- ข้อความ
- ประวัติศาสตร์
(NHS; Sigma-Aldrich) and 1-ethyl-3-
(NHS; Sigma-Aldrich) and 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride
(EDC; Sigma-Aldrich) were added in 5 molar excess of the carboxylic
acid groups of alginate. Either norbornene or tetrazine was then added at 1 mmol
per gram of alginate to make Alg-N or Alg-T, respectively. The coupling reactionwas
stirred at room temperature for 24 h, after which the reaction was quenched with
hydroxylamine (Sigma-Aldrich) and dialyzed in 12e14 kDa MWCO dialysis tubing
(Spectrum Labs) for 4 days against a decreasing salt gradient from 150 mM to 0 mM
NaCl in diH2O. The purified Alg-N and Alg-T polymers were treated with activated
charcoal, sterile filtered (0.22 mm), and freeze-dried. This resulted in purified Alg-N
or Alg-T polymers with a 5% degree of substitution of the available carboxylic acid
groups of alginate (Fig. S-1).
2.3. Preparation and characterization of click alginate hydrogels
Click alginate hydrogels were prepared by first separately dissolving freezedried
Alg-N and Alg-T polymers to final desired concentration (2e4% w/v) in Dulbecco's
Modified Eagle Medium (DMEM; Gibco). For gelation kinetics measurements,
Alg-N and Alg-T polymer solutions were mixed at a desired ratio (i.e.,
0.5e4:1 N:T) and directly pipetted onto the bottom plate of a TA Instruments ARG2
rheometer equipped with 8 mmflat upper plate geometry. A Peltier cooler was used
to control the temperature for temperature dependent experiments, and mineral oil
was applied to the gel periphery to prevent the hydrogel from drying during testing.
Hydrogel samples were subjected to 1% strain at 1 Hz, and the storage and loss
moduli (G0 and G00) were monitored for 4 h. For Young's modulus measurements
click alginate hydrogels were formed under siliconized glass plates (Sigmacote;
Sigma-Aldrich) with 2 mm spacers. After 2 h of crosslinking at room temperature,
cylindrical disks were punched using an 8 mm biopsy punch, transferred to DMEM,
and swollen to equilibrium for 24 h at 37 C. Swollen hydrogel sample dimensions
were measured using calipers for volumetric swelling ratio measurements, and then
subjected to unconfined compression testing (1 mm/min) using a 10 N load cell with
no preload (Instron Model 3342). The Young's modulus, E, was calculated as the
slope of the linear portion (first 10%) of the stress vs. strain curves.
2.4. Post-gelation thiol-ene photoreaction onto click alginate hydrogels
Click alginate hydrogels were made as previously described (2% w/v, N:T ¼ 2)
and then a cell adhesive CGGGGRGDSP peptide (Peptide2.0) solution at 0.2 or 2 mM
containing 0.5% w/v photoinitiator (Irgacure 2959; Sigma-Aldrich) was pipetted on
top and the gel was covered with a glass coverslip. Gels were irradiated at 365 nm
for 60 s at 10 mW/cm2. The gels were washed several times with DMEM to remove
excess photoinitiator and unreacted peptide and swollen to equilibrium at 37 C
before seeding with cells.
2.5. EGFP 3T3 cell culture
NIH 3T3 (ATCC) cells were transduced with lentivirus produced from an EGFPcontaining
lentiviral vector (pLCAG EGFP, Inder Verma lab, Addgene plasmid
14857) [33] and were selected for 7 days in 1 mg/mL puromycin dihydrochloride
(EMD Millipore). EGFP-expressing 3T3 fibroblast cells were cultured in DMEM
supplemented with 10% (v/v) fetal calf serum, 100 U/mL penicillin, and 100 mg/mL
streptomycin (Gibco) at 37 C, in a 5% CO2 environment. Cells were passaged
approximately twice per week.
2.6. Cell adhesion
For cell adhesion studies, slabs of click alginate hydrogels were modified with
cell adhesion peptides as described above. 6 mm disks were punched, placed in
DMEM, washed several times, and swollen for 4 h prior to seeding with cells at
5 104 cells/mL at a depth of approximately 1mmabove the surface of the gel. Cells
were given 24 h to adhere and spread and then visualized via EGFP fluorescence
using an epifluorescence microscope. EGFP images were used to quantify total cell
area using ImageJ software. After 3 days of culture, cells were fixed and stained using
Alexa Fluor 594 phalloidin (Molecular Probes) and Hoescht 33342 (Molecular
Probes) to visualize F-actin filaments and nuclei respectively. To visualize cell death,
gels were incubated for 20 min with a 4 mM ethidium homodimer-1 (Molecular
Probes) solution in Hanks Buffered Saline Solution (HBSS) and imaged using an
epifluorescence microscope.
2.7. Cell encapsulation
For cell encapsulation studies, Alg-N polymers were modified to have approximately
20 cell adhesive GGGGRGDSP peptides (Peptide2.0) per alginate chain as
previously described [17]. 600 mm thick click alginate hydrogels at 2% w/v, N:T ¼ 1,
were then made containing cells at 3 106 cells/mL. Ionically crosslinked hydrogels
were similarly prepared at 2% w/v using the same cell density and backbone RGD
modified Alg-N polymers. A CaSO4 slurry (0.21 g CaSO4/mL ddH2O) at a final concentration
of 2% w/v was used to crosslink the ionically crosslinked hydrogel samples
so as to match the mechanical properties of the two substrates as closely as
possible. To minimize the time in which cells did not have access to culture media,
gels were allowed to crosslink at room temperature for 1 h, after which 6 mm disks
(EDC; Sigma-Aldrich) were added in 5 molar excess of the carboxylic
acid groups of alginate. Either norbornene or tetrazine was then added at 1 mmol
per gram of alginate to make Alg-N or Alg-T, respectively. The coupling reactionwas
stirred at room temperature for 24 h, after which the reaction was quenched with
hydroxylamine (Sigma-Aldrich) and dialyzed in 12e14 kDa MWCO dialysis tubing
(Spectrum Labs) for 4 days against a decreasing salt gradient from 150 mM to 0 mM
NaCl in diH2O. The purified Alg-N and Alg-T polymers were treated with activated
charcoal, sterile filtered (0.22 mm), and freeze-dried. This resulted in purified Alg-N
or Alg-T polymers with a 5% degree of substitution of the available carboxylic acid
groups of alginate (Fig. S-1).
2.3. Preparation and characterization of click alginate hydrogels
Click alginate hydrogels were prepared by first separately dissolving freezedried
Alg-N and Alg-T polymers to final desired concentration (2e4% w/v) in Dulbecco's
Modified Eagle Medium (DMEM; Gibco). For gelation kinetics measurements,
Alg-N and Alg-T polymer solutions were mixed at a desired ratio (i.e.,
0.5e4:1 N:T) and directly pipetted onto the bottom plate of a TA Instruments ARG2
rheometer equipped with 8 mmflat upper plate geometry. A Peltier cooler was used
to control the temperature for temperature dependent experiments, and mineral oil
was applied to the gel periphery to prevent the hydrogel from drying during testing.
Hydrogel samples were subjected to 1% strain at 1 Hz, and the storage and loss
moduli (G0 and G00) were monitored for 4 h. For Young's modulus measurements
click alginate hydrogels were formed under siliconized glass plates (Sigmacote;
Sigma-Aldrich) with 2 mm spacers. After 2 h of crosslinking at room temperature,
cylindrical disks were punched using an 8 mm biopsy punch, transferred to DMEM,
and swollen to equilibrium for 24 h at 37 C. Swollen hydrogel sample dimensions
were measured using calipers for volumetric swelling ratio measurements, and then
subjected to unconfined compression testing (1 mm/min) using a 10 N load cell with
no preload (Instron Model 3342). The Young's modulus, E, was calculated as the
slope of the linear portion (first 10%) of the stress vs. strain curves.
2.4. Post-gelation thiol-ene photoreaction onto click alginate hydrogels
Click alginate hydrogels were made as previously described (2% w/v, N:T ¼ 2)
and then a cell adhesive CGGGGRGDSP peptide (Peptide2.0) solution at 0.2 or 2 mM
containing 0.5% w/v photoinitiator (Irgacure 2959; Sigma-Aldrich) was pipetted on
top and the gel was covered with a glass coverslip. Gels were irradiated at 365 nm
for 60 s at 10 mW/cm2. The gels were washed several times with DMEM to remove
excess photoinitiator and unreacted peptide and swollen to equilibrium at 37 C
before seeding with cells.
2.5. EGFP 3T3 cell culture
NIH 3T3 (ATCC) cells were transduced with lentivirus produced from an EGFPcontaining
lentiviral vector (pLCAG EGFP, Inder Verma lab, Addgene plasmid
14857) [33] and were selected for 7 days in 1 mg/mL puromycin dihydrochloride
(EMD Millipore). EGFP-expressing 3T3 fibroblast cells were cultured in DMEM
supplemented with 10% (v/v) fetal calf serum, 100 U/mL penicillin, and 100 mg/mL
streptomycin (Gibco) at 37 C, in a 5% CO2 environment. Cells were passaged
approximately twice per week.
2.6. Cell adhesion
For cell adhesion studies, slabs of click alginate hydrogels were modified with
cell adhesion peptides as described above. 6 mm disks were punched, placed in
DMEM, washed several times, and swollen for 4 h prior to seeding with cells at
5 104 cells/mL at a depth of approximately 1mmabove the surface of the gel. Cells
were given 24 h to adhere and spread and then visualized via EGFP fluorescence
using an epifluorescence microscope. EGFP images were used to quantify total cell
area using ImageJ software. After 3 days of culture, cells were fixed and stained using
Alexa Fluor 594 phalloidin (Molecular Probes) and Hoescht 33342 (Molecular
Probes) to visualize F-actin filaments and nuclei respectively. To visualize cell death,
gels were incubated for 20 min with a 4 mM ethidium homodimer-1 (Molecular
Probes) solution in Hanks Buffered Saline Solution (HBSS) and imaged using an
epifluorescence microscope.
2.7. Cell encapsulation
For cell encapsulation studies, Alg-N polymers were modified to have approximately
20 cell adhesive GGGGRGDSP peptides (Peptide2.0) per alginate chain as
previously described [17]. 600 mm thick click alginate hydrogels at 2% w/v, N:T ¼ 1,
were then made containing cells at 3 106 cells/mL. Ionically crosslinked hydrogels
were similarly prepared at 2% w/v using the same cell density and backbone RGD
modified Alg-N polymers. A CaSO4 slurry (0.21 g CaSO4/mL ddH2O) at a final concentration
of 2% w/v was used to crosslink the ionically crosslinked hydrogel samples
so as to match the mechanical properties of the two substrates as closely as
possible. To minimize the time in which cells did not have access to culture media,
gels were allowed to crosslink at room temperature for 1 h, after which 6 mm disks
0/5000
(NHS Sigma-Aldrich) และ 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide ไฮโดรคลอไรด์(EDC Sigma-Aldrich) เพิ่ม 5 สบเกินกว่าที่ carboxylicกลุ่มกรดแอลจิเนต Norbornene หรือ tetrazine มีเพิ่มที่ 1 mmolต่อกรัมของแอลจิเนตให้ Alg-N หรือ Alg-T ตามลำดับ Reactionwas คลัปกวนที่อุณหภูมิห้องใน 24 ชม หลังจากที่ปฏิกิริยาถูก quenched ด้วยhydroxylamine (ซิก-Aldrich) และ dialyzed ใน 12e14 kDa MWCO หน่วยท่อ(สเปกตรัม Labs) 4 วันกับลดเกลือไล่จากมม. 150 มม. 0NaCl ใน diH2O โพลิเมอร์ Alg N และ Alg T บริสุทธิ์ได้รับการเปิดใช้งานถ่าน ใส่กรอง (0.22 mm), และอบแห้ง ส่งผลให้บริสุทธิ์ Alg-Nหรือโพลิเมอร์ Alg-T กับตัว 5% ของการทดแทนกรด carboxylic ว่างกลุ่มแอลจิเนต (ฟิก S-1)2.3 การเตรียมและสมบัติของ hydrogels แอลจิเนตคลิกคลิ hydrogels แอลจิเนตที่เตรียม โดย freezedried ยุบแยกแรกโพลิเมอร์ Alg N และ Alg T เพื่อสุดท้ายต้องเข้มข้น (2e4% w/v) ในของดุลเบกโกอีเกิ้ลปรับปานกลาง (DMEM Gibco) สำหรับวัดจลนพลศาสตร์ gelationโซลูชั่นโพลีเมอร์ Alg N และ Alg T ได้ผสมในอัตราส่วนที่ระบุ (เช่น0.5e4:1 N:T) และ pipetted โดยตรงบนแผ่นล่างของ ARG2 เป็นเครื่องมือตาลารี่รีโอมพร้อมเรขาคณิตบนแผ่น mmflat 8 ใช้เย็น Peltierการควบคุมอุณหภูมิสำหรับการทดลองขึ้นอยู่กับอุณหภูมิ และน้ำมันใช้เจลยสปริงให้ hydrogel แห้งในระหว่างการทดสอบตัวอย่าง Hydrogel ถูกต้องโหม 1% ที่ 1 Hz และการจัดเก็บ และการสูญเสียmoduli (G0 และ G00) ได้ตรวจสอบสำหรับ 4 h สำหรับการวัดโมดูลัสของยังคลิกแอลจิเนต hydrogels ถูกก่อตั้งขึ้นภายใต้แผ่นแก้ว siliconized (SigmacoteSigma-Aldrich) กับ spacers 2 มม. หลังจาก h 2 ของ crosslinking ที่อุณหภูมิห้องทรงกระบอกดิสก์ถูกเจาะรูโดยใช้การเจาะตรวจชิ้นเนื้อเป็น 8 มม. โอนย้ายไป DMEMและบวมให้สมดุลใน 24 ชมที่ 37 C. Swollen hydrogel ตัวอย่างขนาดมีวัดใช้ calipers volumetric บวมอัตราส่วนวัด และบีบอัดต้อง unconfined ทดสอบ (1 mm/min) โดยใช้ 10 N โหลดเซลล์ด้วยไม่โหลด (3342 รุ่น Instron) โมดูลัสของยัง อี คำนวณเป็นการความชันของเส้นตรงแบ่ง (แรก 10%) ความเครียดเปรียบเทียบกับเส้นโค้งต้องใช้2.4. หลัง gelation thiol-ene photoreaction ลงคลิ hydrogels แอลจิเนตคลิกแอลจิเนต hydrogels ทำเป็นอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (2% w/v, N:T ¼ 2)แล้วเซลล์กาว CGGGGRGDSP เพปไทด์ (Peptide2.0) วิธีที่ 0.2 หรือ 2 มม.ประกอบด้วย 0.5% w/v photoinitiator (Irgacure 2959 Sigma-Aldrich) ที่ pipetted ในด้านบนและเจถูกปกคลุม ด้วย coverslip แก้ว เจมี irradiated ที่ 365 nm60 s ที่ 10 mW/cm2 เจได้ล้างหลายครั้ง ด้วย DMEM เอาส่วนเกิน photoinitiator และเปป unreacted และบวมการสมดุลที่ 37 Cก่อนปลูกเซลล์2.5 การเพาะเลี้ยงเซลล์ 3T3 EGFPNIH 3T3 (ATCC) เซลล์มี transduced มี lentivirus ผลิตจาก EGFPcontaining เป็นlentiviral เวกเตอร์ (pLCAG EGFP แล็บอินเดอร์ปากา Verma, Addgene plasmid14857) [33] และเลือก 7 วันใน 1 mg/mL puromycin dihydrochloride(EMD มาก) EGFP แสดงเซลล์ fibroblast 3T3 มีอ่างใน DMEMเสริม ด้วยเซรั่มและทารกในครรภ์ลูก 10% (v/v) 100 U/mL ยาเพนนิซิลลิน และ 100 mg/mLstreptomycin (Gibco) ที่ 37 C ในสภาวะ 5% CO2 เซลล์ถูก passagedประมาณสองครั้งต่อสัปดาห์2.6 การเซลล์ยึดเกาะศึกษาเซลล์ยึดเกาะ แผ่นพื้นของคลิกแอลจิเนต hydrogels ถูกปรับเปลี่ยนด้วยเซลล์ยึดเกาะเปปไทด์ที่อธิบายข้างต้น มม. 6 ดิสก์ถูกเจาะรูการ วางDMEM ล้างหลายครั้ง และบวมสำหรับ h 4 ก่อนปลูกเซลล์ที่5 เซลล์ 104 mL ที่ความลึกประมาณ 1mmabove พื้นผิวของเจ เซลล์ได้รับ 24 ชมเกาะติด และแพร่กระจาย และ visualized แล้ว ผ่าน EGFP fluorescenceใช้กล้องจุลทรรศน์ epifluorescence ใช้วัดปริมาณเซลล์ทั้งหมด EGFP รูปพื้นที่ที่ใช้ซอฟต์แวร์ ImageJ หลังจาก 3 วันวัฒนธรรม เซลล์ได้ถาวร และสีโดยใช้Phalloidin Alexa Fluor 594 (Probes โมเลกุล) และ Hoescht (โมเลกุล 33342คลิปปากตะเข้) เห็นภาพ F-แอกติน filaments และแอลฟาตามลำดับ เห็นภาพเซลล์ตายเจมี incubated สำหรับ 20 นาทีกับการ 4 มม. ethidium homodimer (โมเลกุลโซลูชันคลิปปากตะเข้) แฮงส์ Buffered Saline โซลูชัน (HBSS) และใช้ imaged เป็นepifluorescence กล้องจุลทรรศน์2.7 การ encapsulation เซลล์ศึกษาเซลล์ encapsulation โพลิเมอร์ Alg N ถูกปรับเปลี่ยนให้ประมาณกาว GGGGRGDSP เปปไทด์ (Peptide2.0) ต่อโซ่แอลจิเนตเป็นเซลล์ 20อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [17] มม.หนาคลิ hydrogels แอลจิเนตที่ 2% w/v, N:T ¼ 1แล้วแปลงที่ประกอบด้วยเซลล์ที่ 3 106 เซลล์/มล. Ionically crosslinked hydrogelsได้เตรียมไว้ที่ 2% w/v ความหนาแน่นของเซลล์เดียวและแกนหลัก RGD ทำนองเดียวกันปรับเปลี่ยนโพลิเมอร์ Alg-N การน้ำ CaSO4 (0.21 กรัม CaSO4/mL ddH2O) ที่ความเข้มข้นสุดท้ายของ 2% w/v ใช้ crosslink ตัวอย่าง hydrogel crosslinked ionicallyเพื่อให้ตรงกับคุณสมบัติทางกลของวัสดุทั้งสองใกล้เคียงเป็นเป็นไปได้ เพื่อลดเวลาที่เซลล์ไม่มีการเข้าถึงสื่อวัฒนธรรมเจได้รับอนุญาตให้ crosslink อุณหภูมิห้องสำหรับ 1 h หลังจากที่ดิสก์ 6 มม.
การแปล กรุณารอสักครู่..
(พลุกพล่าน; Sigma-Aldrich) และเอทิล 1-3 (3 dimethylaminopropyl) ไฮโดรคลอไร -carbodiimide
(EDC; Sigma-Aldrich) ถูกเพิ่มเข้ามาใน 5? ส่วนเกินโมลของคาร์บอกซิ
กลุ่มกรดอัลจิเนต อย่างใดอย่างหนึ่งหรือ norbornene tetrazine ถูกเพิ่มเข้ามาแล้ววันที่ 1 มิลลิโมล
ต่อกรัมของอัลจิเนตเพื่อให้ Alg-N หรือ Alg-T ตามลำดับ การมีเพศสัมพันธ์ reactionwas
กวนที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 24 ชั่วโมงหลังจากที่เกิดปฏิกิริยาถูกดับด้วย
ไฮดรอกซิ (Sigma-Aldrich) และ dialyzed ใน 12e14 kDa MWCO ท่อล้างไต
(Spectrum Labs) เป็นเวลา 4 วันกับการไล่ระดับสีเกลือลดลงจาก 150 มิลลิ 0 มิลลิ
โซเดียมคลอไรด์ใน diH2O บริสุทธิ์ Alg-N และโพลิเมอร์ Alg-T ได้รับการรักษาที่มีการเปิดใช้งาน
ถ่านกรองผ่านการฆ่าเชื้อ (0.22 มม) และแห้ง นี้ส่งผลให้บริสุทธิ์ Alg-N
หรือโพลีเมอ Alg-T ที่มีระดับ 5% ของการทดแทนของที่มีกรดคาร์บอกซิ
กลุ่มอัลจิเนต (รูป. S-1).
2.3 การเตรียมและลักษณะของไฮโดรเจลอัลจิเนตคลิก
คลิกไฮโดรเจลอัลจิเนตที่ถูกจัดทำขึ้นโดยครั้งแรกที่แยกละลาย freezedried
Alg-N และโพลิเมอร์ Alg-T กับความเข้มข้นที่ต้องการสุดท้าย (2e4% w / v) ใน Dulbecco ของ
อีเกิลดัดแปลงกลาง (DMEM; Gibco) สำหรับจลนศาสตร์เจวัด
Alg-N และ Alg-T โซลูชั่นลิเมอร์ผสมในอัตราส่วนที่ต้องการ (เช่น
0.5e4: 1 N: T) และปิเปตโดยตรงไปยังด้านล่างของแผ่น TA เครื่องมือ ARG2
rheometer พร้อมกับ 8 mmflat จานบน เรขาคณิต เย็น Peltier ถูกนำมาใช้
ในการควบคุมอุณหภูมิที่อุณหภูมิขึ้นอยู่กับการทดลองและน้ำมันแร่
ถูกนำไปใช้เจลรอบเพื่อป้องกันไม่ให้ไฮโดรเจลแห้งในระหว่างการทดสอบ.
ตัวอย่างไฮโดรเจลถูกยัดเยียดให้สายพันธุ์ที่ 1% ณ วันที่ 1 เฮิร์ตซ์และการจัดเก็บข้อมูลและการสูญเสีย
โมดูล (G0 และ G00) ได้รับการตรวจสอบ 4 ชั่วโมง สำหรับการตรวจวัดโมดูลัสของยัง
คลิกไฮโดรเจลอัลจิเนตที่มีอยู่ภายใต้แผ่นกระจก siliconized (Sigmacote;
Sigma-Aldrich) 2 มม spacers หลังจาก 2 ชั่วโมงของการเชื่อมขวางที่อุณหภูมิห้อง
ดิสก์รูปทรงกระบอกที่ถูกเจาะโดยใช้ 8 มมหมัดเนื้อเยื่อย้ายไป DMEM,
บวมและเพื่อความสมดุลเป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส ขนาดตัวอย่างบวมไฮโดรเจล
ที่ถูกวัดโดยใช้เครื่องวัดเส้นผ่าศูนย์กลางสำหรับปริมาตรการวัดอัตราการบวมและจากนั้น
ภายใต้การทดสอบแรงอัดไร้ข้อ จำกัด (1 มิลลิเมตร / นาที) โดยใช้โหลดเซลล์ 10 N กับ
พรีโหลดไม่มี (บริษัท อินสตรอนรุ่น 3342) โมดูลัสของหนุ่มอีที่คำนวณได้เป็น
ความชันของเส้นตรงส่วน (ตอนแรก 10%) ของความเครียดกับเส้นโค้งความเครียด.
2.4 โพสต์เจ photoreaction thiol-ene บนไฮโดรเจลอัลจิเนตคลิก
คลิกไฮโดรเจลอัลจิเนตได้ทำตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (2% w / v, N: T ¼ 2)
แล้วกาวเซลล์ CGGGGRGDSP เปปไทด์ (Peptide2.0) วิธีการแก้ปัญหาที่ 0.2 หรือ 2 มิลลิ
ที่มี 0.5% w / photoinitiator โวลต์ (Irgacure 2959; Sigma-Aldrich) ได้รับการปิเปตใน
ด้านบนและเจลที่ถูกปกคลุมด้วยกระจก coverslip เจลที่ได้รับการฉายรังสีที่ 365 นาโนเมตร
เป็นเวลา 60 วินาทีที่ 10 mW / cm2 เจลล้างหลายครั้งด้วย DMEM ที่จะลบ
photoinitiator ส่วนเกินและเปปไทด์ unreacted และบวมเพื่อความสมดุลที่ 37 องศาเซลเซียส
ก่อนที่จะเพาะเซลล์.
2.5 EGFP วัฒนธรรม 3T3 เซลล์
NIH 3T3 (ATCC) เซลล์ transduced กับ lentivirus ผลิตจาก EGFPcontaining
lentiviral เวกเตอร์ (pLCAG EGFP, ห้องปฏิบัติการ Inder Verma, พลาสมิด Addgene
14,857) [33] และได้รับการคัดเลือกเป็นเวลา 7 วันใน 1 มิลลิกรัม / มิลลิลิตร puromycin dihydrochloride
(เมอร์ค ค) EGFP-แสดง 3T3 เซลล์ fibroblast เลี้ยงใน DMEM
เสริมด้วย 10% (v / v) ซีรั่มของทารกในครรภ์ลูกวัว 100 penicillin U / มิลลิลิตรและ 100 มิลลิกรัม / มิลลิลิตร
streptomycin (Gibco) ที่ 37 องศาเซลเซียสในสภาพแวดล้อมที่ CO2 5% เซลล์ที่ถูก passaged
ประมาณสองครั้งต่อสัปดาห์.
2.6 การยึดเกาะของเซลล์
สำหรับการศึกษาการยึดเกาะของเซลล์แผ่นไฮโดรเจลคลิกอัลจิเนตมีการแก้ไขด้วย
เปปไทด์การยึดเกาะของเซลล์ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น 6 มิลลิเมตรดิสก์ถูกชกที่วางไว้ใน
DMEM ล้างหลายครั้งและบวมเป็นเวลา 4 ชั่วโมงก่อนที่จะมีการเพาะเซลล์ที่
5? 104 เซลล์ / มิลลิลิตรที่ระดับความลึกประมาณ 1mmabove พื้นผิวของเจล เซลล์
ที่ได้รับ 24 ชั่วโมงที่จะปฏิบัติตามและการแพร่กระจายและการมองเห็นแล้วผ่านการเรืองแสง EGFP
ใช้กล้องจุลทรรศน์ epifluorescence ภาพ EGFP ถูกนำมาใช้เพื่อวัดปริมาณเซลล์ทั้งหมด
ในพื้นที่โดยใช้ซอฟแวร์ ImageJ หลังจาก 3 วันของวัฒนธรรมเซลล์ได้รับการแก้ไขและการใช้สี
ของ Alexa Fluor 594 phalloidin (วัดระดับโมเลกุล) และ Hoescht 33342 (Molecular
Probes) เพื่อให้มองเห็นไส้ F-โปรตีนและนิวเคลียสตามลำดับ จะเห็นภาพการตายของเซลล์,
เจลถูกบ่มเป็นเวลา 20 นาทีกับ 4 มิลลิ ethidium homodimer-1 (Molecular
Probes) วิธีการแก้ปัญหาในการแฮงค์ส Buffered น้ำเกลือ (HBSS) และถ่ายภาพโดยใช้
กล้องจุลทรรศน์ epifluorescence.
2.7 ห่อหุ้มเซลล์
สำหรับการศึกษาการห่อหุ้มเซลล์ Alg-N โพลิเมอร์มีการแก้ไขจะมีประมาณ
20 กาวเซลล์ GGGGRGDSP เปปไทด์ (Peptide2.0) ต่อห่วงโซ่อัลจิเนตเป็น
อธิบายไว้ก่อนหน้า [17] 600 มิลลิเมตรคลิกอัลจิเนตไฮโดรเจลที่ 2% w / v, N: T ¼ 1
จากนั้นก็ทำให้มีเซลล์ที่ 3 หรือไม่? 106 เซลล์ / มิลลิลิตร Ionically ไฮโดรเจลเชื่อมขวาง
ได้จัดทำในทำนองเดียวกันที่ 2% w / v โดยใช้ความหนาแน่นของเซลล์เดียวกันและกระดูกสันหลัง RGD
ดัดแปลงโพลิเมอร์ Alg-N สารละลาย CaSO4 (0.21 กรัม CaSO4 / mL ddH2O) ที่เข้มข้นสุดท้าย
2% w / v ถูกใช้ในการ Crosslink ตัวอย่างไฮโดรเจลเชื่อมขวาง ionically
เพื่อให้ตรงกับคุณสมบัติทางกลของทั้งสองพื้นผิวอย่างใกล้ชิดในฐานะ
ที่เป็นไปได้ เพื่อลดเวลาที่เซลล์ไม่ได้มีการเข้าถึงสื่อวัฒนธรรม
เจลได้รับอนุญาตให้ Crosslink ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 1 ชั่วโมงหลังจากที่ 6 มมดิสก์
(EDC; Sigma-Aldrich) ถูกเพิ่มเข้ามาใน 5? ส่วนเกินโมลของคาร์บอกซิ
กลุ่มกรดอัลจิเนต อย่างใดอย่างหนึ่งหรือ norbornene tetrazine ถูกเพิ่มเข้ามาแล้ววันที่ 1 มิลลิโมล
ต่อกรัมของอัลจิเนตเพื่อให้ Alg-N หรือ Alg-T ตามลำดับ การมีเพศสัมพันธ์ reactionwas
กวนที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 24 ชั่วโมงหลังจากที่เกิดปฏิกิริยาถูกดับด้วย
ไฮดรอกซิ (Sigma-Aldrich) และ dialyzed ใน 12e14 kDa MWCO ท่อล้างไต
(Spectrum Labs) เป็นเวลา 4 วันกับการไล่ระดับสีเกลือลดลงจาก 150 มิลลิ 0 มิลลิ
โซเดียมคลอไรด์ใน diH2O บริสุทธิ์ Alg-N และโพลิเมอร์ Alg-T ได้รับการรักษาที่มีการเปิดใช้งาน
ถ่านกรองผ่านการฆ่าเชื้อ (0.22 มม) และแห้ง นี้ส่งผลให้บริสุทธิ์ Alg-N
หรือโพลีเมอ Alg-T ที่มีระดับ 5% ของการทดแทนของที่มีกรดคาร์บอกซิ
กลุ่มอัลจิเนต (รูป. S-1).
2.3 การเตรียมและลักษณะของไฮโดรเจลอัลจิเนตคลิก
คลิกไฮโดรเจลอัลจิเนตที่ถูกจัดทำขึ้นโดยครั้งแรกที่แยกละลาย freezedried
Alg-N และโพลิเมอร์ Alg-T กับความเข้มข้นที่ต้องการสุดท้าย (2e4% w / v) ใน Dulbecco ของ
อีเกิลดัดแปลงกลาง (DMEM; Gibco) สำหรับจลนศาสตร์เจวัด
Alg-N และ Alg-T โซลูชั่นลิเมอร์ผสมในอัตราส่วนที่ต้องการ (เช่น
0.5e4: 1 N: T) และปิเปตโดยตรงไปยังด้านล่างของแผ่น TA เครื่องมือ ARG2
rheometer พร้อมกับ 8 mmflat จานบน เรขาคณิต เย็น Peltier ถูกนำมาใช้
ในการควบคุมอุณหภูมิที่อุณหภูมิขึ้นอยู่กับการทดลองและน้ำมันแร่
ถูกนำไปใช้เจลรอบเพื่อป้องกันไม่ให้ไฮโดรเจลแห้งในระหว่างการทดสอบ.
ตัวอย่างไฮโดรเจลถูกยัดเยียดให้สายพันธุ์ที่ 1% ณ วันที่ 1 เฮิร์ตซ์และการจัดเก็บข้อมูลและการสูญเสีย
โมดูล (G0 และ G00) ได้รับการตรวจสอบ 4 ชั่วโมง สำหรับการตรวจวัดโมดูลัสของยัง
คลิกไฮโดรเจลอัลจิเนตที่มีอยู่ภายใต้แผ่นกระจก siliconized (Sigmacote;
Sigma-Aldrich) 2 มม spacers หลังจาก 2 ชั่วโมงของการเชื่อมขวางที่อุณหภูมิห้อง
ดิสก์รูปทรงกระบอกที่ถูกเจาะโดยใช้ 8 มมหมัดเนื้อเยื่อย้ายไป DMEM,
บวมและเพื่อความสมดุลเป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส ขนาดตัวอย่างบวมไฮโดรเจล
ที่ถูกวัดโดยใช้เครื่องวัดเส้นผ่าศูนย์กลางสำหรับปริมาตรการวัดอัตราการบวมและจากนั้น
ภายใต้การทดสอบแรงอัดไร้ข้อ จำกัด (1 มิลลิเมตร / นาที) โดยใช้โหลดเซลล์ 10 N กับ
พรีโหลดไม่มี (บริษัท อินสตรอนรุ่น 3342) โมดูลัสของหนุ่มอีที่คำนวณได้เป็น
ความชันของเส้นตรงส่วน (ตอนแรก 10%) ของความเครียดกับเส้นโค้งความเครียด.
2.4 โพสต์เจ photoreaction thiol-ene บนไฮโดรเจลอัลจิเนตคลิก
คลิกไฮโดรเจลอัลจิเนตได้ทำตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (2% w / v, N: T ¼ 2)
แล้วกาวเซลล์ CGGGGRGDSP เปปไทด์ (Peptide2.0) วิธีการแก้ปัญหาที่ 0.2 หรือ 2 มิลลิ
ที่มี 0.5% w / photoinitiator โวลต์ (Irgacure 2959; Sigma-Aldrich) ได้รับการปิเปตใน
ด้านบนและเจลที่ถูกปกคลุมด้วยกระจก coverslip เจลที่ได้รับการฉายรังสีที่ 365 นาโนเมตร
เป็นเวลา 60 วินาทีที่ 10 mW / cm2 เจลล้างหลายครั้งด้วย DMEM ที่จะลบ
photoinitiator ส่วนเกินและเปปไทด์ unreacted และบวมเพื่อความสมดุลที่ 37 องศาเซลเซียส
ก่อนที่จะเพาะเซลล์.
2.5 EGFP วัฒนธรรม 3T3 เซลล์
NIH 3T3 (ATCC) เซลล์ transduced กับ lentivirus ผลิตจาก EGFPcontaining
lentiviral เวกเตอร์ (pLCAG EGFP, ห้องปฏิบัติการ Inder Verma, พลาสมิด Addgene
14,857) [33] และได้รับการคัดเลือกเป็นเวลา 7 วันใน 1 มิลลิกรัม / มิลลิลิตร puromycin dihydrochloride
(เมอร์ค ค) EGFP-แสดง 3T3 เซลล์ fibroblast เลี้ยงใน DMEM
เสริมด้วย 10% (v / v) ซีรั่มของทารกในครรภ์ลูกวัว 100 penicillin U / มิลลิลิตรและ 100 มิลลิกรัม / มิลลิลิตร
streptomycin (Gibco) ที่ 37 องศาเซลเซียสในสภาพแวดล้อมที่ CO2 5% เซลล์ที่ถูก passaged
ประมาณสองครั้งต่อสัปดาห์.
2.6 การยึดเกาะของเซลล์
สำหรับการศึกษาการยึดเกาะของเซลล์แผ่นไฮโดรเจลคลิกอัลจิเนตมีการแก้ไขด้วย
เปปไทด์การยึดเกาะของเซลล์ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น 6 มิลลิเมตรดิสก์ถูกชกที่วางไว้ใน
DMEM ล้างหลายครั้งและบวมเป็นเวลา 4 ชั่วโมงก่อนที่จะมีการเพาะเซลล์ที่
5? 104 เซลล์ / มิลลิลิตรที่ระดับความลึกประมาณ 1mmabove พื้นผิวของเจล เซลล์
ที่ได้รับ 24 ชั่วโมงที่จะปฏิบัติตามและการแพร่กระจายและการมองเห็นแล้วผ่านการเรืองแสง EGFP
ใช้กล้องจุลทรรศน์ epifluorescence ภาพ EGFP ถูกนำมาใช้เพื่อวัดปริมาณเซลล์ทั้งหมด
ในพื้นที่โดยใช้ซอฟแวร์ ImageJ หลังจาก 3 วันของวัฒนธรรมเซลล์ได้รับการแก้ไขและการใช้สี
ของ Alexa Fluor 594 phalloidin (วัดระดับโมเลกุล) และ Hoescht 33342 (Molecular
Probes) เพื่อให้มองเห็นไส้ F-โปรตีนและนิวเคลียสตามลำดับ จะเห็นภาพการตายของเซลล์,
เจลถูกบ่มเป็นเวลา 20 นาทีกับ 4 มิลลิ ethidium homodimer-1 (Molecular
Probes) วิธีการแก้ปัญหาในการแฮงค์ส Buffered น้ำเกลือ (HBSS) และถ่ายภาพโดยใช้
กล้องจุลทรรศน์ epifluorescence.
2.7 ห่อหุ้มเซลล์
สำหรับการศึกษาการห่อหุ้มเซลล์ Alg-N โพลิเมอร์มีการแก้ไขจะมีประมาณ
20 กาวเซลล์ GGGGRGDSP เปปไทด์ (Peptide2.0) ต่อห่วงโซ่อัลจิเนตเป็น
อธิบายไว้ก่อนหน้า [17] 600 มิลลิเมตรคลิกอัลจิเนตไฮโดรเจลที่ 2% w / v, N: T ¼ 1
จากนั้นก็ทำให้มีเซลล์ที่ 3 หรือไม่? 106 เซลล์ / มิลลิลิตร Ionically ไฮโดรเจลเชื่อมขวาง
ได้จัดทำในทำนองเดียวกันที่ 2% w / v โดยใช้ความหนาแน่นของเซลล์เดียวกันและกระดูกสันหลัง RGD
ดัดแปลงโพลิเมอร์ Alg-N สารละลาย CaSO4 (0.21 กรัม CaSO4 / mL ddH2O) ที่เข้มข้นสุดท้าย
2% w / v ถูกใช้ในการ Crosslink ตัวอย่างไฮโดรเจลเชื่อมขวาง ionically
เพื่อให้ตรงกับคุณสมบัติทางกลของทั้งสองพื้นผิวอย่างใกล้ชิดในฐานะ
ที่เป็นไปได้ เพื่อลดเวลาที่เซลล์ไม่ได้มีการเข้าถึงสื่อวัฒนธรรม
เจลได้รับอนุญาตให้ Crosslink ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 1 ชั่วโมงหลังจากที่ 6 มมดิสก์
การแปล กรุณารอสักครู่..
( NHS ; ซิกม่า Aldrich ) และ 1-ethyl-3 - ( 3-dimethylaminopropyl ) - carbodiimide ไฮโดรคลอไรด์
( EDC ; ซิกม่า Aldrich ) ถูกเพิ่มใน 5 ฟันกรามส่วนเกินของกรดคาร์บอกซิลิก
กลุ่มอัลจิเนต . ให้ Norbornene หรือเตตร้าซีนก็เพิ่ม 1 มิลลิโมลต่อกรัม อัลจิเนต
ให้ alg-n หรือ alg-t ตามลำดับ การมีเพศสัมพันธ์พบว่า
กวนที่อุณหภูมิห้องนาน 24 ชั่วโมงหลังจากที่ปฏิกิริยาก็ดับด้วย
มีน ( ซิกม่า Aldrich ) และผ่านในท่อไต mwco 12e14 )
( สเปกตรัม Labs ) 4 วันกับการลดเกลือไล่ระดับจาก 150 mm 0 mm
เกลือโซเดียมคลอไรด์ใน dih2o นำ alg-n alg-t โพลิเมอร์และได้รับการรักษาด้วยสาร
ถ่านกรอง ( 0.22 มม. ) ปลอดเชื้อ และแห้ง . นี้ส่งผลในการ alg-n
บริสุทธิ์หรือ alg-t พอลิเมอร์ด้วย 5 % ระดับการแทนที่ของของกรดคาร์บอกซิลิก
กลุ่มของอัลจิเนต ( ไม่ที่สุด )
2.3 การเตรียมและศึกษาคุณลักษณะของอัลจิเนตเจลเจล
คลิกคลิก เตรียมแยกละลายฟรีซดรายแรกและสุดท้าย
alg-n alg-t พอลิเมอร์ความเข้มข้นตามต้องการ ( 2e4 % w / v ) ในดัลเบโค่ของ
แก้ไขนกอินทรีขนาดกลาง ( dmem ; gibco )สำหรับการวัดแบบเจลาติน
alg-n , และโซลูชั่น alg-t พอลิเมอร์ผสมที่อัตราส่วนที่ต้องการ ( เช่น
0.5e4:1 N : t ) และโดยตรง pipetted บนจานของด้านล่างค่า
arg2 เครื่องมือทาพร้อมกับ 8 mmflat บนจานรูปทรงเรขาคณิต เป็นเย็น Peltier ใช้
เพื่อควบคุมอุณหภูมิขึ้นอยู่กับอุณหภูมิการทดลองและ
น้ำมันแร่ใช้เจลรอบนอกเพื่อป้องกันเจลแห้งในระหว่างการทดสอบ .
ตัวอย่างเจลถูก 1 % สายพันธุ์ที่ 1 Hz , และการจัดเก็บและการสูญเสียเส้นใย ( G0
และถูก g00 ) 4 ชั่วโมง สำหรับค่าโมดูลัสของยังวัด
คลิกแอลเจลขึ้น ภายใต้แผ่นแก้ว siliconized ( sigmacote ;
ซิกม่า Aldrich ) กับ 2 mm spacers .หลังจาก 2 ชั่วโมงของการทำปฏิกิริยาที่อุณหภูมิ ห้อง ถูกชก
ทรงกระบอกดิสก์โดยใช้ 8 มม. ตัดเจาะ , ย้ายไป dmem
, และบวมให้สมดุลเป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 C บวม เจล ขนาดวัดเส้นผ่าศูนย์กลางตัวอย่าง
ใช้สำหรับวัดอัตราส่วนการบวมปริมาตรแล้ว
ภายใต้การทดสอบแรงอัดทิศทางเดียว ( 1 มม. นาที ) การใช้ 10 n เซลล์กับ
โหลดไม่โหลด ( Instron แบบ 3342 ) สาวัส , E , คำนวณตามความชันของเส้นตรง
ส่วนแรก ( 10% ) ของความเครียดและความเครียดเส้นโค้ง
2.4 . โพสต์ใน photoreaction บนคลิกเจลาตินขนาดแอลเจล
คลิกแอลเจลได้ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( 2 % w / v , N : T
¼ 2 ) แล้วเซลล์กาว cggggrgdsp เปปไทด์ ( peptide2.0 ) โซลูชั่นที่ 0.2 มม. หรือ 2
) 05 % W / V photoinitiator ( 2 , 959 irgacure ; ซิกม่า Aldrich ) คือ pipetted บน
ด้านบนและเจลถูกปกคลุมด้วยปิดสไลด์แก้ว เจลคือการฉายรังสีที่ 365 nm
60 s 10 mW / cm2 เป็นเจลล้างหลายครั้งกับ dmem เอา
photoinitiator ส่วนเกินและเปปไทด์เข้าสู่และบวมให้สมดุลที่อุณหภูมิ 37 C
ก่อนเพาะกับเซลล์
2.5 egfp 3T3 เซลล์
NIH 3T3 ( ATCC ) เซลล์มี transduced กับเลนติไวรัสที่ผลิตจาก egfpcontaining
lentiviral เวกเตอร์ ( plcag egfp สังกัด verma , Lab , addgene พลาสมิด
14857 ) [ 33 ] และได้ถูกเลือกสำหรับ 7 วันใน 1 mg / ml puromycin :
( EMD มิลลิ ) egfp แสดง 3T3 เซลล์เนื้อเยื่อเกี่ยวพันเพาะเลี้ยงใน dmem
ผสม 10% ( v / v ) ของวัวเลือด 100 U / ml เพนนิซิลลิน และ 100 มก. / มล.
สเตรปโตมัยซิน ( gibco ) ที่อุณหภูมิ 37 C ในบรรยากาศคาร์บอนไดออกไซด์ 5 เปอร์เซ็นต์ เซลล์มี passaged
ประมาณสองครั้งต่อสัปดาห์ .
2.6 การยึดเกาะเซลล์ยึดเกาะเซลล์
ศึกษาแผ่นคลิกเจลแอลดัดแปลงกับ
เซลล์ยึดเกาะเปปตามที่อธิบายไว้ข้างต้น 6 ดิสก์มม. ถูกชก อยู่
dmem ล้างหลายๆครั้งและบวมสำหรับ 4 ชั่วโมง ก่อนเพาะกับเซลล์ที่
5 104 เซลล์ / มล. ที่ความลึกประมาณ 1mmabove พื้นผิวของเจล เซลล์
ได้รับ 24 ชั่วโมง การยึดติด และแพร่กระจาย และมองเห็นผ่านการใช้ epifluorescence
egfp กล้องจุลทรรศน์ egfp ภาพเพื่อใช้วัดปริมาณพื้นที่เซลล์
ทั้งหมดใช้โปรแกรม ImageJ . หลังจาก 3 วันของวัฒนธรรม , เซลล์ถูกกำหนดและเปื้อนใช้
Alexa Fluor 594 phalloidin ( โมเลกุลโพรบ ) และ hoescht 33342 ( โมเลกุล
probes ) เห็นภาพ f-actin เส้นใยและนิวเคลียส ตามลำดับ เห็นภาพการตายของเซลล์
เจลถูกบ่มนาน 20 นาที กับ 4 มม. คู่ homodimer-1 ( โมเลกุล
) ) โซลูชั่นในแฮงค์ในน้ำเกลือ ( hbss ) และภาพลักษณ์ของการใช้กล้องจุลทรรศน์ epifluorescence
.
2.7 . เซลล์ห่อหุ้ม
สำหรับเซลล์ การศึกษา alg-n โพลีเมอร์ดัดแปลง มีประมาณ 20 ggggrgdsp
เซลล์กาวเปปไทด์ ( peptide2.0 ) ต่ออัลโซ่เป็น
ก่อนหน้านี้อธิบาย [ 17 ] 600 มม. หนาคลิกแอลเจล 2 % w / v , N : t ¼ 1
) จึงทำให้เซลล์ที่ประกอบด้วย 3 106 เซลล์ / มล. เจล
ionically น้ำหนักเป็นเหมือนกับเตรียมไว้ที่ 2 % W / V โดยใช้ความหนาแน่นเซลล์เดียวกัน และกระดูกสันหลัง rgd
alg-n โพลีเมอร์ดัดแปลง มีการระเบิดแรง ( 0.21 กรัม / มิลลิลิตรการระเบิด ddh2o ) ที่ความเข้มข้นสุดท้าย 2
% W / V ใช้เครื่องไฮโดรเจลที่ ionically Crosslink ตัวอย่าง
เพื่อให้ตรงกับคุณสมบัติเชิงกลของแผ่นฟิล์มสองอย่างใกล้ชิด เช่นเดียวกับ
ที่สุดเพื่อลดเวลาที่เซลล์ไม่ได้มีการเข้าถึงสื่อวัฒนธรรม
เจลได้ Crosslink ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 1 ชั่วโมง หลังจากนั้น 6 ดิสก์มม.
( EDC ; ซิกม่า Aldrich ) ถูกเพิ่มใน 5 ฟันกรามส่วนเกินของกรดคาร์บอกซิลิก
กลุ่มอัลจิเนต . ให้ Norbornene หรือเตตร้าซีนก็เพิ่ม 1 มิลลิโมลต่อกรัม อัลจิเนต
ให้ alg-n หรือ alg-t ตามลำดับ การมีเพศสัมพันธ์พบว่า
กวนที่อุณหภูมิห้องนาน 24 ชั่วโมงหลังจากที่ปฏิกิริยาก็ดับด้วย
มีน ( ซิกม่า Aldrich ) และผ่านในท่อไต mwco 12e14 )
( สเปกตรัม Labs ) 4 วันกับการลดเกลือไล่ระดับจาก 150 mm 0 mm
เกลือโซเดียมคลอไรด์ใน dih2o นำ alg-n alg-t โพลิเมอร์และได้รับการรักษาด้วยสาร
ถ่านกรอง ( 0.22 มม. ) ปลอดเชื้อ และแห้ง . นี้ส่งผลในการ alg-n
บริสุทธิ์หรือ alg-t พอลิเมอร์ด้วย 5 % ระดับการแทนที่ของของกรดคาร์บอกซิลิก
กลุ่มของอัลจิเนต ( ไม่ที่สุด )
2.3 การเตรียมและศึกษาคุณลักษณะของอัลจิเนตเจลเจล
คลิกคลิก เตรียมแยกละลายฟรีซดรายแรกและสุดท้าย
alg-n alg-t พอลิเมอร์ความเข้มข้นตามต้องการ ( 2e4 % w / v ) ในดัลเบโค่ของ
แก้ไขนกอินทรีขนาดกลาง ( dmem ; gibco )สำหรับการวัดแบบเจลาติน
alg-n , และโซลูชั่น alg-t พอลิเมอร์ผสมที่อัตราส่วนที่ต้องการ ( เช่น
0.5e4:1 N : t ) และโดยตรง pipetted บนจานของด้านล่างค่า
arg2 เครื่องมือทาพร้อมกับ 8 mmflat บนจานรูปทรงเรขาคณิต เป็นเย็น Peltier ใช้
เพื่อควบคุมอุณหภูมิขึ้นอยู่กับอุณหภูมิการทดลองและ
น้ำมันแร่ใช้เจลรอบนอกเพื่อป้องกันเจลแห้งในระหว่างการทดสอบ .
ตัวอย่างเจลถูก 1 % สายพันธุ์ที่ 1 Hz , และการจัดเก็บและการสูญเสียเส้นใย ( G0
และถูก g00 ) 4 ชั่วโมง สำหรับค่าโมดูลัสของยังวัด
คลิกแอลเจลขึ้น ภายใต้แผ่นแก้ว siliconized ( sigmacote ;
ซิกม่า Aldrich ) กับ 2 mm spacers .หลังจาก 2 ชั่วโมงของการทำปฏิกิริยาที่อุณหภูมิ ห้อง ถูกชก
ทรงกระบอกดิสก์โดยใช้ 8 มม. ตัดเจาะ , ย้ายไป dmem
, และบวมให้สมดุลเป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 C บวม เจล ขนาดวัดเส้นผ่าศูนย์กลางตัวอย่าง
ใช้สำหรับวัดอัตราส่วนการบวมปริมาตรแล้ว
ภายใต้การทดสอบแรงอัดทิศทางเดียว ( 1 มม. นาที ) การใช้ 10 n เซลล์กับ
โหลดไม่โหลด ( Instron แบบ 3342 ) สาวัส , E , คำนวณตามความชันของเส้นตรง
ส่วนแรก ( 10% ) ของความเครียดและความเครียดเส้นโค้ง
2.4 . โพสต์ใน photoreaction บนคลิกเจลาตินขนาดแอลเจล
คลิกแอลเจลได้ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( 2 % w / v , N : T
¼ 2 ) แล้วเซลล์กาว cggggrgdsp เปปไทด์ ( peptide2.0 ) โซลูชั่นที่ 0.2 มม. หรือ 2
) 05 % W / V photoinitiator ( 2 , 959 irgacure ; ซิกม่า Aldrich ) คือ pipetted บน
ด้านบนและเจลถูกปกคลุมด้วยปิดสไลด์แก้ว เจลคือการฉายรังสีที่ 365 nm
60 s 10 mW / cm2 เป็นเจลล้างหลายครั้งกับ dmem เอา
photoinitiator ส่วนเกินและเปปไทด์เข้าสู่และบวมให้สมดุลที่อุณหภูมิ 37 C
ก่อนเพาะกับเซลล์
2.5 egfp 3T3 เซลล์
NIH 3T3 ( ATCC ) เซลล์มี transduced กับเลนติไวรัสที่ผลิตจาก egfpcontaining
lentiviral เวกเตอร์ ( plcag egfp สังกัด verma , Lab , addgene พลาสมิด
14857 ) [ 33 ] และได้ถูกเลือกสำหรับ 7 วันใน 1 mg / ml puromycin :
( EMD มิลลิ ) egfp แสดง 3T3 เซลล์เนื้อเยื่อเกี่ยวพันเพาะเลี้ยงใน dmem
ผสม 10% ( v / v ) ของวัวเลือด 100 U / ml เพนนิซิลลิน และ 100 มก. / มล.
สเตรปโตมัยซิน ( gibco ) ที่อุณหภูมิ 37 C ในบรรยากาศคาร์บอนไดออกไซด์ 5 เปอร์เซ็นต์ เซลล์มี passaged
ประมาณสองครั้งต่อสัปดาห์ .
2.6 การยึดเกาะเซลล์ยึดเกาะเซลล์
ศึกษาแผ่นคลิกเจลแอลดัดแปลงกับ
เซลล์ยึดเกาะเปปตามที่อธิบายไว้ข้างต้น 6 ดิสก์มม. ถูกชก อยู่
dmem ล้างหลายๆครั้งและบวมสำหรับ 4 ชั่วโมง ก่อนเพาะกับเซลล์ที่
5 104 เซลล์ / มล. ที่ความลึกประมาณ 1mmabove พื้นผิวของเจล เซลล์
ได้รับ 24 ชั่วโมง การยึดติด และแพร่กระจาย และมองเห็นผ่านการใช้ epifluorescence
egfp กล้องจุลทรรศน์ egfp ภาพเพื่อใช้วัดปริมาณพื้นที่เซลล์
ทั้งหมดใช้โปรแกรม ImageJ . หลังจาก 3 วันของวัฒนธรรม , เซลล์ถูกกำหนดและเปื้อนใช้
Alexa Fluor 594 phalloidin ( โมเลกุลโพรบ ) และ hoescht 33342 ( โมเลกุล
probes ) เห็นภาพ f-actin เส้นใยและนิวเคลียส ตามลำดับ เห็นภาพการตายของเซลล์
เจลถูกบ่มนาน 20 นาที กับ 4 มม. คู่ homodimer-1 ( โมเลกุล
) ) โซลูชั่นในแฮงค์ในน้ำเกลือ ( hbss ) และภาพลักษณ์ของการใช้กล้องจุลทรรศน์ epifluorescence
.
2.7 . เซลล์ห่อหุ้ม
สำหรับเซลล์ การศึกษา alg-n โพลีเมอร์ดัดแปลง มีประมาณ 20 ggggrgdsp
เซลล์กาวเปปไทด์ ( peptide2.0 ) ต่ออัลโซ่เป็น
ก่อนหน้านี้อธิบาย [ 17 ] 600 มม. หนาคลิกแอลเจล 2 % w / v , N : t ¼ 1
) จึงทำให้เซลล์ที่ประกอบด้วย 3 106 เซลล์ / มล. เจล
ionically น้ำหนักเป็นเหมือนกับเตรียมไว้ที่ 2 % W / V โดยใช้ความหนาแน่นเซลล์เดียวกัน และกระดูกสันหลัง rgd
alg-n โพลีเมอร์ดัดแปลง มีการระเบิดแรง ( 0.21 กรัม / มิลลิลิตรการระเบิด ddh2o ) ที่ความเข้มข้นสุดท้าย 2
% W / V ใช้เครื่องไฮโดรเจลที่ ionically Crosslink ตัวอย่าง
เพื่อให้ตรงกับคุณสมบัติเชิงกลของแผ่นฟิล์มสองอย่างใกล้ชิด เช่นเดียวกับ
ที่สุดเพื่อลดเวลาที่เซลล์ไม่ได้มีการเข้าถึงสื่อวัฒนธรรม
เจลได้ Crosslink ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 1 ชั่วโมง หลังจากนั้น 6 ดิสก์มม.
การแปล กรุณารอสักครู่..
ภาษาอื่น ๆ
การสนับสนุนเครื่องมือแปลภาษา: กรีก, กันนาดา, กาลิเชียน, คลิงออน, คอร์สิกา, คาซัค, คาตาลัน, คินยารวันดา, คีร์กิซ, คุชราต, จอร์เจีย, จีน, จีนดั้งเดิม, ชวา, ชิเชวา, ซามัว, ซีบัวโน, ซุนดา, ซูลู, ญี่ปุ่น, ดัตช์, ตรวจหาภาษา, ตุรกี, ทมิฬ, ทาจิก, ทาทาร์, นอร์เวย์, บอสเนีย, บัลแกเรีย, บาสก์, ปัญจาป, ฝรั่งเศส, พาชตู, ฟริเชียน, ฟินแลนด์, ฟิลิปปินส์, ภาษาอินโดนีเซี, มองโกเลีย, มัลทีส, มาซีโดเนีย, มาราฐี, มาลากาซี, มาลายาลัม, มาเลย์, ม้ง, ยิดดิช, ยูเครน, รัสเซีย, ละติน, ลักเซมเบิร์ก, ลัตเวีย, ลาว, ลิทัวเนีย, สวาฮิลี, สวีเดน, สิงหล, สินธี, สเปน, สโลวัก, สโลวีเนีย, อังกฤษ, อัมฮาริก, อาร์เซอร์ไบจัน, อาร์เมเนีย, อาหรับ, อิกโบ, อิตาลี, อุยกูร์, อุสเบกิสถาน, อูรดู, ฮังการี, ฮัวซา, ฮาวาย, ฮินดี, ฮีบรู, เกลิกสกอต, เกาหลี, เขมร, เคิร์ด, เช็ก, เซอร์เบียน, เซโซโท, เดนมาร์ก, เตลูกู, เติร์กเมน, เนปาล, เบงกอล, เบลารุส, เปอร์เซีย, เมารี, เมียนมา (พม่า), เยอรมัน, เวลส์, เวียดนาม, เอสเปอแรนโต, เอสโทเนีย, เฮติครีโอล, แอฟริกา, แอลเบเนีย, โคซา, โครเอเชีย, โชนา, โซมาลี, โปรตุเกส, โปแลนด์, โยรูบา, โรมาเนีย, โอเดีย (โอริยา), ไทย, ไอซ์แลนด์, ไอร์แลนด์, การแปลภาษา.
- Father tlak to me stopped studying for 2
- I send you many kisses
- ใครจะกินละ
- มีสิ่งสกปรกมาก อาจทำให้การไหลของน้ำมันหล
- ห้ามใจเท่าไร
- In Bangkok at the same place.
- ถามใจคุนดูก่อนจะดีไหม
- can you get relationship with me
- Bluelans Women's Cosplay Wig Long Curly
- I dream of a twist
- cooperation
- ส่งรูปให้ดูได้ไหม
- แล้วเหลือช่องว่าง
- 3. Inspector Clouseau was ready to solve
- เกาะลังกาวี เกาะแห่งนี้เป็นที่รู้จักกันด
- Is this your first baby
- Amulet Thai Buddhas Gift box Sets 5 pcs.
- Uncle
- อาหารอร่อยไหม
- defeating
- เป็น
- ไม่ว่าฉันจะทำอะไรเธอมักจะเป็นกำลังใจให้ฉ
- Light
- If the film is actually 19
