2.14. Real time-reverse transcripti

2.14. Real time-reverse transcription PCR (qRT-PCR)
Real time reverse transcription-PCR (qRT-PCR) was performed to determine
mRNA levels of a number of cell cycle and apoptosis-related genes on the A431
and SK-MEL-28 cells subjected to the indicated treatments. Total cellular RNA
was isolated using TRIzol solution (Invitrogen, Australia) according to the manufacturer’s
instructions. The quality of RNA was determined using 1.2% formaldehyde–
agarose gel. The DNA contamination from RNA preparation was removed by using
Ambion TURBO DNA-free DNase treatment reagent (Applied Biosystems, Australia).
Reverse transcription was carried out with 1 lg of total RNA in a reaction volume of
20 ll using a High Capacity cDNA Reverse Transcription kit (Applied Biosystems,
Australia) following the manufacturer’s instructions. Real time PCR was carried
out in 20 ll of PCR mixture consisting of 10 ll of 2 GoTaq qPCR Master Mix
(Promega Corporation, Australia) and 10 ll of primers and 2 ll cDNA sample on a
Rotorgene 3000 Thermocycler (Corbett Life Science, Sydney, NSW, Australia). Each
sample was amplified in triplicate. The mRNA level of the beta-actin house keeping
gene was also determined by qRT-PCR in each cDNA sample to normalize the
expression of genes of interest (GOI). The primers used are listed in Table 1. The
PCR condition for each particular amplicon was optimized to establish a linear
relationship between threshold cycle (Ct) values and the input amount of cDNA
(a correlation coefficient >95%) and to achieve PCR efficiency around 100%
(± 10%). Cycling was followed by Melt Curve analysis to confirm the specificity ofthe PCR product. Quantitative analysis was performed using Q-Gene software (Simon,
2003). The expression of levels of GOI was normalized to the expression levels
of beta-actin, which exhibited comparable expression across different groups (data
not shown). The ratio of GOI/beta-actin was compared among samples, and the fold
change of GOI expression was obtained by setting the values from the untreated
cells to one.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.14 กลับเวลาจริง transcription PCR (qRT-PCR)
ทำเวลาจริงกลับ transcription-PCR (qRT-PCR) เพื่อกำหนด
ระดับ mRNA ของวงจรเซลล์และยีนที่เกี่ยวข้องกับการ apoptosis ใน A431
และ SK-เมล-28 เซลล์การรักษาที่ระบุ รวมเซลล์อาร์เอ็นเอ
ถูกแยกโดยใช้ TRIzol โซลูชั่น (Invitrogen ออสเตรเลีย) ตามของผู้ผลิต
คำแนะนำ กำหนดคุณภาพของอาร์เอ็นเอโดยใช้ฟอร์มาลดีไฮด์ 1.2% –
agarose เจ ปนดีเอ็นเออาร์เอ็นเอเตรียมถูกเอาออกโดย
รีเอเจนต์รักษา Ambion TURBO ดีเอ็นเอฟรี DNase (ใช้ Biosystems ออสเตรเลีย)
transcription กลับถูกดำเนินการกับ lg 1 ของอาร์เอ็นเอทั้งหมดในปฏิกิริยาปริมาณ
20 จะใช้ cDNA จุสูงชุดกลับ Transcription (Biosystems ใช้,
ออสเตรเลีย) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ทำ real time PCR
ออกใน 20 จะผสม PCR ประกอบด้วย 10 จะ qPCR GoTaq 2 หลักผสม
(Promega Corporation ออสเตรเลีย) และ 10 จะของไพรเมอร์และตัวอย่างของ cDNA จะ 2 บนการ
Thermocycler 3000 Rotorgene (คอร์เบตต์วิทยาศาสตร์ ซิดนีย์ นิวเซาธ์เวลส์ ออสเตรเลีย) แต่ละ
อย่างถูกขยายใน triplicate ระดับ mRNA ของแอกตินเบต้าสะอาด
ยังถูกกำหนด โดย qRT-PCR ในแต่ละตัวอย่าง cDNA ยีนจะทำให้ปกติการ
ของยีนที่น่าสนใจ (โกอี) ไพรเมอร์ที่ใช้แสดงในตารางที่ 1 ใน
PCR เงื่อนไขสำหรับแต่ละ amplicon เฉพาะถูกทำให้เหมาะจะสร้างเป็นเส้น
ความสัมพันธ์ระหว่างค่าขีดจำกัดรอบ (Ct) และยอดนำเข้าของ cDNA
(สัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ > 95%) และ เพื่อให้บรรลุประสิทธิภาพ PCR ประมาณ 100%
(± 10%) ขี่จักรยานได้ตาม ด้วยโค้งละลายวิเคราะห์ยืนยัน specificity ผลิตภัณฑ์ PCR ทำการวิเคราะห์เชิงปริมาณโดยใช้ซอฟต์แวร์ Q-ยีน (Simon,
2003) ค่าของระดับของโกอีได้ตามปกติระดับนิพจน์
ของเบต้าแอกติน ซึ่งจัดแสดงนิพจน์สามารถเปรียบเทียบระหว่างกลุ่มต่าง ๆ (ข้อมูล
ไม่แสดง) อัตราส่วนของโกอี/เบต้าแอกตินถูกเปรียบเทียบระหว่างตัวอย่าง และพับ
เปลี่ยนนิพจน์โกอีได้รับ โดยการตั้งค่าที่ไม่ถูกรักษาจาก
เซลล์หนึ่ง

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.14 ถอดความเวลาจริงกลับ PCR (qRT-PCR)
เวลาจริงกลับถอดความ-PCR (qRT-PCR) ได้รับการดำเนินการเพื่อตรวจสอบ
ระดับ mRNA ของจำนวนของวงจรของเซลล์และยีนที่เกี่ยวข้องกับการตายที่ A431
และ SK-MEL-28 เซลล์ที่อยู่ภายใต้ เพื่อการรักษาที่ระบุ อาร์เอ็นเอของเซลล์ทั้งหมด
ที่แยกได้ใช้วิธี Trizol (Invitrogen, ออสเตรเลีย) ตามที่ผู้ผลิตของ
คำแนะนำ คุณภาพของอาร์เอ็นเอที่ได้รับการกำหนดโดยใช้ 1.2% formaldehyde-
เจล agarose การปนเปื้อนดีเอ็นเอจากการเตรียมอาร์เอ็นเอจะถูกลบออกโดยใช้
Ambion TURBO ดีเอ็นเอฟรีเอเจนต์การรักษา DNase (Applied Biosystems, ออสเตรเลีย)
ถอดความย้อนกลับได้รับการดำเนินการกับ LG 1 ของอาร์เอ็นเอรวมปริมาณการเกิดปฏิกิริยาของ
20 LL ใช้ความจุสูง cDNA ย้อนกลับถอดความ ชุด (Applied Biosystems,
ออสเตรเลีย) ทำตามคำแนะนำของผู้ผลิต เรียลไทม์พีซีอาร์ได้รับการดำเนิน
การใน 20 LL ส่วนผสม PCR ซึ่งประกอบด้วย 10 LL 2? GoTaq? qPCR โทผสม
(Promega คอร์ปอเรชั่นออสเตรเลีย) และ 10 LL ของไพรเมอร์และตัวอย่าง cDNA 2 LL ใน
Rotorgene 3000 เครื่อง thermocycler (คอร์เบต Life Science, ซิดนีย์, ออสเตรเลีย) แต่ละ
ตัวอย่างถูกขยายในเพิ่มขึ้นสามเท่า ระดับ mRNA ของเบต้าโปรตีนแม่บ้าน
ยีนยังถูกกำหนดโดย qRT-PCR ในตัวอย่าง cDNA แต่ละที่จะปรับ
การแสดงออกของยีนที่น่าสนใจ (GOI) ไพรเมอร์ที่ใช้มีการระบุไว้ในตารางที่ 1
เงื่อนไข PCR สำหรับแต่ละ amplicon ถูกปรับให้เหมาะสมโดยเฉพาะอย่างยิ่งในการสร้างเส้น
ความสัมพันธ์ระหว่างวงจรเกณฑ์ (กะรัต) ค่านิยมและจำนวนเงินที่มีการป้อนข้อมูลของยีน
(ค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์> 95%) และเพื่อให้เกิดประสิทธิภาพ PCR รอบ 100%
(± 10%) การขี่จักรยานตามมาด้วยการวิเคราะห์โค้งละลายเพื่อยืนยันความจำเพาะ ofthe ผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ การวิเคราะห์เชิงปริมาณได้รับการดำเนินการโดยใช้ซอฟแวร์ Q-ยีน (ไซมอน,
2003) การแสดงออกของระดับของก้อยก็ปกติระดับการแสดงออก
ของเบต้าโปรตีนซึ่งแสดงผลการแสดงออกเปรียบเทียบระหว่างกลุ่มที่แตกต่างกัน (ข้อมูล
ไม่แสดง) อัตราส่วนของ GOI / เบต้าโปรตีนที่ได้รับการเปรียบเทียบกับกลุ่มตัวอย่างและพับ
การเปลี่ยนแปลงในการแสดงออก GOI ได้โดยการตั้งค่าที่ได้รับการรักษาจาก
เซลล์หนึ่ง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.14 . เวลาย้อนกลับ PCR ถอดความจริง ( ข้าพเจ้า PCR )
เวลาย้อนกลับ PCR ถอดความจริง ( ข้าพเจ้า PCR ) ได้ทำการศึกษาระดับ mRNA
ของวัฎจักรเซลล์เซลล์ที่เกี่ยวข้องและยีนในเซลล์และ a431
sk-mel-28 ต้องพบการรักษา
เซลล์อาร์เอ็นเอทั้งหมดได้ใช้ trizol โซลูชั่น ( Invitrogen , ออสเตรเลีย ) ตามคำแนะนำของ
ผู้ผลิตคุณภาพของอาร์เอ็นเอ ตั้งใจใช้ 1.2% ฟอร์มาลดีไฮด์–
เจล . ดีเอ็นเออาร์เอ็นเอจะถูกลบออกโดยการปนเปื้อนจากการใช้เทอร์โบ
ambion ดีเอ็นเอรักษาตรวจหา ADNase ฟรี Reagent ( Applied Biosystems ออสเตรเลีย )
ย้อนกลับถอดความได้ดำเนินการกับ LG ของ RNA ทั้งหมดในปฏิกิริยาปริมาณ
20 จะใช้วิธี reverse transcription ความจุสูงชุด ( Applied Biosystems
,ออสเตรเลีย ) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต เวลาจริงสามารถดำเนินการ
ใน 20 จะผสมซึ่งประกอบด้วย 10 จะ 2  gotaq  qpcr Master Mix
( promega Corporation , ออสเตรเลีย ) และ 10 จะไพรเมอร์ 2 จะ cDNA ตัวอย่างบน
rotorgene 3000 เทอร์มอไซเคล ์ ( Corbett ชีวิตวิทยาศาสตร์ , ซิดนีย์ , NSW , ออสเตรเลีย )
ตัวอย่างแต่ละของทั้งสามใบระดับ mRNA ของยีนเบต้าแอคตินบ้านรักษา
ยังกำหนดโดยวิธี PCR ในตัวอย่างที่ข้าพเจ้าแต่ละปกติ
การแสดงออกของยีนที่น่าสนใจ ( โกย ) ไพรเมอร์ที่ใช้อยู่ใน ตารางที่ 1
ภาพซึ่งแต่ละ และยังเหมาะที่จะสร้างความสัมพันธ์เชิงเส้นระหว่างวงจร
ธรณีประตู ( CT ) ค่านิยมและใส่ปริมาณ cDNA
( สัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ > 95% ) และเพื่อให้บรรลุประสิทธิภาพโดยรอบ 100 %
( ± 10% ) จักรยานตามละลายการวิเคราะห์ทางโค้งยืนยันความจำเพาะของวิธี PCR ผลิตภัณฑ์ การวิเคราะห์เชิงปริมาณโดยใช้ซอฟต์แวร์ q-gene ( ไซม่อน
2003 ) การแสดงออกของระดับของ กอยเป็นปกติต่อระดับการแสดงออกของเบต้าแอคติน
,ซึ่งมีการแสดงออกที่แตกต่างกัน ( ข้อมูลเปรียบเทียบในกลุ่ม
ไม่แสดง ) อัตราส่วนของ กอย / เบต้าแอคติน เปรียบเทียบระหว่างกลุ่มตัวอย่าง และพับ
เปลี่ยนการแสดงออกของ กอยได้โดยการตั้งค่าค่าจากเซลล์ดิบ

1 .