละวิธี RT-PCR ) ได้ทำการศึกษาใน biometra t3000 Thermal cycler ( biometra westburg , เนเธอร์แลนด์ ) อุณหภูมิและเวลากลับเฟส ถอดความไว้ที่ 50 ° C เป็นเวลา 30 นาที เป็นโปรโตคอลจักรยาน PCR ประกอบด้วยเริ่มต้นี่ 95 °องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที ; 30 รอบี่ 95 องศา C เป็นเวลา 30 วินาทีและอบอ่อนที่อุณหภูมิ 55 องศา C เป็นเวลา 30 วินาที ตามด้วยส่วนขยายที่ 72 เมตร C เป็นเวลา 30 วินาที และสุดท้ายการก้าวที่ 72 ° C เป็นเวลา 5 นาที โดยผลิตภัณฑ์ถูกใช้ใน 1 ∼ 1.5% seakem เลอเจล ( Power รอกผม , USA ) และย้อมด้วย redsafe ™กรดนิวคลีอิกวิธีการแก้ปัญหา ( 20000x iNtRON เทคโนโลยีชีวภาพ นัม เกาหลีใต้ ( แท ) ในบัฟเฟอร์ประสิทธิภาพการวินิจฉัยของไพรเมอร์ถูกประเมินแต่ละคู่ไพรเมอร์และแปดชุดสี่ส่วนผสมที่ใช้เตรียมขยายไวรัสตัวอย่าง ความจำเพาะของวิธีประเมินโดยการขยายขนาดของผลิตภัณฑ์ของ eiv จีโนมกลุ่ม ( ตารางที่ 1 )