DiscussionOur goal is to develop ra

Discussion
Our goal is to develop rapid molecular diagnostic approaches to the identification of uropathogens involving techniques that can be applied in a variety of settings and platforms, including a point-of-care microfabricated device. To achieve this goal, the effects of time and temperature on the specificity of oligonucleotide probe binding to uropathogen 16S rDNA sequences were examined using both a rapid dot-blot hybridization method and a novel electrochemical sensor array platform. The rapid dot-blot hybridization method described here involves 10min each for the prehybridization, hybridization, and washing steps, or a total of only 30min for all three steps. In the standard dot-blot method, hybridization typically involves an overnight incubation. Our rapid approach demonstrates that if rRNA is used rather than PCR-generated rDNA, then a much shorter analytical time would be sufficient to generate a robust signal, allowing an approximately 24to 36-fold reduction in procedural time (from approximately 12–18h to 40min). The success of the rapid dot-blot method is critically dependent on probe characteristics. Oligonucleotide probes were designed by comparing the 16S gene sequences of eleven uropathogenic species to locate variable regions containing signature sequences for four uropathogens: E. coli, P. mirabilis, P. aeruginosa, and K. oxytoca. Probes were selected that contained at least Wve mismatches per 20bp region in each of the nontarget sequences. Probes with fewer than Wve mismatches per 20bp region were not considered robust, since they yielded false-positive results and therefore they were redesigned (data not shown). Probes with mismatches located in the center of the sequence had greater speciWcity than probes with mismatches concentrated at the ends. This degree of sequence mismatching was suYcient to obtain target speciWcity not only at 55°C but also in
the much less stringent condition of room temperature hybridization. The dot-blot experiments were informative regarding probe design, kinetics, and temperature-dependence of hybridization using a well-established technique. We examined whether the results of the rapid dot-blot hybridization studies could be applied to a novel electrochemical sensor array platform. There is enormous interest in development of DNA biosensors that are able to detect nucleic acid hybridization events without the need for target ampliWcation [8,20]. An electrochemical sensor provides instantaneous and quantitative readout of nucleic acid hybridization, which oVers tremendous advantages for clinical microbiology and genetic diagnostics. The sensor strategy combines approaches from diverse disciplines including microfabrication technology, self-assembled monolayer (SAM) generation, DNA/RNA hybridization, and enzyme signal ampliWcation. SAMs allow immobilization of biological molecules such as streptavidin onto microfabricated devices to provide surface functionalization

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

สนทนาเป้าหมายของเราคือการ พัฒนาอย่างรวดเร็วโมเลกุลวินิจฉัยแนวรหัสของ uropathogens ที่เกี่ยวข้องกับเทคนิคต่าง ๆ ที่สามารถใช้ในหลากหลายแพลตฟอร์ม รวมทั้งอุปกรณ์จุดดูแล microfabricated และการตั้งค่า เพื่อให้บรรลุเป้าหมายนี้ ผลของอุณหภูมิและเวลาการ specificity ของโพรบ oligonucleotide ผูกเพื่อลำดับ uropathogen 16S rDNA ถูกตรวจสอบโดยใช้วิธีการ hybridization อย่างรวดเร็วจุดคืนในตาและแพลตฟอร์มเรย์เซนเซอร์ไฟฟ้านวนิยาย วิธีการ hybridization อย่างรวดเร็วจุดคืนในตาที่อธิบายไว้ที่นี่เกี่ยวข้องกับ 10 นาทีแต่ละ prehybridization ที่ hybridization และขั้นตอนการซักผ้า หรือจำนวนเพียง 30 นาทีสำหรับขั้นตอนที่สามทั้งหมด ในวิธีมาตรฐาน dot-คืนในตา hybridization เกี่ยวข้องกับการฟักตัวค้างคืนโดยทั่วไป วิธีการของเราอย่างรวดเร็วแสดงให้เห็นว่า ถ้าใช้ rRNA แทน rDNA สร้าง PCR แล้วเวลาวิเคราะห์สั้นกว่าจะเพียงพอที่จะสร้างสัญญาณที่แข็งแกร่ง ช่วยให้การประมาณ 24to 36-fold ลดขั้นตอนเวลา (ประมาณ 12 – 18 h ไป 40 นาที) ความสำเร็จของวิธีการอย่างรวดเร็วจุดคืนในตาเหลือขึ้นอยู่กับลักษณะของโพรบได้ คลิปปากตะเข้ oligonucleotide ถูกออกแบบ โดยการเปรียบเทียบลำดับยีน 16S พันธุ์ uropathogenic สิบเอ็ดเพื่อค้นหาตัวแปรภูมิภาคที่ประกอบด้วยลายเซ็นลำดับสำหรับ uropathogens 4: E. coli, P. mirabilis, P. aeruginosa และคุณ oxytoca คลิปปากตะเข้ได้เลือกที่มีอยู่น้อย Wve mismatches ต่อภูมิภาค 20bp ในลำดับที่ nontarget คลิปปากตะเข้กับน้อยกว่า mismatches Wve ต่อภูมิภาค 20bp ได้ไม่ถือแข็งแกร่ง เนื่องจากพวกเขาหาผลบวกเท็จ และดังนั้น พวกเขาใหม่ (ข้อมูลไม่แสดง) คลิปปากตะเข้กับ mismatches อยู่ในลำดับที่มี speciWcity สูงกว่าคลิปปากตะเข้กับ mismatches เข้มข้นลง ระดับของลำดับไม่ถูก suYcient รับ speciWcity เป้าหมายไม่เพียงแต่ ที่ 55° C แต่ยังอยู่ในเงื่อนไขที่เข้มงวดมากน้อยของ hybridization อุณหภูมิห้อง ทดลองจุดคืนในตามีข้อมูลเกี่ยวกับออกแบบโพรบ จลนพลศาสตร์ และอุณหภูมิการพึ่งพาของ hybridization ใช้เทคนิคที่ดีขึ้น เราตรวจสอบว่าผลการศึกษาการ hybridization อย่างรวดเร็วจุดคืนในตาสามารถใช้ได้กับแพลตฟอร์มเซนเซอร์ไฟฟ้านวนิยายอาร์เรย์ มีดอกเบี้ยมหาศาลในการพัฒนาของ biosensors ดีเอ็นเอที่สามารถตรวจสอบเหตุการณ์การ hybridization กรดนิวคลีอิกโดยไม่ต้อง ampliWcation เป้าหมาย [8,20] การเซ็นเซอร์ไฟฟ้าให้ readout กำลัง และเชิงปริมาณของกรดนิวคลีอิก hybridization ไกลซึ่งประโยชน์มหาศาลสำหรับจุลชีววิทยาทางคลินิกและการวินิจฉัยทางพันธุกรรม กลยุทธ์การเซ็นเซอร์รวมแนวทางจากหลากหลายสาขาวิชารวมทั้งเทคโนโลยี microfabrication รุ่น monolayer ประกอบ (SAM) hybridization ดีเอ็นเอ/อาร์เอ็นเอ และเอนไซม์สัญญาณ ampliWcation SAMs ให้ตรึงโปโมเลกุลชีวภาพเช่น streptavidin บนอุปกรณ์ microfabricated ให้ผิว functionalization

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

คำอธิบายเป้าหมายของเราคือการพัฒนาวิธีการวินิจฉัยอย่างรวดเร็วโมเลกุลบัตรประจำตัวของ uropathogens ที่เกี่ยวข้องกับเทคนิคที่สามารถนำมาใช้ในความหลากหลายของการตั้งค่าและแพลตฟอร์มรวมทั้งอุปกรณ์ microfabricated จุดของการดูแล
เพื่อให้บรรลุเป้าหมายนี้ผลกระทบของเวลาและอุณหภูมิที่มีความจำเพาะของการสอบสวน oligonucleotide ผูกพันที่จะ uropathogen 16S rDNA ลำดับมีการตรวจสอบโดยใช้ทั้งวิธีการผสมพันธุ์ dot-blot รวดเร็วและเซ็นเซอร์ไฟฟ้านวนิยายแพลตฟอร์มอาร์เรย์ วิธีการผสมพันธุ์ dot-blot อย่างรวดเร็วอธิบายไว้ที่นี่ที่เกี่ยวข้องกับการ 10min แต่ละ prehybridization ที่ผสมพันธุ์และขั้นตอนการซักผ้าหรือรวมเพียง 30 นาทีสำหรับทั้งสามขั้นตอน ในวิธี dot-blot มาตรฐานการผสมพันธุ์มักจะเกี่ยวข้องกับการบ่มในชั่วข้ามคืน วิธีการอย่างรวดเร็วของเราแสดงให้เห็นว่าถ้า rRNA จะใช้มากกว่า PCR-สร้าง rDNA แล้วเป็นเวลาที่สั้นมากในการวิเคราะห์จะเพียงพอที่จะสร้างสัญญาณที่มีประสิทธิภาพที่ช่วยให้การลดลงประมาณ 24to 36 เท่าในเวลาขั้นตอน (จากประมาณ 12-18h เพื่อ 40min ) ความสำเร็จของวิธี dot-blot อย่างรวดเร็วเป็นอย่างยิ่งขึ้นอยู่กับลักษณะการสอบสวน ยานสำรวจ oligonucleotide ได้รับการออกแบบโดยการเปรียบเทียบลำดับยีน 16S สิบเอ็ดสายพันธุ์ uropathogenic ภูมิภาคเพื่อหาตัวแปรที่มีลายเซ็นลำดับสี่ uropathogens: เชื้อ E. coli, P. mirabilis พี aeruginosa และเค oxytoca พร็อบได้รับการคัดเลือกที่มีไม่ตรงกันที่ Wve น้อยต่อภูมิภาค 20bp ในแต่ละลำดับ nontarget พร็อบที่มีน้อยกว่าที่ไม่ตรงกัน Wve ต่อภูมิภาค 20bp ไม่ได้พิจารณาที่แข็งแกร่งเนื่องจากพวกเขาส่งผลบวกเท็จและดังนั้นพวกเขาได้รับการออกแบบใหม่ (ไม่ได้แสดงข้อมูล) พร็อบที่ไม่ตรงกันกับตั้งอยู่ในใจกลางของลำดับมี speciWcity มากกว่าฟิวส์ไม่ตรงกันกับความเข้มข้นที่ปลาย ระดับของ mismatching ลำดับนี้เป็น suYcient ที่จะได้รับ speciWcity เป้าหมายไม่เพียง แต่ที่ 55 องศาเซลเซียส
แต่ยังอยู่ในสภาพที่เข้มงวดมากน้อยของการผสมข้ามพันธุ์อุณหภูมิห้อง การทดลองจุดลบเป็นข้อมูลเกี่ยวกับการออกแบบการสอบสวนจลนพลศาสตร์และอุณหภูมิพึ่งพาอาศัยกันของพันธุ์โดยใช้เทคนิคที่ดีขึ้น เราตรวจสอบว่าผลของการศึกษาอย่างรวดเร็วไฮบริดอทหยดสามารถนำไปใช้เซ็นเซอร์ไฟฟ้านวนิยายแพลตฟอร์มอาร์เรย์ มีความสนใจอย่างมากในการพัฒนาของไบโอเซนเซอร์ดีเอ็นเอที่มีความสามารถในการตรวจสอบเหตุการณ์ที่เกิดการผสมข้ามพันธุ์กรดนิวคลีโดยไม่จำเป็นต้องเป้าหมาย ampliWcation เมื่อ [8,20] เซ็นเซอร์ไฟฟ้าให้อ่านข้อมูลที่รวดเร็วและเชิงปริมาณของกรดนิวคลีผสมพันธุ์ซึ่งแจ็คเก็ตได้เปรียบอย่างมากสำหรับจุลชีววิทยาคลินิกและการวินิจฉัยโรคทางพันธุกรรม กลยุทธ์วิธีการเซ็นเซอร์รวมจากสาขาวิชาที่หลากหลายรวมทั้งเทคโนโลยีชิ้นงานขนาดเล็ก, monolayer ตนเองประกอบ (SAM) รุ่นไฮบริดีเอ็นเอ / อาร์เอ็นเอและเอนไซม์สัญญาณ ampliWcation SAMs อนุญาตให้มีการตรึงของโมเลกุลทางชีวภาพเช่น streptavidin ลงในอุปกรณ์ microfabricated เพื่อให้พื้นผิว functionalization

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การอภิปราย
เป้าหมายของเราคือการพัฒนาอย่างรวดเร็วของการวินิจฉัย แนวทางการกำหนด uropathogens เกี่ยวข้องกับเทคนิคที่สามารถใช้ในความหลากหลายของการตั้งค่าและแพลตฟอร์ม รวมถึงจุดของอุปกรณ์ microfabricated ดูแล เพื่อให้บรรลุเป้าหมายนี้ผลของอุณหภูมิและเวลาที่เฉพาะเจาะจงของโพรบ ซึ่งผูกพันกับ uropathogen 16S rDNA ลำดับมีการใช้ทั้งสองวิธี dot blot hybridization อย่างรวดเร็วและนวนิยายเซนเซอร์ไฟฟ้าเคมีแพลตฟอร์ม blot hybridization จุดอย่างรวดเร็ววิธีการอธิบายไว้ที่นี่เกี่ยวข้องกับวันละ prehybridization hybridization และซักผ้า , ขั้นตอนหรือทั้งหมด 30 นาที เพียง 3 ขั้นตอน ในมาตรฐาน dot blot hybridization โดยทั่วไปที่เกี่ยวข้องกับการวิธีการบ่มค้างคืน วิธีการอย่างรวดเร็วของเรา แสดงให้เห็นว่า ถ้าแบคทีเรียจะใช้มากกว่า PCR ที่สร้างขึ้นด้วยแล้วสั้นกว่าวิเคราะห์เวลาจะเพียงพอที่จะสร้างสัญญาณที่มีเสถียรภาพให้ประมาณ 24to 36 พับลดเวลาในกระบวนการ ( จากประมาณ 12 – 18h เพื่อ 40min ) ความสำเร็จของวิธี dot blot อย่างรวดเร็วเป็นวิกฤตขึ้นอยู่กับลักษณะการสอบสวน ซึ่งวิธีการออกแบบโดยการใช้ลำดับยีนของ 11 ชนิด uropathogenic เพื่อค้นหาตัวแปรภูมิภาคที่มีลำดับลายเซ็นสี่ uropathogens : E . coli , หน้ามิราบิลิส , P . aeruginosa , และ K . oxytoca . จึงถูกเลือกที่มีอย่างน้อย wve ความไม่ต่อ 20bp ภูมิภาคในแต่ละลำดับ nontarget . wve จึงมีน้อยกว่าความไม่ต่อ 20bp เขตไม่ถือว่าแข็งแกร่ง เนื่องจากพวกเขาให้ผลผลลัพธ์ false-positive และดังนั้นพวกเขาออกแบบใหม่ ( ข้อมูลไม่แสดง )ฟิวส์กับความไม่ตั้งอยู่ในศูนย์กลางของลำดับได้ speciwcity มากกว่า ) กับความไม่กระจุกที่ปลาย ระดับของ mismatching ลำดับคือ suycient ขอรับ speciwcity เป้าหมายไม่เพียง แต่ที่ 55 องศา C แต่ใน
มากน้อยเงื่อนไขที่เข้มงวดของลูกผสมที่อุณหภูมิห้อง วิธี dot blot การทดลองข้อมูลเกี่ยวกับการออกแบบโพรบจลนศาสตร์และการพึ่งพาอุณหภูมิของลูกผสมโดยใช้เทคนิคที่มีชื่อเสียง เราตรวจสอบว่าผลลัพธ์ของ dot blot hybridization อย่างรวดเร็ว การศึกษาอาจนำไปใช้กับนิยายเซนเซอร์ทางเคมีไฟฟ้าแพลตฟอร์ม มีความสนใจอย่างมากในการพัฒนาดีเอ็นเอไบโอเซนเซอร์ที่สามารถตรวจจับเหตุการณ์ชนิดกรดนิวคลีอิกโดยไม่ต้องเป้าหมาย ampliwcation [ 8,20 ]เซนเซอร์ทางเคมีไฟฟ้าให้ทันทีและเชิงรุกของกรดนิวคลีอิกไฮบริ ซึ่งเป็นประโยชน์อย่างมากสำหรับจุลชีววิทยาทางคลินิกและการวินิจฉัยทางพันธุกรรม กลยุทธ์วิธีการเซ็นเซอร์รวมจากสาขาวิชาที่หลากหลาย รวมถึง รองรับชิ้นงานขนาดเล็ก เทคโนโลยี อย่างควอนตัมดอต ( แซม DNA / RNA probes ) รุ่น และ ampliwcation สัญญาณเอนไซม์แซมให้ตรึงโมเลกุลทางชีวภาพ เช่น streptavidin บน microfabricated อุปกรณ์ให้
functionalization พื้นผิว