Materials and methodsTissue prepara

Materials and methods
Tissue preparation. Healthy, pigmented, adult guinea pigs of both sexes with intact Preyer’s reflex were anesthetized and subsequently killed by inhalation of 100% CO2. The cochleae were opened and the bony walls were micromechanically removed as described previously in detail [14]. The stria vascularis of each cochlear turn was transferred to a cell-tak (BD Biosciences, Bedford, USA) coated coverslip in a culture dish (35 mm diameter; Nalge Nunc International, Denmark). With the culture dish on an inverted microscope, explant debris of non-strial tissue was removed.

In addition to stria vascularis, a tissue sample from the guinea pig kidney, containing cortical and medullary tissue, which means that the cells comprise mostly proximal tubule epithelia because of their large abundance, was taken and stored at −80 °C. Furthermore, distal colon was excised, opened along the mesenteric insertion, and rinsed with Ringer’s solution. Submucosal tissue was removed by stripping [15], leaving epithelium and lamina propria intact. These samples were also stored at −80 °C before Western blot analysis.

Immunofluorescence microscopy. For fluorescent imaging of tight junction proteins, tissues were stained according to the following protocol (if not stated otherwise, the preparations were performed at 37 °C).

After mounting on coverslips, the tissues were washed twice with phosphate-buffered saline (PBS) and then fixed with methanol at −20 °C for 15 min. After washing them again with PBS, the tissues were permeabilized with 0.5% Triton X-100 for 10 min at room temperature. To block non-specific binding sites, tissues were then bathed in PBS containing 0.5% (v/v) goat serum (blocking solution) for 10 min at room temperature. All following washing procedures were performed with this blocking solution. Antibodies (Zymed Laboratories, San Francisco, USA) used for immunostaining included: claudin-1 to -3 polyclonal antibodies, claudin-4 monoclonal antibody, and anti-human occludin monoclonal or polyclonal antibodies, respectively (all were diluted 1:50 in blocking solution). For claudin-staining, the tissues were incubated for 60 min and, after two washes, tissues were incubated with antibodies against occludin for 30 min. After two additional washes, cells were incubated with Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (Molecular Probes, USA, diluted 1:500 in blocking solution) for 30 min and washed twice before incubating with Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (Molecular Probes, USA, diluted 1:500 in blocking solution) for another 30 min. After two washes the nuclei were stained with the DNA-specific fluorochrome 4′,6′-diamidino-2′-phenylindoladihydrochloride (DAPI, Boehringer Mannheim, Germany), diluted according to the manufacturer’s instructions, for 30 min, and washed again before mounting in ProTags MountFluor (Biocyc, Luckenwalde, Germany). Fluorescence images were obtained with a confocal laser scanning microscope (LSM510, Carl Zeiss Jena GmbH, Jena, Germany).

Western blot analysis. Tissues were homogenized by douncing in iced lysate buffer containing 20 mmol/L Tris, pH 7.4, 5 mmol/L MgCl2, 1 mmol/L EDTA, 0.3 mmol/L ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid, 1 μL/mL aprotinin, 16 μg/mL benzamidine HCl, 10 μg/mL phenanthroline, 10 μg/mL leupeptin, 10 μg/mL pepstatin, 1 mmol phenylmethylsulfonyl fluoride, 210 μg/mL sodium fluoride, 2.16 mg/mL β-glycerophosphate, 18.5 μg/mL NaVO4, and 1 μl/mL trypsin inhibitor (all substances obtained from Sigma Chemical, St. Louis, MO). Membrane fractions were obtained by freeze–thaw cycles and subsequent passage through a 26 G × 1/2-in. needle. To remove insoluble material, the extract was centrifuged at 200g for 5 min at 4 °C. The supernatant was then centrifuged at 43,000g for 30 min at 4 °C. The pellet was resuspended in lysate buffer and protein content was determined using BCA Protein assay reagent (Pierce, Rockford, IL) and quantified with a plate reader (Tecan, Austria). Aliquots of 7.5 μg protein of pooled tissues of at least 3 animals were separated by polyacrylamide gel electrophoresis (10%) and transferred to a blotting membrane (NEN Life Science Products, Boston, MA). For detection of claudin-4 with a monoclonal antibody, 10 μg protein was used.

All blots were blocked for 2 h in 5% milk powder and subsequently in 5% bovine serum albumin (at 4 °C) overnight before incubation with primary polyclonal antibodies (claudin-1 to -3 and occludin) or monoclonal primary antibodies (claudin-4). Secondary antibodies were peroxidase-conjugated goat anti-rabbit polyclonal immunoglobulin G (for claudin-4 also a goat anti-mouse monoclonal immunoglobulin G antibody). Chemiluminescence was induced with a Lumi-LightPLUS Western blotting kit (Roche, Mannheim, Germany), detected using LAS-100 imaging system (Fuji, Tokyo, Japan), and analyzed with quantification software (AIDA, Raytest, Berlin, Germany). Because of the little amount of protein from the stria samples, the densitometric analysis was performed only with the western blots shown.

Antibodies were purchased from Zymed Laboratories (San Francisco, CA, USA). Specificity of these antibodies was tested by analyzing tissue samples from colon and kidney of the guinea pigs because the claudins and occludin under investigation are expressed in mammalian kidney [16] and [17] and distal colon (except claudin-2) as well [18].

In addition to stria vascularis, a tissue sample from the guinea pig kidney, containing cortical and medullary tissue, which means that the cells comprise mostly proximal tubule epithelia because of their large abundance, was taken and stored at −80 °C. Furthermore, distal colon was excised, opened along the mesenteric insertion, and rinsed with Ringer’s solution. Submucosal tissue was removed by stripping [15], leaving epithelium and lamina propria intact. These samples were also stored at −80 °C before Western blot analysis.

Immunofluorescence microscopy. For fluorescent imaging of tight junction proteins, tissues were stained according to the following protocol (if not stated otherwise, the preparations were performed at 37 °C).

After mounting on coverslips, the tissues were washed twice with phosphate-buffered saline (PBS) and then fixed with methanol at −20 °C for 15 min. After washing them again with PBS, the tissues were permeabilized with 0.5% Triton X-100 for 10 min at room temperature. To block non-specific binding sites, tissues were then bathed in PBS containing 0.5% (v/v) goat serum (blocking solution) for 10 min at room temperature. All following washing procedures were performed with this blocking solution. Antibodies (Zymed Laboratories, San Francisco, USA) used for immunostaining included: claudin-1 to -3 polyclonal antibodies, claudin-4 monoclonal antibody, and anti-human occludin monoclonal or polyclonal antibodies, respectively (all were diluted 1:50 in blocking solution). For claudin-staining, the tissues were incubated for 60 min and, after two washes, tissues were incubated with antibodies against occludin for 30 min. After two additional washes, cells were incubated with Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (Molecular Probes, USA, diluted 1:500 in blocking solution) for 30 min and washed twice before incubating with Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (Molecular Probes, USA, diluted 1:500 in blocking solution) for another 30 min. After two washes the nuclei were stained with the DNA-specific fluorochrome 4′,6′-diamidino-2′-phenylindoladihydrochloride (DAPI, Boehringer Mannheim, Germany), diluted according to the manufacturer’s instructions, for 30 min, and washed again before mounting in ProTags MountFluor (Biocyc, Luckenwalde, Germany). Fluorescence images were obtained with a confocal laser scanning microscope (LSM510, Carl Zeiss Jena GmbH, Jena, Germany).

Western blot analysis. Tissues were homogenized by douncing in iced lysate buffer containing 20 mmol/L Tris, pH 7.4, 5 mmol/L MgCl2, 1 mmol/L EDTA, 0.3 mmol/L ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid, 1 μL/mL aprotinin, 16 μg/mL benzamidine HCl, 10 μg/mL phenanthroline, 10 μg/mL leupeptin, 10 μg/mL pepstatin, 1 mmol phenylmethylsulfonyl fluoride, 210 μg/mL sodium fluoride, 2.16 mg/mL β-glycerophosphate, 18.5 μg/mL NaVO4, and 1 μl/mL trypsin inhibitor (all substances obtained from Sigma Chemical, St. Louis, MO). Membrane fractions were obtained by freeze–thaw cycles and subsequent passage through a 26 G × 1/2-in. needle. To remove insoluble material, the extract was centrifuged at 200g for 5 min at 4 °C. The supernatant was then centrifuged at 43,000g for 30 min at 4 °C. The pellet was resuspended in lysate buffer and protein content was determined using BCA Protein assay reagent (Pierce, Rockford, IL) and quantified with a plate reader (Tecan, Austria). Aliquots of 7.5 μg protein of pooled tissues of at least 3 animals were separated by polyacrylamide gel electrophoresis (10%) and transferred to a blotting membrane (NEN Life Science Products, Boston, MA). For detection of claudin-4 with a monoclonal antibody, 10 μg protein was used.

All blots were blocked for 2 h in 5% milk powder and subsequently in 5% bovine serum albumin (at 4 °C) overnight before incubation with primary polyclonal antibodies (claudin-1 to -3 and occludin) or monoclonal primary antibodies (claudin-4). Secondary antibodies were peroxidase-conjugated goat anti-rabbit polyclonal immunoglobulin G (for claudin-4 also a goat anti-mouse monoclonal immunoglobulin G antibody). Chemiluminescence was induced with a Lumi-LightPLUS Western blotting kit (Roche, Mannheim, Germany), detected using LAS-100 imaging system (Fuji, Tokyo, Japan), and analyzed with quantification software (AIDA, Raytest, Berlin, Germany). Because of the little amount of protein from the stria samples, the densitometric analysis was performed only with the western blots shown.

Antibodies were purchased from Zymed Laboratories (San Francisco, CA, USA). Specificity of these antibodies was tested by analyzing tissue samples from colon and kidney of the guinea pigs because the claudins and occludin under investigation are expressed in mammalian kidney [16] and [17] and distal colon (except claudin-2) as well [18].

0/5000

จาก: -

เป็น: -

ผลลัพธ์ (ไทย) 1: [สำเนา]

คัดลอก!

วัสดุและวิธีการการเตรียมเนื้อเยื่อ สุขภาพ หมึก ผู้ใหญ่หนูตะเภาของทั้งสองเพศมีสะท้อน Preyer เหมือนเดิมด้วย และตายในเวลาต่อมาจากการหายใจของ 100% CO2 Cochleae ที่เปิด และผนัง bony ได้ micromechanically เอาออกตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ในรายละเอียด [14] Vascularis stria เปิดแต่ละ cochlear ถูกถ่ายโอนไป coverslip เซลล์ตาก (เวลาออก BD กลาสโกว์ สหรัฐอเมริกา) เคลือบจานวัฒนธรรม (เส้นผ่าศูนย์กลาง 35 มม. Nalge Nunc อินเตอร์เนชั่นแนล เดนมาร์ก) กับจานวัฒนธรรมในการกล้องจุลทรรศน์หัวกลับ explant เศษของเนื้อเยื่อไม่ strial ถูกเอาออกนอกจาก stria vascularis ตัวอย่างเนื้อเยื่อไตหนูตะเภา ประกอบด้วยเนื้อแน่น และ medullary เนื้อเยื่อ ซึ่งหมายความ ว่า เซลล์ประกอบด้วยส่วนใหญ่ proximal tubule epithelia เนื่องจากความอุดมสมบูรณ์ขนาดใหญ่ ถูกถ่าย และเก็บไว้ที่ −80 องศาเซลเซียส นอกจากนี้ ลำไส้ใหญ่กระดูก excised เปิดไปตามแทรก mesenteric และ rinsed ด้วยโซลูชันของ Ringer เนื้อเยื่อ submucosal ถูกเอาออก โดยปอก [15], การออก epithelium และ lamina propria เหมือนเดิม ยังได้เก็บตัวอย่างเหล่านี้ที่ −80 ° C ก่อนที่ตะวันตกทำลายวิเคราะห์Immunofluorescence microscopy การ สำหรับภาพเรืองแสงของโปรตีนเชื่อมต่อแน่น เนื้อเยื่อมีสีตามโพรโทคอลต่อไปนี้ (ถ้า ไม่ระบุไว้เป็นอย่างอื่น ดำเนินการจัดเตรียมที่ 37 ° C)หลังจากติดตั้งบน coverslips เนื้อเยื่อถูกล้างสองครั้งกับ buffered ฟอสเฟตน้ำเกลือ (PBS) และคง ด้วยเมธานอ −20 ° C สำหรับ 15 นาทีที่แล้ว หลังจากการซักผ้าให้อีกด้วย PBS เนื้อเยื่อถูก permeabilized 0.5% X ไตรตั้น-100 ใน 10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง บล็อกรวมไม่ใช่เฉพาะไซต์ เนื้อเยื่อได้แล้วอาบน้ำใน PBS ที่ประกอบด้วยเซรั่มครีม 0.5% (v/v) (แก้ปัญหาการบล็อค) ใน 10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง ดำเนินขั้นตอนซักผ้าต่อไปนี้ทั้งหมด ด้วยโซลูชันที่บล็อกนี้ แอนตี้ (ห้องปฏิบัติการ Zymed, San Francisco, USA) ใช้ immunostaining รวม: claudin-1-3 แอนตี้ polyclonal แอนติบอดี monoclonal claudin-4 และบุคคลที่ต่อต้านแอนตี้โมโน หรือ polyclonal, occludin ตามลำดับ (ทั้งหมดถูกแตกออก 1:50 ในบล็อกแก้ปัญหา) Claudin-ย้อมสี เนื้อเยื่อถูก incubated ใน 60 นาที และ หลังสอง washes เนื้อเยื่อถูก incubated กับแอนตี้กับ occludin ใน 30 นาที หลังจากสอง washes เพิ่มเติม เซลล์ถูก incubated กับ Alexa Fluor 488 แพะป้องกันเมาส์ IgG (Probes โมเลกุล สหรัฐอเมริกา 1: 500 แตกออกในการแก้ปัญหาการบล็อค) สำหรับ 30 นาที แล้วล้างสองครั้งก่อนที่ incubating กับ Alexa Fluor 594 กระต่ายป้องกันแพะ IgG (Probes โมเลกุล สหรัฐอเมริกา 1: 500 แตกออกในการแก้ปัญหาการบล็อค) ในอีก 30 นาที หลังจากสอง washes แอลฟามีสีกับดีเอ็นเอเฉพาะ fluorochrome 4′, 6′-diamidino-2′-phenylindoladihydrochloride (DAPI, Boehringer มันน์ไฮม์ ประเทศเยอรมนี), ทำให้เจือจางตามคำแนะนำของผู้ผลิต ใน 30 นาที และล้างอีกครั้งก่อนติดตั้งใน ProTags MountFluor (Biocyc, Luckenwalde เยอรมนี) ภาพ fluorescence ได้รับ ด้วยเลเซอร์ confocal สแกนกล้องจุลทรรศน์ (LSM510, Carl Zeiss Jena GmbH, Jena เยอรมนี)การวิเคราะห์คืนในตาตะวันตก เนื้อเยื่อถูก homogenized เป็นกลุ่ม โดย douncing ในบัฟเฟอร์ lysate เย็นประกอบด้วย 20 mmol/L ตรี pH 7.4, 5 mmol/L MgCl2, 1 mmol/L EDTA, 0.3 mmol/L เอทิลีนเอทิ-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N′, N′ tetraacetic กรด aprotinin μL/mL 1, 16 μg/mL benzamidine HCl, phenanthroline μg/mL 10, leupeptin μg/mL 10, pepstatin μg/mL 10 ฟลูออไรด์ 1 mmol phenylmethylsulfonyl , 210 μg/mL โซเดียมฟลูออไรด์ 2.16 mg/mL β-glycerophosphate, μg 18.5 มล NaVO4 และ μl 1 mL ผลทริปซิน (สารทั้งหมดที่ได้รับจากซิกเคมี St. Louis, MO) เยื่อเศษได้รับ โดยรอบแช่แข็ง – thaw และกาลต่อมาผ่าน G 26 × 1/2-ค่ะเข็ม เอาวัสดุที่ไม่ละลายน้ำ การดึงข้อมูลถูก centrifuged ที่ 200g ใน 5 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส Supernatant ถูก centrifuged แล้วที่ 43,000g ใน 30 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส เม็ดถูก resuspended ในบัฟเฟอร์ lysate และโปรตีนได้กำหนดใช้ BCA โปรตีนรีเอเจนต์ทดสอบ (เพียร์ซ ร็อคฟอร์ด IL) และ quantified กับตัวอ่านแผ่น (Tecan ออสเตรีย) Aliquots 7.5 μg โปรตีนของเนื้อเยื่อรวมสัตว์น้อย 3 ถูกคั่น ด้วย electrophoresis polyacrylamide เจล (10%) และโอนย้ายไปเยื่อ blotting (ผลิตภัณฑ์วิทยาศาสตร์ชีวิตฆราวาส Boston, MA) Claudin-4 กับแอนติบอดี monoclonal ตรวจ มีใช้โปรตีน μg 10All blots were blocked for 2 h in 5% milk powder and subsequently in 5% bovine serum albumin (at 4 °C) overnight before incubation with primary polyclonal antibodies (claudin-1 to -3 and occludin) or monoclonal primary antibodies (claudin-4). Secondary antibodies were peroxidase-conjugated goat anti-rabbit polyclonal immunoglobulin G (for claudin-4 also a goat anti-mouse monoclonal immunoglobulin G antibody). Chemiluminescence was induced with a Lumi-LightPLUS Western blotting kit (Roche, Mannheim, Germany), detected using LAS-100 imaging system (Fuji, Tokyo, Japan), and analyzed with quantification software (AIDA, Raytest, Berlin, Germany). Because of the little amount of protein from the stria samples, the densitometric analysis was performed only with the western blots shown.Antibodies were purchased from Zymed Laboratories (San Francisco, CA, USA). Specificity of these antibodies was tested by analyzing tissue samples from colon and kidney of the guinea pigs because the claudins and occludin under investigation are expressed in mammalian kidney [16] and [17] and distal colon (except claudin-2) as well [18].

การแปล กรุณารอสักครู่..

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:[สำเนา]

คัดลอก!

วัสดุและวิธีการเตรียมเนื้อเยื่อ สุขภาพ, สี, หนูตะเภาผู้ใหญ่ของทั้งสองเพศมีสะท้อน Preyer เหมือนเดิมได้รับการดมยาสลบและถูกฆ่าตายภายหลังจากการสูดดมก๊าซ CO2 100% อวัยวะรับเสียงเปิดและผนังกระดูกถูกถอดออก micromechanically ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ในรายละเอียด [14] stria vascularis ของแต่ละเปิดประสาทหูถูกย้ายไปยังเซลล์ตาก (BD ชีววิทยาศาสตร์, ฟอร์ดสหรัฐอเมริกา) coverslip เคลือบในจานวัฒนธรรม (35 มิลลิเมตรเส้นผ่าศูนย์กลาง; Nalge Nunc ระหว่างประเทศเดนมาร์ก) ด้วยจานวัฒนธรรมบนกล้องจุลทรรศน์คว่ำเศษชิ้นส่วนของเนื้อเยื่อที่ไม่ strial ถูกลบออก. นอกจาก stria vascularis ตัวอย่างเนื้อเยื่อจากไตหนูตะเภาที่มีเนื้อเยื่อเยื่อหุ้มสมองและไขสันหลังซึ่งหมายความว่าเซลล์ประกอบด้วย epithelia ท่อใกล้เคียงส่วนใหญ่ เพราะความอุดมสมบูรณ์ของพวกเขาที่มีขนาดใหญ่ถูกนำตัวและเก็บไว้ที่ -80 องศาเซลเซียส นอกจากลำไส้ใหญ่ส่วนปลายถูกตัดเปิดพร้อมแทรก mesenteric และล้างด้วยวิธีการแก้ปัญหาของ Ringer เนื้อเยื่อ submucosal ถูกลบออกโดยการลอก [15] ออกจากเยื่อบุผิวและบาง propria เหมือนเดิม ตัวอย่างเหล่านี้ยังถูกเก็บไว้ที่ -80 องศาเซลเซียสก่อนที่จะวิเคราะห์ดวงตะวัน. กล้องจุลทรรศน์อิมมูโน สำหรับการถ่ายภาพเรืองแสงของโปรตีนชุมแน่นเนื้อเยื่อมีการย้อมตามโปรโตคอลดังต่อไปนี้ (ถ้าไม่อย่างนั้นการเตรียมการดำเนินการที่ 37 ° C). หลังจากที่ติดตั้งบน coverslips เนื้อเยื่อถูกล้างครั้งที่สองด้วยน้ำเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (พีบีเอส) และคงแล้วกับเมทานอลที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 15 นาที หลังจากล้างพวกเขาอีกครั้งกับพีบีเอสเนื้อเยื่อที่ถูก permeabilized 0.5% Triton X-100 เป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง เพื่อป้องกันไม่เฉพาะเจาะจงเว็บไซต์ผูกพันเนื้อเยื่อถูกอาบน้ำแล้วในพีบีเอสที่มี 0.5% (v / v) ซีรั่มแพะ (วิธีการแก้ปัญหาการปิดกั้น) เป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง ทุกขั้นตอนการซักผ้าต่อไปนี้ได้ดำเนินการปิดกั้นกับการแก้ปัญหานี้ แอนติบอดี (Zymed ห้องปฏิบัติการ, San Francisco, USA) ใช้สำหรับ immunostaining รวม: claudin-1 เพื่อ -3 แอนติบอดีโพลี, claudin-4 โมโนโคลนอลแอนติบอดีและโมโนโคลนอล occludin ต่อต้านมนุษย์หรือแอนติบอดีโพลีตามลำดับ (ทั้งหมดถูกเจือจาง 1:50 ในการป้องกัน วิธีการแก้). สำหรับ claudin ย้อมสีเนื้อเยื่อที่ถูกบ่มเป็นเวลา 60 นาทีและหลังจากสองล้างเนื้อเยื่อถูกบ่มกับแอนติบอดีต่อ occludin เป็นเวลา 30 นาที หลังจากที่ทั้งสองล้างเพิ่มเติมเซลล์ถูกบ่มกับ Alexa Fluor 488 แพะ IgG ต่อต้านเมาส์ (Probes โมเลกุลสหรัฐอเมริกาเจือจาง 1: 500 ในการแก้ปัญหาการปิดกั้น) เป็นเวลา 30 นาทีและล้างสองครั้งก่อนที่บ่มกับ Alexa Fluor 594 แพะ IgG ต่อต้านกระต่าย (โมเลกุล พร็อบ, อเมริกา, เจือจาง 1: 500 ในการแก้ปัญหาการปิดกั้น) อีก 30 นาที หลังจากที่ทั้งสองล้างนิวเคลียสมีการย้อมด้วยสารเรืองแสงเป็นดีเอ็นเอเฉพาะ 4 ', 6'-diamidino-2'-phenylindoladihydrochloride (DAPI, Boehringer Mannheim, เยอรมนี) ปรับลดตามคำแนะนำของผู้ผลิตเป็นเวลา 30 นาทีและล้างอีกครั้งก่อนการติดตั้ง ใน ProTags MountFluor (Biocyc, Luckenwalde, เยอรมนี) ภาพเรืองแสงที่ได้รับด้วยกล้องจุลทรรศน์ confocal เลเซอร์สแกน (LSM510, Carl Zeiss Jena GmbH, เจ, เยอรมนี). เวสเทิร์วิเคราะห์ blot เนื้อเยื่อที่ถูกปั่นโดย douncing ในบัฟเฟอร์ lysate เย็นที่มี 20 มิลลิโมล / ลิตรทริสพีเอช 7.4, 5 มิลลิโมล / ลิตร MgCl2 1 มิลลิโมล EDTA / L 0.3 มิลลิโมล / ลิตรเอทิลีนไกลคอลทวิ (อีเทอร์β-aminoethyl) -N, N, N 'กรด n' tetraacetic 1 ไมโครลิตร / มิลลิลิตร Aprotinin 16 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร benzamidine HCl 10 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร Phenanthroline 10 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร leupeptin 10 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร pepstatin 1 มิลลิโมลฟลูออไร phenylmethylsulfonyl 210 ไมโครกรัม / มิลลิลิตรโซเดียม ฟลูออไร 2.16 มิลลิกรัม / มิลลิลิตรβ-glycerophosphate 18.5 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร NaVO4 และ 1 ไมโครลิตร / มิลลิลิตรยับยั้ง trypsin (สารทั้งหมดที่ได้รับจากซิกเคมีเซนต์หลุยส์) เศษส่วนเมมเบรนที่ได้รับโดยรอบแช่แข็งละลายและต่อมาทางผ่าน 26 × G 02/01 ใน เข็ม. ในการลบวัสดุที่ไม่ละลายน้ำสารสกัดที่ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 200 กรัมเป็นเวลา 5 นาทีที่ 4 ° C สารละลายได้ปั่นแล้วที่ 43,000g เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส เม็ดที่ถูก resuspended ในบัฟเฟอร์ lysate และปริมาณโปรตีนที่ถูกกำหนดโดยใช้น้ำยาทดสอบโปรตีน BCA (เพียร์ซ, ฟอร์ด, IL) และปริมาณกับผู้อ่านแผ่น (Tecan, ออสเตรีย) aliquots 7.5 ไมโครกรัมโปรตีนของเนื้อเยื่อสำรองอย่างน้อย 3 สัตว์ที่ถูกแยกจากกันโดยข่าวคราวอะคริเลต (10%) และโอนไปยังเมมเบรนซับ (ที่ NEN ชีวิตผลิตภัณฑ์วิทยาศาสตร์, บอสตัน) สำหรับการตรวจสอบของ claudin-4 ที่มีแอนติบอดี 10 ไมโครกรัมโปรตีนถูกนำมาใช้. ทั้งหมด blots ถูกบล็อกเป็นเวลา 2 ชั่วโมงใน 5% นมผงและต่อมาใน 5% โปรตีนชนิดหนึ่งในซีรั่มวัว (ที่ 4 ° C) ในชั่วข้ามคืนก่อนที่จะบ่มกับแอนติบอดีโพลีหลัก (claudin-1 เพื่อ -3 และ occludin) หรือแอนติบอดีหลักโมโนโคลนอล (claudin-4) แอนติบอดีรองได้ peroxidase-ผันแพะต่อต้านกระต่ายโพลีอิมมูโน G (สำหรับ claudin-4 ยังเป็นโมโนโคลนอลแพะป้องกันเมาส์อิมมูโนแอนติบอดี G) chemiluminescence ถูกชักนำด้วย Lumi-LIGHTPLUS ตะวันตกชุดซับ (โรชไฮม์, เยอรมนี) ตรวจพบการใช้ระบบการถ่ายภาพ LAS-100 (ฟูจิโตเกียวประเทศญี่ปุ่น) และการวิเคราะห์ด้วยซอฟต์แวร์ปริมาณ (AIDA, Raytest, เบอร์ลิน, เยอรมนี) เพราะจำนวนเงินที่เล็ก ๆ น้อย ๆ ของโปรตีนจากตัวอย่าง stria การวิเคราะห์ densitometric ได้ดำเนินการเฉพาะกับ blots ตะวันตกแสดง. แอนติบอดีที่ซื้อมาจาก Zymed ห้องปฏิบัติการ (San Francisco, CA, USA) ความจำเพาะของแอนติบอดีเหล่านี้ได้รับการทดสอบโดยการวิเคราะห์ตัวอย่างเนื้อเยื่อจากลำไส้และไตของหนูตะเภาเพราะ claudins และ occludin ภายใต้การสอบสวนจะแสดงในไตเลี้ยงลูกด้วยนม [16] และ [17] และลำไส้ใหญ่ส่วนปลาย (ยกเว้น claudin-2) รวม [18 ]

การแปล กรุณารอสักครู่..

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:[สำเนา]

คัดลอก!

วัสดุและวิธีการเตรียมทิชชู สุขภาพ , สี , ผู้ใหญ่หนูตะเภาทั้งสองเพศด้วยการสะท้อนเหมือนเดิมเพรย์เออร์ถูกวางยาสลบและถูกฆ่าโดยการสูดดม CO2 100% การ cochleae ถูกเปิดผนังกระดูกถูก micromechanically ลบออกตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ในรายละเอียด [ 14 ] vascularis Stria แต่ละ cochlear เปิดไปเป็นเซลล์ตาก ( BD ชีววิทยาเบดฟอร์ด , USA ) เคลือบปิดสไลด์ในวัฒนธรรมอาหาร ( 35 มม. เส้นผ่าศูนย์กลาง nalge ขณะนี้นานาชาติ , เดนมาร์ก ) กับวัฒนธรรมอาหารกลับต่อกล้องจุลทรรศน์ เศษเนื้อเยื่ออุตสาหกรรม สมบูรณ์ ไม่ก็เอาออก

นอกจากแถบ vascularis , ตัวอย่างเนื้อเยื่อจากหนูทดลอง ไต และเนื้อเยื่อที่มีคอร์เมดัลลารี ,ซึ่งหมายความว่าเซลล์ประกอบด้วยรอยต่อท่อ เพราะส่วนใหญ่มีความอุดมสมบูรณ์มากของพวกเขาถูกเก็บไว้ที่− 80 องศา นอกจากนี้ส่วนปลายลำไส้ใหญ่ถูกตัดเปิดพร้อมแทรกแล้ว และล้างด้วยเสียงของโซลูชั่น submucosal เนื้อเยื่อออกด้วย [ 15 ] ลอกจากเยื่อบุผิวและใบกล้ามเนื้อเหมือนเดิมตัวอย่างเหล่านี้ได้ถูกเก็บไว้ที่− 80 ° C ก่อนการวิเคราะห์ Western blot

วิธีกล้องจุลทรรศน์ . สำหรับภาพเรืองแสงของโปรตีนชุมทางคับ เนื้อเยื่อถูกย้อมสีตามขั้นตอนต่อไปนี้ ( ถ้าไม่ระบุเป็นอย่างอื่น การเตรียมการ ที่ 37 ° C )

coverslips หลังจากติดตั้งบน ,เนื้อเยื่อถูกล้างสองครั้งกับฟอสเฟตในน้ำเกลือ ( PBS ) แล้วแก้ไขด้วยเมทานอลเท่ากับ− 20 °องศาเซลเซียสเป็นเวลา 15 นาที หลังจากล้างอีกครั้งโดยพีบีเอส เนื้อเยื่อถูก permeabilized กับ 0.5% Triton X-100 เป็นเวลา 10 นาที ที่อุณหภูมิห้อง บล็อกชนิดเต็มเปี่ยม กระดาษทิชชู่ แล้วอาบน้ำใน PBS ที่มี 0.5% ( v / v ) เซรั่มเนื้อแพะ ( บล็อกโซลูชั่น ) สำหรับ 10 นาทีที่อุณหภูมิห้องทั้งหมดต่อไปนี้ขั้นตอนการซักผ้าได้ด้วยบล็อกนี่ โซลูชั่น แอนติบอดี ( zymed ห้องปฏิบัติการ , ซานฟรานซิสโก , สหรัฐอเมริกา ) ใช้สำหรับ immunostaining รวม : claudin-1 - 3 แอนติบอดีโพลี claudin-4 , โมโนโคลนอลแอนติบอดีและโมโนโคลนอลแอนติบอดีต่อต้าน occludin มนุษย์หรือโพลี ตามลำดับ ( ลด 50 ในการปิดกั้นแก้ปัญหา ) สำหรับ claudin การย้อมสีเนื้อเยื่อถูกบ่มเป็นเวลา 60 นาที และหลังจากสองล้างเนื้อเยื่อถูกบ่มกับแอนติบอดีต่อ occludin เป็นเวลา 30 นาที หลังจากเพิ่มสองล้างเซลล์ถูกบ่มกับ Alexa Fluor 488 แพะ IgG anti เมาส์ ( ฟิวส์ โมเลกุลเจือจาง 1 : 500 สหรัฐอเมริกา , ในบล็อก โซลูชั่น ) สำหรับ 30 นาทีและล้างสองครั้งก่อน เพาะกับ Alexa Fluor พี่แพะ IgG anti กระต่าย ( วัดโมเลกุล , สหรัฐอเมริกาเจือจาง 1 : 500 ในบล็อกโซลูชั่น ) อีก 30 นาทีหลังจากสองตัวนิวเคลียสถูกย้อมด้วยดีเอ็นเอที่เฉพาะเจาะจงได้รับฟลู โรโครม 4 6 - diamidino-2 ’’ - phenylindoladihydrochloride ( dapi , Boehringer Mannheim , เยอรมัน ) , เจือจางตามคําแนะนําของผู้ผลิตเป็นเวลา 30 นาที แล้วล้างอีกครั้ง ก่อนที่จะติดตั้งใน protags ( biocyc mountfluor , ลุคเค่นไวลด์ , เยอรมัน )ภาพเรืองแสงได้ด้วยเลเซอร์ ด้วยกล้องจุลทรรศน์ ( lsm510 , Carl Zeiss Jena GmbH , เยนา , เยอรมนี )

Western blot การวิเคราะห์ . เนื้อเยื่อที่เป็นโฮโม โดย douncing ในเย็น lysate บัฟเฟอร์ที่มี 20 mmol / L อย่างไรก็ตามที่ pH 7.4 , 5 mmol / L ชุด 1 มิลลิโมล / ลิตร EDTA , 0.3 มิลลิโมล / ลิตร เอทิลีนไกลคอล ทวิ ( บีตา - aminoethyl ether ) - N , N , N ’ n ’ - tetraacetic กรด 1 μ L / ml โพรทินิน ,

การแปล กรุณารอสักครู่..

ภาษาอื่น ๆ

การสนับสนุนเครื่องมือแปลภาษา: กรีก, กันนาดา, กาลิเชียน, คลิงออน, คอร์สิกา, คาซัค, คาตาลัน, คินยารวันดา, คีร์กิซ, คุชราต, จอร์เจีย, จีน, จีนดั้งเดิม, ชวา, ชิเชวา, ซามัว, ซีบัวโน, ซุนดา, ซูลู, ญี่ปุ่น, ดัตช์, ตรวจหาภาษา, ตุรกี, ทมิฬ, ทาจิก, ทาทาร์, นอร์เวย์, บอสเนีย, บัลแกเรีย, บาสก์, ปัญจาป, ฝรั่งเศส, พาชตู, ฟริเชียน, ฟินแลนด์, ฟิลิปปินส์, ภาษาอินโดนีเซี, มองโกเลีย, มัลทีส, มาซีโดเนีย, มาราฐี, มาลากาซี, มาลายาลัม, มาเลย์, ม้ง, ยิดดิช, ยูเครน, รัสเซีย, ละติน, ลักเซมเบิร์ก, ลัตเวีย, ลาว, ลิทัวเนีย, สวาฮิลี, สวีเดน, สิงหล, สินธี, สเปน, สโลวัก, สโลวีเนีย, อังกฤษ, อัมฮาริก, อาร์เซอร์ไบจัน, อาร์เมเนีย, อาหรับ, อิกโบ, อิตาลี, อุยกูร์, อุสเบกิสถาน, อูรดู, ฮังการี, ฮัวซา, ฮาวาย, ฮินดี, ฮีบรู, เกลิกสกอต, เกาหลี, เขมร, เคิร์ด, เช็ก, เซอร์เบียน, เซโซโท, เดนมาร์ก, เตลูกู, เติร์กเมน, เนปาล, เบงกอล, เบลารุส, เปอร์เซีย, เมารี, เมียนมา (พม่า), เยอรมัน, เวลส์, เวียดนาม, เอสเปอแรนโต, เอสโทเนีย, เฮติครีโอล, แอฟริกา, แอลเบเนีย, โคซา, โครเอเชีย, โชนา, โซมาลี, โปรตุเกส, โปแลนด์, โยรูบา, โรมาเนีย, โอเดีย (โอริยา), ไทย, ไอซ์แลนด์, ไอร์แลนด์, การแปลภาษา.