and test compound (substrate). The

and test compound (substrate). The first control flask contained
only fungal culture, and the second contained fungal medium
(without fungal culture) along with substrate. Substrate was incubated
in four flasks containing fully grown fungal cultures. Every
4th day a sample of each flask was removed, filtered, and extracted
with dichloromethane. The solvent was evaporated and degree of
transformation was compared to controls on TLC. After 12 days
of incubation, a number of transformation were observed through
TLC analysis, during small scale screening. Therefore, the experiment
continued toward preparative scale.
Five liters of culture medium was prepared and transferred to
50 Erlenmeyer flasks of 250 mL (each flask containing 100 mL of
medium), and autoclaved at 121 C. Flasks were inoculated with
fungal culture and placed on a shaker (121 rpm) at 26 ± 2 C for
incubation. When suitable growth was observed, 500 mg of substrate
1 was dissolved in 50 mL of acetone, evenly distributed over
50 flasks and then left on a rotary shaker for 12 days at 26 C. After
12 days, contents of all flasks were combined, fungal cultures were
filtered, and the aqueous layer was extracted with dichloromethane
(18 L). The extraction process was repeated three times.
The organic layer was made moisture free with anhydrous sodium
sulfate and concentrated over reduced pressure rotary evaporator.
This resulted a gum like material. A comparative TLC of small scale
and large scale experiments were checked, and similar spots were
observed. The gum was fractionated over silica gel column chromatography
by using hexanes-acetone as mobile phase. Four main
fractions (1–4) were obtained as a result of column chromatography.
Further purification of metabolites was carried out by using
reverse phase preparative HPLC equipped with L-80 column.
Compound 2 (methanol:water; 70:30, tR = 22 min) was obtained
from fraction-1 through reverse phase recycling HPLC. Compound
3 (methanol:water; 70:30, tR = 20 min) was purified from fraction-2
with reversed phase HPLC. Similarly, fraction-3 yielded
metabolite 4 (methanol:water; 70:30, tR = 21 min) on purification
with reversed phase HPLC. Whereas, metabolite 5 (methanol:
water; 70:30, tR = 21 min) was isolated from fraction-4 through
reverse phase recycling HPLC by using methanol–water as a solvent
system. During purification of metabolites, we also recovered
some unconsumed danazol (1) along with several minor transformed
products, which we could not purified due to their very
low quantities.
2.3.1. 14b,17b-Dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-17a-pregn-4-en-20-yn-
3-one (2)
White solid; m. p. 228–230 C; % yield: 1%; ½a
25
D = 49.3 (c 0.01,
MeOH); UV (MeOH): kmax (loge) = 230 nm (3.1), 248 nm (3.0); IR
(CHCl3): tmax 3281 cm
1 (OAH), 1670 cm
1 (enone); HREI-MS
m/z 358.2152 [M]+ (mol. Formula, C22H31O4, calcd. 358.2144); 1
H
NMR (CD3OD, 500 MHz); Table 1; 13C NMR (CD3OD, 150 MHz);
Table 2.
2.3.2. 1a,17b-Dihydroxy-17a-pregna-2,4-dien-20-yno-[2,3-d]-
isoxazole (3)
White solid; m. p. 231–233 C; % yield: 1.2%; ½a
25
D =
144.6
(c 0.025, MeOH); UV (MeOH): kmax (loge) = 278 nm (2.8); IR
(CHCl3): tmax 3414 (OAH), 1624 cm
1 (C@C); HREI-MS m/z
353.1974 [M]+ (mol. Formula C22H27NO3, calcd. 353.1991); 1
H
NMR (CD3OD, 500 MHz) Table 1; 13C NMR (CD3OD, 150 MHz)
Table 2.
2.3.3. 6b,17b-Dihydroxy-17a-pregna-2,4-dien-20-yno-[2,3-d]-
isoxazole (4)
White solid; m. p. 232–234 C; % yield: 0.8%; ½a
25
D =
67.5 (c
0.008, MeOH); UV (MeOH): kmax (loge) = 286 nm (2.9); IR (KBr);
tmax 3400 (OAH s), 1625 (C@C); HREI-MS m/z 353.2000 [M]+
,
(mol. formula, C22H27NO3, calcd. 353.1991); 1
H NMR (CD3OD,
300 MHz) Table 1; 13C NMR (CD3OD, 150 MHz) Table 2.
2.3.4. 17b-Hydroxy-2-(hydroxymethyl)-17a-pregn-1,4-dien-20-yn-3-
one (5)
White solid; m. p. 224–226 C; % yield: 1.2; ½a
25
D =
69.0 (c 0.01,
MeOH); UV (MeOH): kmax (loge) = 248 nm (4.2); IR (CHCl3): tmax
3305 (OAH), 1663, and 1619 cm
1 (cross conjugated enone);
HRESI-MS m/z 340.2042 [M + H]+ (mol. formula, C22H28O3, calcd.
340.2038); 1
H NMR (CD3OD, 500 MHz); Table 1; 13C NMR (CD3OD,
125 MHz); Table 2.
2.4. Experimental protocol for cytotoxicity assay
MTT (3-[4,5-dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium
bromide) colorimetric method was used for cytotoxicity evaluation
against a human cervical carcinoma (HeLa) cell line. The cells
(105 cells/mL) were grown in tissue culture flask using Minimum
Essential Eagle’s Medium (MEM), supplemented with fetal bovine
serum (FBS, 5%), penicillin (100 IU/ mL) and streptomycin
(100 lg/mL). The cells were then plated onto 96-well plates in
the concentration of 100 lL/well, and incubated overnight in 5%
CO2 incubator at 37 C. The next day medium was replaced with
the freshly prepared 200 lL medium, along with different concentrations
of test compounds (1–50 lM). The 96-well plate was again
incubated for 72 h. After incubation, 2 lg/mL of MTT was added to
each well. The plate was then incubated for next 4 h. The reaction
was ceased by adding 100 lL DMSO to each well. The extent of
MMT reduction to formazan within cells was determined by measuring
the absorbance at 570 nm using an ELISA Reader (Spectra
Max Plus, Molecular Devices, CA, USA). The cytotoxicity was determined
at a concentration on which 50% cell growth was inhibited
(IC50) [24].
3. Results and discussion
Three new 2–4 and one known 5 metabolites were obtained
from the microbial transformation of danazol (1).
Metabolite 2 was obtained as a white powder from the biotransformation
of dianazol (1) (C22H27NO2). The HREI-MS of
metabolite 2 displayed the [M]+ at m/z 358.2152 (calcd.
358.2144), consistent with the formula C22H30O4, 20 amu greater
than substrate 1, which suggested the loss of a nitrogen atom
and addition of two oxygen and two hydrogen atoms. UV kmax at
230 nm suggested the presence of an enone system. The IR spectrum
showed absorption for OH (3281 cm
1
), and a, b-unsaturated
ketone (1670 cm
1
). In the 1
H NMR spectrum of metabolite 2,
absence of the most downfield olefinic proton (d 8.11) was noted
as compared to substrate 1. Whereas, three additional proton signals
at d 4.29 (methine), and 3.83 and 3.76 (methylene) were also
observed in the 1
H NMR spectrum (Table 1). This suggested reduction
of C@C bonds, as well as hydroxylation. Four olefinic carbon
signals were found missing in the 13C NMR spectrum which indicated
the reduction of two C@C bonds. In place of these, two additional
downfield carbon signals were found resonating at d 69.0
and 202.1 in the 13C NMR spectrum of compound 2, which suggested
hydroxylation and oxidation, respectively (Table 2). The
COSY-45 spectrum showed cross-peaks between newly formed
methine proton at d 4.20 and signals at d 2.71, 2.03 (H2-16) and
1.41 (H-14). This suggested hydroxylation at C-15. Similarly,
H-22 (d 3.83) showed geminal coupling with H-22 (d 3.83) and vicinal
coupling with H-1 (d 2.56) in COSY spectrum. H2-22 appeared as
AB double doublets at d 3.83 (J22a,22b = 11.0 Hz, J22a,1a = 4.5 Hz),
and 3.76 (J22b,22a = 11.0 Hz, J22b,1a = 4.5 Hz), indicating an OH at
C-22. The structure of metabolite 2 was further deduced on the
E. Baydoun

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

และทดสอบสารประกอบ (พื้นผิว) หนาวตัวควบคุมแรกที่อยู่วัฒนธรรมเชื้อรา และเท่าที่สองอยู่กลางเชื้อรา(ไม่ มีวัฒนธรรมเชื้อรา) กับพื้นผิว พื้นผิวถูก incubatedในน้ำสี่ประกอบด้วยวัฒนธรรมเชื้อราเติบโตอย่างสมบูรณ์ ทุก4 วันหนาวแต่ละตัวอย่างถูกเอาออก กรอง และสกัดด้วย dichloromethane ตัวทำละลายไม่หายไป และระดับการเปลี่ยนแปลงถูกเปรียบเทียบกับตัวควบคุมบน TLC หลังจากวันที่ 12ของคณะทันตแพทยศาสตร์ จำนวนของการเปลี่ยนแปลงที่สังเกตผ่านวิเคราะห์ TLC ระหว่างคัดกรองขนาดเล็ก ดังนั้น ทดลองต่อไปมาตรา preparativeสื่อวัฒนธรรม 5 ลิตรเตรียม และโอนย้ายไปนำ Erlenmeyer 50 ของ 250 mL (ละหนาวประกอบด้วย 100 mL ของกลาง และ autoclaved ที่ 121 C. นำได้ inoculated ด้วยวัฒนธรรมเชื้อรา และวางลงในเชคเกอร์ (121 rpm) ที่ 26 ± 2 C สำหรับคณะทันตแพทยศาสตร์ เมื่อเจริญเติบโตเหมาะสมถูกสังเกต 500 มิลลิกรัมของพื้นผิว1 ถูกละลายใน 50 mL ของอะซิโตน กระจายสม่ำเสมอกว่าซ้ายแล้วในเชคเกอร์โรตารี่ 12 วันที่ 26 และน้ำ 50 C. หลังวันที่ 12 เนื้อหาของน้ำทั้งหมดได้รวม วัฒนธรรมเชื้อราได้กรอง และชั้นอควีถูกสกัด ด้วย dichloromethane(18 ลิตร) กระบวนการสกัดซ้ำกันสามครั้งชั้นอินทรีย์ทำความชื้นกับไดโซเดียมซัลเฟต และเข้มข้นกว่า evaporator โรตารี่ความดันลดลงส่งผลให้เหงือกเช่นวัสดุ TLC เปรียบเทียบของขนาดเล็กมีการตรวจสอบทดลองขนาดใหญ่ และมีจุดที่คล้ายกันสังเกต เหงือกที่แบ่งผ่าน chromatography คอลัมน์ซิลิก้าเจลโดยใช้อะซีโตน hexanes เป็นระยะเคลื่อน หลักสี่เศษส่วน (1-4) ได้รับมาจากคอลัมน์ chromatographyการทำให้บริสุทธิ์ของ metabolites ถูกดำเนินการโดยกลับเฟส preparative HPLC พร้อมคอลัมน์ L-80ผสม 2 (เมทานอล: น้ำ 70:30, tR = 22 min) กล่าวจากเศษ-1 ถึงกลับเฟส HPLC รีไซเคิล ผสม3 (เมทานอล: น้ำ 70:30, tR = 20 นาที) ที่บริสุทธิ์จากเศษ-2ด้วยกลับระยะ HPLC ในทำนองเดียวกัน เศษส่วน-3 ผลmetabolite 4 (เมทานอล: น้ำ 70:30, tR = 21 นาที) ในการทำให้บริสุทธิ์ด้วยกลับระยะ HPLC ในขณะที่ metabolite 5 (เมทานอล:น้ำ 70:30, tR = 21 min) ถูกแยกจากส่วนที่ 4 ผ่านย้อนขั้นตอนการรีไซเคิล HPLC โดยใช้เมทานอลน้ำเป็นตัวทำละลายระบบ ในระหว่างการทำให้บริสุทธิ์ของ metabolites เรายังกู้คืนdanazol บาง unconsumed (1) พร้อมกับหลายรองแปลงผลิตภัณฑ์ ซึ่งเราอาจไม่บริสุทธิ์เนื่องของพวกเขามากปริมาณต่ำสุด2.3.1. 14b,17b-Dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-17a-pregn-4-en-20-yn-3-หนึ่ง (2)สีขาวทึบ ม. p. 228 – 230 C ผลตอบแทน%: 1% ½a25D = 49.3 (c 0.01ทานอล UV (ทานอล: kmax (loge) = 230 nm (3.1), 248 nm (3.0); IR(CHCl3): tmax 3281 ซม. 1 (OAH), 1670 ซม. 1 (enone); นางสาว HREIm 358.2152 [M] z + (mol. สูตร C22H31O4 ปี นี้ 358.2144); 1HNMR (CD3OD, 500 MHz); ตารางที่ 1 NMR 13C (CD3OD, 150 MHz);ตารางที่ 22.3.2. 1a,17b-Dihydroxy-17a-pregna-2,4-dien-20-yno-[2,3-d]-isoxazole (3)สีขาวทึบ ม. p. 231-233 C ผลตอบแทน%: 1.2% ½a25D = 144.6(c 0.025 ทานอ); UV (ทานอล: kmax (loge) = 278 nm (2.8); IR(CHCl3): tmax 3414 (OAH), 1624 ซม. 1 (C@C); นางสาว HREI m/z353.1974 [M] + (mol. สูตร C22H27NO3 ปีนี้ 353.1991); 1HNMR (CD3OD, 500 MHz) ตาราง 1 NMR 13C (CD3OD, 150 MHz)ตารางที่ 22.3.3. 6b,17b-Dihydroxy-17a-pregna-2,4-dien-20-yno-[2,3-d]-isoxazole (4)สีขาวทึบ ม. p. 232-234 C ผลตอบแทน%: 0.8% ½a25D = 67.5 (c0.008 ทานอ); UV (ทานอล: kmax (loge) = 286 nm (2.9); IR (KBr);tmax 3400 (OAH s), ค.ศ. 1625 (C@C); นางสาว HREI m/z 353.2000 [M] +,(สูตร mol., C22H27NO3 ปีนี้ 353.1991); 1H NMR (CD3OD300 MHz) ตารางที่ 1 13C NMR (CD3OD, 150 MHz) ตาราง 22.3.4. 17b-Hydroxy-2-(hydroxymethyl)-17a-pregn-1,4-dien-20-yn-3-หนึ่ง (5)สีขาวทึบ ม. p. 224 – 226 C ผลตอบแทน%: 1.2 ½a25D = 69.0 (c 0.01ทานอล UV (ทานอล: kmax (loge) = 248 nm (4.2); IR (CHCl3): tmax3305 (OAH), 1663 และ 1619 ซม. 1 (ข้ามกลวง enone);นางสาว HRESI m/z 340.2042 [M + H] + (สูตร mol., C22H28O3 ปี340.2038); 1H NMR (CD3OD, 500 MHz); ตารางที่ 1 13C NMR (CD3OD125 MHz); ตารางที่ 22.4 การโพรโทคอลทดลองสำหรับทดสอบ cytotoxicityMTT (3-[4,5-dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazoliumใช้วิธีเทียบเคียงโบรไมด์) สำหรับประเมิน cytotoxicityจากมนุษย์ปากมดลูก carcinoma (HeLa) เซลล์รายการ เซลล์(105 เซลล์/มล.) ถูกปลูกในหนาวเนื้อเยื่อที่ใช้น้อยที่สุดนกจำเป็นปานกลาง (MEM), เสริม ด้วยวัวและทารกในครรภ์เซรั่ม (FBS, 5%), ยาเพนนิซิลลิน (100 IU/mL) และ streptomycin(100 lg/มล.) เซลล์ถูกชุบลงบนแผ่นดี 96 ในความเข้มข้นน่าจะดี 100, incubated ค้างคืนใน 5%CO2 incubator ที่ 37 เซลเซียส กลางวันถัดไปถูกแทนที่ด้วยลิ้ม 200 จะสื่อ พร้อมกับความเข้มข้นแตกต่างกันทดสอบสาร (lM 1 – 50) แผ่น 96 ดีได้อีกincubated สำหรับ 72 h หลังจากบ่ม lg 2 mL ของ MTT ถูกเพิ่มเข้าไปแต่ละบ่อ จานได้แล้ว incubated สำหรับ h 4 ถัดไป ปฏิกิริยาถูกเพิ่ม โดยการเพิ่ม DMSO จะ 100 ละดี ขอบเขตของลด MMT formazan ภายในเซลล์การกำหนด โดยการวัดabsorbance ที่ 570 nm โดยใช้เครื่องอ่าน ELISA (แรมสเป็คตราสูงสุด บวก โมเลกุลอุปกรณ์ CA สหรัฐอเมริกา) Cytotoxicity ที่กำหนดที่เข้มข้นบนที่ 50% เจริญเติบโตของเซลล์ห้าม(IC50) [24]3. ผลลัพธ์ และสนทนาสามใหม่ 2 – 4 และหนึ่งรู้จัก 5 metabolites ได้รับจากการแปลงจุลินทรีย์ danazol (1)Metabolite 2 ไม่ได้เป็นผงสีขาวจากการ biotransformationของ dianazol (1) (C22H27NO2) นางสาว HREI ของmetabolite 2 แสดง [M] + ที่ m/z 358.2152 (ปี358.2144), สอดคล้องกับสูตร C22H30O4, 20 แม่น้ำอามูที่มากขึ้นกว่าพื้นผิว 1 ซึ่งสูญเสียอะตอมไนโตรเจนแนะนำและนอกจากนี้ไฮโดรเจนสองอะตอมและออกซิเจน 2 Kmax UV ที่230 nm แนะนำสถานะของระบบ enone คลื่นอินฟราเรดพบว่าดูดซึมใน OH (3281 ซม. 1), และ บีในระดับที่สมคีโตน (1670 ซม. 1). ใน 1H NMR สเปกตรัมของ metabolite 2มีการตั้งข้อสังเกตของโปรตอน olefinic downfield มากที่สุด (d 8.11)เป็นการเปรียบเทียบพื้นผิว 1 ในขณะที่ สัญญาณโปรตอนเพิ่มเติมสามที่ดี 4.29 (methine), และ 3.83 และ 3.76 (เมทิลีนได) แนะนำสังเกตใน 1H NMR สเปกตรัม (ตาราง 1) นี้แนะนำลดลงของพันธบัตร C@C ตลอดจน hydroxylation คาร์บอน 4 olefinicสัญญาณที่พบขาดในสเปกตรัม NMR 13C ที่ระบุการลดลงของพันธบัตร C@C สอง แทน สองเพิ่มเติมสัญญาณ downfield คาร์บอนได้พบ resonating ที่ d 69.0และ 202.1 ในสเปกตรัม NMR 13C 2 ผสม ที่แนะนำhydroxylation และออกซิเดชัน ตามลำดับ (ตารางที่ 2) ที่โคซี่-45 สเปกตรัมแสดงให้เห็นว่ายอดข้ามระหว่างใหม่เกิดขึ้นmethine โปรตอนที่ d 4.20 และสัญญาณที่ดี 2.71, 2.03 (H2-16) และ1.41 (H-14) นี้แนะนำ hydroxylation ที่ C-15 ในทำนองเดียวกันH-22 (d 3.83) แสดงให้เห็นว่า geminal coupling กับ H-22 (d 3.83) และ vicinalคลัปกับ H-1 (d 2.56) ในสเปกตรัมกว้าง H2-22 ปรากฏเป็นAB doublets คู่ที่ดี 3.83 (J22a, 22b = 11.0 Hz, J22a, 1a = 4.5 Hz),และ 3.76 (J22b, 22a = 11.0 Hz, J22b, 1a = 4.5 Hz), ระบุการ OH ที่C-22 โครงสร้างของ metabolite 2 มี deduced เพิ่มเติมในการE. Baydoun

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

และสารทดสอบ (พื้นผิว)
ขวดแรกที่มีการควบคุมการเพาะเลี้ยงเชื้อราเท่านั้นและขนาดกลางที่มีเชื้อราที่สอง
(ไม่วัฒนธรรมเชื้อรา) พร้อมด้วยพื้นผิว
พื้นผิวถูกบ่มในขวดที่มีสี่โตเต็มที่วัฒนธรรมเชื้อรา ทุกวันที่ 4 ตัวอย่างของแต่ละขวดจะถูกลบออกกรองและสกัดด้วยไดคลอโรมีเทน ตัวทำละลายที่ระเหยได้และระดับของการเปลี่ยนแปลงเมื่อเทียบกับการควบคุมบน TLC หลังจาก 12 วันของการบ่มจำนวนของการเปลี่ยนแปลงถูกตั้งข้อสังเกตผ่านการวิเคราะห์TLC ในระหว่างการตรวจคัดกรองขนาดเล็ก ดังนั้นการทดลองอย่างต่อเนื่องต่อระดับเตรียม. ห้าลิตรอาหารเลี้ยงถูกจัดทำขึ้นและย้ายไป50 ขวด Erlenmeyer 250 มิลลิลิตร (แต่ละขวดมี 100 มิลลิลิตรขนาดกลาง) และเบาที่ 121 ซี Flasks ถูกเชื้อกับวัฒนธรรมของเชื้อราและวางไว้บนเครื่องปั่น (121 รอบต่อนาที) 26 ± 2 องศาเซลเซียสเป็นเวลาฟักตัว เมื่อเจริญเติบโตที่เหมาะสมพบว่า 500 มิลลิกรัมของสารตั้งต้นที่1 ถูกละลายใน 50 มลของอะซีโตนกระจายมากกว่า50 ขวดและจากนั้นทิ้งไว้บนเครื่องปั่นหมุน 12 วันที่ 26 องศาเซลเซียสหลังจากวันที่12 เนื้อหาของขวดทั้งหมดถูกรวมกันเชื้อรา วัฒนธรรมที่ถูกกรองและชั้นน้ำถูกสกัดด้วยไดคลอโรมีเทน(18 ลิตร) กระบวนการสกัดซ้ำสามครั้ง. ชั้นอินทรีย์ได้ทำความชื้นฟรีกับโซเดียมไฮดรัสซัลเฟตและเข้มข้นมากกว่าความดันลดลงระเหยแบบหมุน. นี้ส่งผลให้เหงือกเช่นวัสดุ เปรียบเทียบ TLC ของขนาดเล็กและการทดลองขนาดใหญ่ที่ได้รับการตรวจสอบและจุดที่คล้ายกันถูกตั้งข้อสังเกต เหงือกถูก fractionated มากกว่าซิลิกาเจลคอลัมน์โดยใช้เฮกเซน-อะซีโตนเป็นเฟสเคลื่อนที่ สี่หลักเศษส่วน (1-4) ได้รับเป็นผลมาจากคอลัมน์. บริสุทธิ์ต่อไปของสารได้ดำเนินการโดยใช้ขั้นตอนการเตรียมกลับ HPLC พร้อมกับคอลัมน์ L-80. Compound 2 (เมทานอล: น้ำ 70:30, TR = 22 นาที) ที่ได้รับจากส่วนที่1 ผ่านขั้นตอนการรีไซเคิลกลับ HPLC สารประกอบ3 (เมทานอล: น้ำ 70:30, TR = 20 นาที) บริสุทธิ์จากส่วนที่ 2 ด้วย HPLC เฟสกลับ ในทำนองเดียวกันส่วนที่ 3 ผลmetabolite 4 (เมทานอล: น้ำ 70:30, TR = 21 นาที) ในการทำให้บริสุทธิ์ด้วยHPLC เฟสกลับ ในขณะที่สารที่ 5 (เมทานอล: น้ำ 70:30, TR = 21 นาที) ที่แยกได้จากส่วน-4 ผ่านการรีไซเคิลกลับเฟสHPLC โดยใช้เมทานอลน้ำเป็นตัวทำละลายระบบ ในระหว่างการทำให้บริสุทธิ์ของสารนี้เรายังกู้คืนบาง Danazol unconsumed (1) พร้อมด้วยรองลงมาเปลี่ยนหลายผลิตภัณฑ์ที่เราไม่สามารถทำให้บริสุทธิ์เนื่องจากการของพวกเขาในปริมาณต่ำ. 2.3.1 14b, 17b-Dihydroxy-2- (hydroxymethyl) -17a-pregn-4-en-20 yn- 3 หนึ่ง (2) สีขาวที่เป็นของแข็ง; MP 228-230 C; ผลผลิต% 1%; ½a 25 D = 49.3 (ค 0.01, เมธานอล); รังสียูวี (เมธานอล): kmax (คอก) = 230 นาโนเมตร (3.1) 248 นาโนเมตร (3.0); IR (CHCl3):? TMAX 3281 ซม. 1 (Oah) 1,670 ซม. 1 (enone); HREI-MS เมตร / z 358.2152 [M] + (mol สูตร C22H31O4, calcd 358.2144..); 1 H NMR (CD3OD 500 MHz); ตารางที่ 1; 13C NMR (CD3OD 150 MHz); ตารางที่ 2 2.3.2 1a, 17b-Dihydroxy-17a-pregna-2,4-dien-20-yno- [2,3-D] - isoxazole (3) สีขาวที่เป็นของแข็ง; MP 231-233 C; ผลผลิต%: 1.2%; ½a 25? D = 144.6 (ค 0.025, เมธานอล); รังสียูวี (เมธานอล): kmax (คอก) = 278 นาโนเมตร (2.8); IR (CHCl3): TMAX 3414 (Oah) 1,624 ซม. 1 (C @ C); HREI-MS เมตร / z 353.1974 [M] + (mol สูตร C22H27NO3, calcd 353.1991..); 1 H NMR (CD3OD 500 MHz) ตารางที่ 1; 13C NMR (CD3OD 150 MHz) ตารางที่ 2 2.3.3 6b, 17b-Dihydroxy-17a-pregna-2,4-dien-20-yno- [2,3-D] - isoxazole (4) สีขาวที่เป็นของแข็ง; MP 232-234 C; ผลผลิต%: 0.8%; ½a 25? D = 67.5 (ค 0.008, เมธานอล); รังสียูวี (เมธานอล): kmax (คอก) = 286 นาโนเมตร (2.9); IR (KBr); TMAX 3400 (Oah s), 1625 (C @ C); HREI-MS เมตร / z 353.2000 [M] +, (. mol สูตร C22H27NO3, calcd 353.1991.); 1 H NMR (CD3OD, 300 MHz) ตารางที่ 1; 13C NMR (CD3OD 150 MHz) ตารางที่ 2 2.3.4 17b-Hydroxy-2- (hydroxymethyl) -17a-pregn-1,4-dien-20-yn-3 หนึ่ง (5) สีขาวที่เป็นของแข็ง; MP 224-226 C; ผลผลิต%: 1.2; ½a 25? D = 69.0 (ค 0.01, เมธานอล); รังสียูวี (เมธานอล): kmax (คอก) = 248 นาโนเมตร (4.2); IR (CHCl3): TMAX? 3305 (Oah) 1663 และ 1619 ซม. 1 (ผันข้าม enone); HRESI-MS เมตร / z 340.2042 [M + H] + (. mol สูตร C22H28O3, calcd. 340.2038); 1 H NMR (CD3OD 500 MHz); ตารางที่ 1; 13C NMR (CD3OD, 125 MHz); ตารางที่ 2 2.4 โปรโตคอลการทดลองสำหรับการทดสอบความเป็นพิษMTT (3 [4,5-dimethylthiazole-2-YL] -2,5-diphenyl-tetrazolium โบรไมด์) วิธีการสีที่ใช้สำหรับการประเมินผลเป็นพิษกับมะเร็งปากมดลูกของมนุษย์(HeLa) สายพันธุ์ของเซลล์ เซลล์(105 เซลล์ / มิลลิลิตร) มีปลูกในขวดเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อโดยใช้ขั้นต่ำที่จำเป็นอินทรีกลาง(MEM) เสริมด้วยวัวของทารกในครรภ์ซีรั่ม(FBS, 5%), ยาปฏิชีวนะ (100 IU / มิลลิลิตร) และ streptomycin (100 LG / มิลลิลิตร) . เซลล์ที่ถูกชุบแล้วใส่ลงในจาน 96 หลุมในความเข้มข้นของ100 LL / ดีและบ่มค้างคืนใน 5% บ่มเพาะ CO2 ที่ 37 องศาเซลเซียสกลางในวันถัดไปถูกแทนที่ด้วยที่เตรียมสดใหม่200 LL กลางพร้อมกับความเข้มข้นที่แตกต่างกันของการทดสอบสาร (1-50 LM) แผ่น 96 หลุมอีกครั้งบ่มเป็นเวลา72 ชั่วโมง หลังจากการบ่ม 2 LG / มิลลิลิตร MTT ถูกบันทึกอยู่ในแต่ละดี แผ่นที่ได้รับการบ่มแล้วต่อไป 4 ชั่วโมง ปฏิกิริยาถูกหยุดโดยการเพิ่ม 100 LL DMSO ไปละกัน ขอบเขตของการลดการ MMT formazan ภายในเซลล์ถูกกำหนดโดยการวัดการดูดกลืนแสงที่570 นาโนเมตรโดยใช้วิธี ELISA อ่าน (Spectra แม็กซ์พลัส, อุปกรณ์โมเลกุล, CA, USA) พิษที่ได้รับการพิจารณาที่ความเข้มข้นที่เจริญเติบโตของเซลล์ 50% ถูกยับยั้ง (IC50) [24]. 3 ผลการทดลองและการอภิปรายสามใหม่ 2-4 และเป็นหนึ่งในสารที่รู้จักกันใน 5 ที่ได้รับจากการเปลี่ยนแปลงของจุลินทรีย์Danazol (1). โบไล 2 ที่ได้รับเป็นผงสีขาวจากการเปลี่ยนรูปทางชีวภาพของdianazol (1) (C22H27NO2) HREI-MS ของสาร2 แสดง [M] + ที่ม. / z 358.2152 (calcd. 358.2144) สอดคล้องกับ C22H30O4 สูตร 20 มวลอะตอมมากขึ้นกว่าพื้นผิว1 ซึ่งชี้ให้เห็นการสูญเสียของอะตอมไนโตรเจนที่และนอกเหนือจากสองออกซิเจนและสองอะตอมไฮโดรเจน kmax รังสียูวีที่230 นาโนเมตรแนะนำการปรากฏตัวของระบบ enone สเปกตรัมนักลงทุนสัมพันธ์ที่แสดงให้เห็นการดูดซึมสำหรับโอไฮโอ (3281 ซม. 1) และขไม่อิ่มตัวคีโตน (1670 ซม. 1) ใน 1 สเปกตรัม H NMR 2 metabolite, ตัวตนของโปรตอน olefinic ร่นมากที่สุด (8.11 d) ก็สังเกตเห็นว่าเมื่อเทียบกับพื้นผิว1. ในขณะที่สามสัญญาณโปรตอนเพิ่มเติมที่d 4.29 (methine) และ 3.83 และ 3.76 (เมทิลีน) เป็น นอกจากนี้ยังพบว่าใน1 H NMR สเปกตรัม (ตารางที่ 1) นี้แสดงให้เห็นการลดลงของ C @ พันธบัตร C เช่นเดียวกับไฮดรอกซิ สี่คาร์บอน olefinic สัญญาณถูกพบว่าขาดหายไปในสเปกตรัม 13C NMR ซึ่งชี้ให้เห็นการลดลงของสองC @ พันธบัตรซี ในสถานที่ของเหล่านี้อีกสองสัญญาณคาร์บอนร่นที่พบสะท้อนงที่ 69.0 และ 202.1 ในสเปกตรัม 13C NMR ของสารประกอบที่ 2 ซึ่งชี้ให้เห็นhydroxylation และการเกิดออกซิเดชันตามลำดับ (ตารางที่ 2) โคซี่-45 คลื่นความถี่ที่แสดงให้เห็นว่ายอดข้ามระหว่างที่จัดตั้งขึ้นใหม่โปรตอนmethine ที่ d 4.20 และสัญญาณที่ d 2.71, 2.03 (H2-16) และ1.41 (H-14) นี้แสดงให้เห็น hydroxylation ที่ C-15 ในทำนองเดียวกันH-22 (ง 3.83) พบว่ามีเพศสัมพันธ์กับ geminal H-22 (ง 3.83) และ vicinal การมีเพศสัมพันธ์กับ H-1 (ง 2.56) ในคลื่นความถี่โคซี่ H2-22 ปรากฏเป็นAB doublets คู่ที่ d 3.83 (J22a, 22b = 11.0 เฮิรตซ์ J22a, 1a = 4.5 เฮิร์ตซ์) และ 3.76 (J22b, 22a = 11.0 เฮิรตซ์ J22b, 1a = 4.5 Hz) ชี้ OH ที่C -22 โครงสร้างของสาร 2 ที่ได้รับการอนุมานเพิ่มเติมเกี่ยวกับอี Baydoun